长双歧杆菌及其应用以及功能食品组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种长双歧杆菌（Bifidobacterium?longum），其特征在于，所述长双歧杆菌的保藏编号为CGMCC?No.6273。本发明还提供了一种功能食品组合物及其制备方法，包括：将如上所述的长双歧杆菌的活菌体灭活，得到菌体物质。本发明还提供了一种功能食品组合物，所述功能食品组合物含有如上所述的长双歧杆菌的活菌体。本发明还提供了如上所述的长双歧杆菌在制备延缓衰老的功能食品组合物中的应用。本发明提供的长双歧杆菌的活菌体及灭活后的菌体物质均具有延缓衰老的功效。
【专利说明】长双歧杆菌及其应用以及功能食品组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)及其应用以及功能食品 组合物及其制备方法，具体地，涉及一种长双歧杆菌，含有该长双歧杆菌的功能食品组合物 及其制备方法，以及该长双歧杆菌在制备延缓衰老的功能食品组合物中的应用。
【背景技术】
[0002] 衰老是机体组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性变化（Turnheim，2003)，是 机体各种生化反应的综合表现。经济的快速发展，科学技术的进步，使发达国家和一些发 展中国家步入了老龄化社会。人口老龄化问题已经成为了全球性的社会问题。截至2009 年底，中国60岁及以上的老年人口达1. 6714亿，占总人口的12. 5%，预计到2020年将达到 2. 43亿。随着年龄的增长及机体的衰老，与衰老相关的疾病，如心血管、神经系统疾病、肿 瘤、糖尿病等，威胁着人类的寿命和生活质量。因此，越来越多的研究专注于寻找具有抗衰 老作用的物质并研究其抗衰老机理。目前多种天然产物已经被证实具有抗衰老作用。但是 目前认为的具有抗衰老作用的物质来源较为单一，分离纯化成本高，具有抗衰老作用的药 物又具有一定的副作用，从而限制了这些物质的大范围应用。益生菌安全性较高，分离纯化 成本低，如果能够明确益生菌的抗衰老功能，并确定其抗衰老机制，将益生菌作为抗衰老产 品的前景将十分广阔。
[0003] 双歧杆菌是1899年由法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌 氧的革兰氏阳性杆菌。目前已经证实双歧杆菌或发酵产物具有多种抗氧化能力，主要表现 为清除氧自由基、清除DPPH自由基、清除羟自由基，可以抗脂质过氧化，具有铁离子还原 力、亚铁离子螯合能力。双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用及其机制的初步探讨(彭艳 华等，硕士，重庆医科大学，2008)首次在细胞水平研究了益生菌抗衰老功能。分离纯化两歧 双歧杆菌脂磷壁酸（LTA)后，利用人胚肺成纤维细胞研究了 LTA的抗衰老作用。结果显示， 双歧杆菌LTA可以显著延长细胞分裂次数，增强细胞活力，延缓细胞衰老表征。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种具有延缓衰老功能的双歧杆菌。
[0005] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)，其中，所述长双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No. 6273。
[0006] 第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，所述方法包括：将如上 所述的长双歧杆菌的活菌体灭活，得到菌体物质。
[0007] 第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合物。
[0008] 第四方面，本发明提供了一种功能食品组合物，其中，所述功能食品组合物含有如 上所述的长双歧杆菌的活菌体。
[0009] 第五方面，本发明提供了如上所述的长双歧杆菌在制备延缓衰老的功能食品组合 物中的应用。
[0010] 本发明提供的长双歧杆菌的活菌体及灭活后的菌体物质均具有延缓衰老的功效。
[0011] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0012] 生物保藏
[0013] 本发明的长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)，于2012年6月25日被保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No.6273。
【具体实施方式】
[0014] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0015] 一方面，本发明提供了一种长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)，其中，该长双 歧杆菌的保藏编号为CGMCC No. 6273。
[0016] 本发明的长双歧杆菌分离自广西巴马县长寿老人的粪便。
[0017] 本发明提供的长双歧杆菌经过培养能够产生大量长双歧杆菌的活菌体，所述培养 的方法没有特别的要求，只要是能使所述长双歧杆菌增殖即可，例如可以将1〇 7数量级的活 菌体接种于双歧杆菌培养基中，并且在厌氧条件下，在15_38°C的温度下培养8-72小时后， 得到培养液。所述双歧杆菌培养基可以为公知的各种适合双歧杆菌培养的培养基，例如可 以为乳汁和/或《乳酸菌--生物学基础及应用》（杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版）中 所述的乳酸菌（MRS)培养基。
[0018] 本发明可以进一步分离上述培养液中的长双歧杆菌的活菌体，所述分离的方法没 有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法 实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
[0019] 第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，所述方法包括：将如上 所述的长双歧杆菌的活菌体灭活，得到菌体物质。
[0020] 本发明的发明人在研究中意外发现，将本发明的长双歧杆菌在60-90°C下灭活 0. 3-2h，优选在65-85°C下灭活0. 5-1. 5h后得到的菌体物质，具有更加显著的延缓衰老的 功效。因此，灭活的条件优选包括：温度为65-85°C，时间为0. 5-1. 5h。
[0021] 本发明的方法还包括将菌体物质添加到食物中。
[0022] 根据本发明，尽管将菌体物质添加到食物中，即可实现本发明的目的，即起到延 缓衰老的作用，但优选情况下，以功能食品组合物的总重量为基准，菌体物质的添加量为 10-70重量％,进一步优选为30-50重量％。在上述优选情况下,所述功能食品组合物的延缓 衰老的作用更显著。
[0023] 本发明中，食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食物也 可以根据食用对象的不同而有所不同。所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加剂， 例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。
[0024] 第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合物。
[0025] 第四方面，本发明提供了一种功能食品组合物，其中，所述功能食品组合物含有如 上所述的长双歧杆菌的活菌体。
[0026] 根据本发明，尽管功能食品组合物含有如上所述的长双歧杆菌的活菌体，即可实 现本发明的目的，即起到延缓衰老的作用。但优选情况下，以功能食品组合物的总重量为基 准，长双歧杆菌的活菌体的含量为10 5-101(lCFU/g，进一步优选为107-109CFU/g。在上述优选 情况下，所述功能食品组合物的延缓衰老的作用更显著。CFU (Colony-Forming Units,菌 落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培 养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表示活菌的数量。
[0027] 符合上述要求的功能食品组合物可以包括长双歧杆菌的培养液(例如经该长双歧 杆菌发酵制得的发酵乳制品)、分离的长双歧杆菌的活菌体等。
[0028] 本发明中，功能食品组合物还含有食物，食物如前所述，在此不再赘述。
[0029] 第五方面，本发明提供了如上所述的长双歧杆菌在制备延缓衰老的功能食品组合 物中的应用。
[0030] 实施例
[0031] 以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0032] (-）采用线虫作为受试对象
[0033] 线虫是在发育、凋亡、衰老领域研究最为清晰的模式生物，其生命周期短，并且对 外界环境敏感，而且由于衰老信号的同源性高，低等生物的研究对哺乳动物及人体衰老有 直接的参考（Greer and Brunet, 2008)。因此，在以下实施例和对比例中采用线虫作为受试 对象。
[0034] 在下述实施例和对比例中：
[0035] 线虫为秀丽隐杆线虫虫株，野生型Caenorhabditis elegans N2,购自美国线虫遗 传学中心（Caenorhabditis Genetics Center (CGC))。
[0036] 菌种：线虫标准食物大肠杆菌（E. coli)0P50,购自美国线虫遗传学中心；长双歧 杆菌为本发明的长双歧杆菌(该菌株于2012年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6273)。
[0037] 线虫基本操作方法参考Wormbook标准线虫培养方法进行。
[0038] 1M 磷酸钾缓冲液（ρΗ6· 0) :108. 3g ΚΗ2Ρ04,46 · 8g Κ2ΗΡ04 · 3H20,蒸馏水定容至 1L， 121°C灭菌15min备用。
[0039] NGM培养基：3. Og NaCl，20g琼脂粉，2. 5g细菌蛋白胨，加入蒸馏水970mL，121°C灭 菌15min，置于60°C水浴，无菌条件下加入以下成分：lmLlM MgS04，lmLlM CaCl2,25mLlM磷 酸钾缓冲液，3. 2mL5mg/mL胆固醇的乙醇溶液；混匀后，倾倒平板。待平板凝固后，置于室温 2天，挥发水分及检查平板无杂菌污染后置于4°C密封箱内保存备用。
[0040] mNGM培养基：NGM培养基倾注平板之前在无菌条件下加入经过滤除菌的FUdR、羧 苄青霉素至终浓度分别为50 μ M、0. 5mM，混匀倾注平板，凝固后置于室温2天挥发水分，之 后平板可涂菌使用或置于4°C密封箱内保存，于1个月内使用完毕。
[0041] M9 缓冲液：3g ΚΗ2Ρ04,15. 12g Na2HP04 ·12Η20,58 NaCl，加蒸馏水定容至 1L，121°C 灭菌15min，冷却至室温后无菌加入lmLIM的MgS04，混勻备用。
[0042] 线虫裂解液：lmL8M的NaOH，0. 6mL9%的次氯酸钠溶液，3. 4mL无菌ddH20，混匀后使 用，现用现配。
[0043] LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCllOg (固体培养基加入15g琼脂)，加 入950mL蒸馈水，调节pH至7. 0,121°C灭菌15min备用。
[0044] MRS培养基：购于北京陆桥公司。
[0045] 实施例1. 1
[0046] 本实施例用于说明本发明的长双歧杆菌延缓衰老的功效。
[0047] (1)将大肠杆菌0P50以1%的接种量接种至LB液体培养基，于恒温摇床 37°C 220rpm振荡培养8h至对数末期，得到大肠杆菌0P50培养液；将长双歧杆菌以1%的接 种量接种至MRS液体培养基，于充氮厌氧瓶37°C培养12h至对数末期，得到长双歧杆菌培养 液。
[0048] 分别将上述大肠杆菌0P50和长双歧杆菌的培养液，以4000 X g离心15min收集菌 体，用M9缓冲液重复离心洗涤两次，之后4°C 16000 X g离心15min，去掉全部上清液，称量 菌体湿重。将菌体以一定量的M9缓冲液重悬，使菌体终浓度为400mg/mL，分装于1. 5mL离 心管，作为浓缩菌体。
[0049] 分别将上述两种浓缩菌体在75°C热灭活lh，冷却后将大肠杆菌0P50和长双歧杆 菌按3:2的重量比（即长双歧杆菌为40重量％)混合得到混合物，将混合物按照400mg/mL 的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于直径60mm的mNGM平板表面，使每平板菌体量为10mg，共 6块平板，4 °C密封保存备用。
[0050] (2)在直径90mm的NGM培养基表面，均匀涂布200 μ L大肠杆菌0P50培养液，37°C 培养l〇h，作为线虫传代用平板，4°C密封保存备用。
[0051] 在无菌条件下，用手术刀从生长有线虫的NGM平板上切取约lcmX lcm的小块培养 基，正面向下扣在线虫传代用平板上，置于25°C培养，60mm平皿一般7天传代一次，保持线 虫活性。
[0052] 取传代后成虫大多处于产卵期的平板用于线虫同期化：
[0053] 向平板中加入2mL M9缓冲液，用无菌吸管吹打，尽量冲下平板上的虫体，将虫体转 移至1. 5mL离心管，800Xg离心lmin，弃上清收集虫体，加入lmL M9缓冲液再次离心洗涤 虫体，尽量吸尽上清。
[0054] 加入lmL新鲜的线虫裂解液，立刻漩润振荡10s，800 Xg离心lmin，移液器吸走上 清。
[0055] 立刻加入lmL M9缓冲液洗涤虫体，800Xg离心lmin，连续两次，去除残留裂解液。 最后管内剩余约1〇〇 μ L含有虫卵的M9悬浊液。
[0056] 使用无菌吸管将虫卵滴加于涂布0Ρ50的NGM平板，25°C培养48h，得到同期化48h 的线虫。
[0057] (3)将同期化48h的线虫，置于体视显微镜观察，使用钼金铲挑取生殖口为透明半 月形的L4期雌雄同体虫于步骤（1)得到的mNGM平板上，每块平板挑取10只，平板置于25°C 培养。每天观察线虫生存状况，如虫体对钼金铲轻触没有活动反应则认为虫体死亡。排除 失踪、体内孵化及非自然死亡线虫。全部线虫死亡则实验结束。计算线虫平均寿命见表1。
[0058] 实施例1. 2
[0059] 本实施例用于说明本发明的长双歧杆菌延缓衰老的功效。
[0060] (1)将大肠杆菌0P50以1%的接种量接种至LB液体培养基，于恒温摇床 37°C 220rpm振荡培养8h至对数末期，得到大肠杆菌0P50培养液；将长双歧杆菌以1%的接 种量接种至MRS液体培养基，于充氮厌氧瓶37°C培养12h至对数末期，得到长双歧杆菌培养 液。
[0061] 分别将上述大肠杆菌0P50和长双歧杆菌的培养液，以4000Xg离心15min收集菌 体，用M9缓冲液重复离心洗涤两次，之后4°C 16000 X g离心15min，去掉全部上清液，称量 菌体湿重。将菌体以一定量的M9缓冲液重悬，使菌体终浓度为400mg/mL，分装于1. 5mL离 心管，作为浓缩菌体。
[0062] 分别将上述两种浓缩菌体65°C热灭活1. 5h，冷却后将大肠杆菌0P50和长双歧杆 菌按7:3的重量比（即长双歧杆菌为30重量％)混合得到混合物，将混合物按照400mg/mL 的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于直径60mm的mNGM平板表面，使每平板菌体量为10mg，共 6块平板，4 °C密封保存备用。
[0063] (2)在直径90mm NGM培养基表面，均匀涂布200 μ L大肠杆菌0P50培养液，37°C培 养l〇h，作为线虫传代用平板，4°C密封保存备用。
[0064] 在无菌条件下，用手术刀从生长有线虫的NGM平板上切取约lcmX lcm的小块培养 基，正面向下扣在线虫传代用平板上，置于25°C培养，60mm平皿一般7天传代一次，保持线 虫活性。
[0065] 取传代后成虫大多处于产卵期的平板用于线虫同期化：
[0066] 向平板中加入2mL M9缓冲液，用无菌吸管吹打，尽量冲下平板上的虫体，将虫体转 移至1. 5mL离心管，800Xg离心lmin，弃上清收集虫体，加入lmL M9缓冲液再次离心洗涤 虫体，尽量吸尽上清。
[0067] 加入lmL新鲜的线虫裂解液，立刻漩润振荡10s，800 Xg离心lmin，移液器吸走上 清。
[0068] 立刻加入lmL M9缓冲液洗涤虫体，800Xg离心lmin，连续两次，去除残留裂解液。 最后管内剩余约1〇〇 μ L含有虫卵的M9悬浊液。
[0069] 使用无菌吸管将虫卵滴加于涂布0Ρ50的NGM平板，25°C培养48h，得到同期化48h 的线虫。
[0070] (3)将同期化48h的线虫，置于体视显微镜观察，使用钼金铲挑取生殖口为透明半 月形的L4期雌雄同体虫于步骤（1)得到的mNGM平板上，每块平板挑取10只，平板置于25°C 培养。每天观察线虫生存状况，如虫体对钼金铲轻触没有活动反应则认为虫体死亡。排除 失踪、体内孵化及非自然死亡线虫。全部线虫死亡则实验结束。计算线虫平均寿命见表1。
[0071] 实施例1.3
[0072] 本实施例用于说明本发明的长双歧杆菌延缓衰老的功效。
[0073] (1)将大肠杆菌0P50以1%的接种量接种至LB液体培养基，于恒温摇床 37°C 220rpm振荡培养8h至对数末期，得到大肠杆菌0P50培养液；将长双歧杆菌以1%的接 种量接种至MRS液体培养基，于充氮厌氧瓶37°C培养12h至对数末期，得到长双歧杆菌培养 液。
[0074] 分别将上述大肠杆菌0P50和长双歧杆菌的培养液，以4000 X g离心15min收集菌 体，用M9缓冲液重复离心洗涤两次，之后4°C 16000 X g离心15min，去掉全部上清液，称量 菌体湿重。将菌体以一定量的M9缓冲液重悬，使菌体终浓度为400mg/mL，分装于1. 5mL离 心管，作为浓缩菌体。
[0075] 分别将上述两种浓缩菌体85°C热灭活0. 5h，冷却后将大肠杆菌0P50和长双歧杆 菌按1:1的重量比（即长双歧杆菌为50重量％)混合得到混合物，将混合物按照400mg/mL 的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于直径60mm的mNGM平板表面，使每平板菌体量为10mg，共 6块平板，4 °C密封保存备用。
[0076] (2)在直径90mm NGM培养基表面，均匀涂布200yL大肠杆菌0P50培养液，37°C培 养l〇h，作为线虫传代用平板，4°C密封保存备用。
[0077] 在无菌条件下，用手术刀从生长有线虫的NGM平板上切取约lcmX lcm的小块培养 基，正面向下扣在线虫传代用平板上，置于25°C培养，60mm平皿一般7天传代一次，保持线 虫活性。
[0078] 取传代后成虫大多处于产卵期的平板用于线虫同期化：
[0079] 向平板中加入2mL M9缓冲液，用无菌吸管吹打，尽量冲下平板上的虫体，将虫体转 移至1. 5mL离心管，800Xg离心lmin，弃上清收集虫体，加入lmL M9缓冲液再次离心洗涤 虫体，尽量吸尽上清。
[0080] 加入lmL新鲜的线虫裂解液，立刻漩润振荡10s，800 Xg离心lmin，移液器吸走上 清。
[0081] 立刻加入lmL M9缓冲液洗涤虫体，800Xg离心lmin，连续两次，去除残留裂解液。 最后管内剩余约1〇〇 μ L含有虫卵的M9悬浊液。
[0082] 使用无菌吸管将虫卵滴加于涂布0Ρ50的NGM平板，25°C培养48h，得到同期化48h 的线虫。
[0083] (3)将同期化48h的线虫，置于体视显微镜观察，使用钼金铲挑取生殖口为透明半 月形的L4期雌雄同体虫于步骤（1)得到的mNGM平板上，每块平板挑取10只，平板置于25°C 培养。每天观察线虫生存状况，如虫体对钼金铲轻触没有活动反应则认为虫体死亡。排除 失踪、体内孵化及非自然死亡线虫。全部线虫死亡则实验结束。计算线虫平均寿命见表1。
[0084] 实施例1. 4
[0085] 本实施例用于说明本发明的长双歧杆菌延缓衰老的功效。
[0086] 按照实施例1. 1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，步骤（1)中，灭活冷却后将 大肠杆菌0P50和长双歧杆菌按3:7的重量比（即长双歧杆菌为70重量％)混合。计算线虫 平均寿命见表1。
[0087] 实施例1. 5
[0088] 本实施例用于说明本发明的长双歧杆菌延缓衰老的功效。
[0089] 按照实施例1. 1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，步骤（1)中，灭活冷却后将 大肠杆菌0P50和长双歧杆菌按9:1的重量比（即长双歧杆菌为10重量％)混合。计算线虫 平均寿命见表1。
[0090] 实施例1. 6
[0091] 本实施例用于说明本发明的长双歧杆菌延缓衰老的功效。
[0092] 按照实施例1. 1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，灭活温度为90°C，灭活时间 为0. 3h。计算线虫平均寿命见表1。
[0093] 实施例1. 7
[0094] 本实施例用于说明本发明的长双歧杆菌延缓衰老的功效。
[0095] 按照实施例1. 1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，灭活温度为60°C，灭活时间 为2. Oh。计算线虫平均寿命见表1。
[0096] 对比例1. 1
[0097] 按照实施例1. 1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，用ATCC15707(S卩，保藏于美 国标准生物品收藏中心，保藏号为ATCC15707)公开的菌株替代长双歧杆菌。计算线虫平均 寿命见表1。
[0098] 对比例1.2
[0099] 按照实施例1. 1的方法进行线虫寿命试验，不同的是，灭活冷却后将大肠杆菌 0P50按照400mg/mL的比例悬浮于M9缓冲液中，涂布于mNGM平板表面，S卩，mNGM平板表面 仅涂布灭活冷却后的大肠杆菌0P50。计算线虫平均寿命见表1。
[0100] 表 1
[0101]
【权利要求】
1. 一种长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)，其特征在于，所述长双歧杆菌的保藏 编号为 CGMCC No. 6273。
2. -种制备功能食品组合物的方法，所述方法包括：将权利要求1所述的长双歧杆菌 的活菌体灭活，得到菌体物质。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述灭活的条件包括：温度为60-90°C，优选 65-85°C，时间为 0· 3-2h，优选 0· 5-1. 5h。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述方法还包括，将所述菌体物质添加到食 物中。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，以所述功能食品组合物的总重量为基准，所述菌 体物质的添加量为10-70重量％，优选为30-50重量％。
6. 由权利要求2-5中任意一项所述的方法制备的功能食品组合物。
7. -种功能食品组合物，其特征在于，所述功能食品组合物含有权利要求1所述的长 双歧杆菌的活菌体。
8. 根据权利要求7所述的功能食品组合物，其中，以所述功能食品组合物的总重量为 基准，所述长双歧杆菌的活菌体的含量为l〇5-l〇 1(lCFU/g，优选为107-109CFU/g。
9. 根据权利要求7或8所述的功能食品组合物，其中，所述功能食品组合物还含有食 物。
10. 权利要求1所述的长双歧杆菌在制备延缓衰老的功能食品组合物中的应用。
【文档编号】A23L1/30GK104046573SQ201310076631
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月11日 优先权日:2013年3月11日
【发明者】任发政 申请人:北京中天神舟航天食品技术研究院