一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia?globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe；所述Phe突变为Arg。本发明所得的偏甘油酯脂肪酶突变体Phe278Arg对甘油单酯水解活性提高，更适合工业生物转化的应用。经改造后的SMG1Phe278Arg突变体对偏甘油酯有更好的选择性，对甘油单酯选择性因子的值为83.49，明显高于野生型的偏甘油酯脂肪酶SMG1-WT选择性因子的49.41，获得与原始酶基因的不同的底物选择特性，水解处理混合偏甘油酯可获得纯度大于98%的甘油二酯产物。
【专利说明】一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种甘油单酯水解活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，能够催化水解天然底物油脂生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。而偏甘油酯脂肪酶是一种只水解甘油单酯和甘油二酯，而不水解甘油三酯的脂肪酶。脂肪酶参与的催化反应类型广泛，包括催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品行业、生物医药、日用化工等领域。
[0003]甘油二酯(简称DAG)是由丙三醇(甘油)与两个脂肪酸酯化后得到的产物，具有明确的防止肥胖、降血脂等功能且食用安全，作为普通食用油的换代产品。脂肪酶可以在温和的条件下催化油脂改性制备甘油二酯，但现有的酶法合成甘油二酯合成工艺中一般含有甘油三酯和单甘油酯(MAG)，由于甘油三酯与甘油二酯难以有效分离，使得产品中DAG的纯度较低，专利02827094.0公开了一种利用利用偏甘油酯脂肪酶通过酯化方法合成高纯度甘油二酯的方法，但其反应的副产物含有甘油单酯。虽然可以通过分子蒸馏等工艺将反应混合物中的MAG和未反应的酰基供体分离除去，但处理过程中高的蒸发温度，一方面导致能耗提高，同时使影响油脂的产品的品质。利用特异性的甘油单酯脂肪酶用于降解油脂产品中的MAG可以在温和的条件下获得高纯度的DAG，但是至今特异性甘油单酯脂肪酶酶制剂仍然缺乏。
[0004]蛋白质工程是一种能够改善酶蛋白质特性的可行的方法，借助分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得底物选择性改变的酶突变体。
【发明内容】
[0005]本发明解决的技术问题是提供一种选择性水解甘油单酯水解的SMGl脂肪酶突变体，可应用于制备高纯度的甘油二酯。通过理性选择突变位点，是由马拉色霉菌属 (Malassezia globosa)SMGl 脂肪酶基因(genbank 登录号 XM_001732152.1 )，通过对其蛋白结构(PDB:3UUE)的分析，运用定点突变的方法而获得的脂肪酶突变体。进行定点突变获得酶突变体，亲本SMGl-WT的氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置发生突变，采用 “原始氨基`酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为:Phe278Arg。
[0006]本发明的技术方案具体如下:
[0007]—种偏甘油酯脂肪酶突变体,该突变体是对马拉色霉菌(Malassezia globosa)偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe ;所述Phe突变为 Arg0
[0008]所述突变体的DNA序列为SEQ N0.2。[0009]所述突变体的氨基酸序列为SEQ N0.3。
[0010]所述偏甘油酯脂肪酶突变体在制备高纯度甘油二酯中的应用，首先，利用上述突变体制备突变质粒，再制备重组菌株，最后利用重组菌株表达制备偏甘油酯脂肪酶突变体，并将偏甘油酯脂肪酶突变体用于制备高纯度甘油二酯。
[0011]所述利用上述突变体制备突变质粒的方法，包括如下步骤:
[0012](I)利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；
[0013](2)将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒PGAPZaA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5 a感受态细胞，得到含有偏甘油酯脂肪酶突变体基因质粒。
[0014]所述PCR的引物序列如下:
【权利要求】
1.一种偏甘油酯脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体是对马拉色霉菌(Malasseziaglobosa)偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe ;所述Phe突变为Arg。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列为SEQN0.2。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQN0.3。
4.一种利用权利要求1~3任意一项突变体制得的质粒。
5.权利要求4所述质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段； (2)将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶KpnI和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒PGAPZaA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5 a感受态细胞，得到含有偏甘油酯脂肪酶突变体基因质粒。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR的引物序列如下:
7.—种重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将权利要求4的质粒经限制性内切酶BlnI线性化后，电转至宿主细胞； (2)将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30°C培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33。
9.权利要求7或8所述方法制备的重组菌株。
10.权利要求1或2或3所述偏甘油酯脂肪酶突变体在制备高纯度甘油二酯中的应用。
【文档编号】C12N15/81GK103525784SQ201310461452
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】蓝东明, 王永华, 刘璐, 王卫飞, 杨博 申请人:华南理工大学