一种生产抗cd20抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种培养动物细胞生产抗CD20抗体的方法，具体公开了其接种量、培养基配方及培养过程各控制参数。其中培养基为无血清培养基，因此在细胞培养过程中不会产生由血清带来的副作用，更有利于抗体的提取与纯化。利用本方法生产抗CD20抗体不同批次间的差异小、抗体的表达量高、生产成本低、安全性好。
【专利说明】-种生产抗CD20抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种生产抗CD20抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 非霍奇金淋己瘤（NHL)是临床最常见的恶性肿瘤之一，其中约85%为B细胞来源， 其发病率和死亡率已居恶性肿瘤第5位。饥正对传统的治疗方法如化疗、放疗、免疫调节， 有效率高，但复发率也高，再次治疗缓解率低，且毒副反应大，患者耐受性差。近十余年 来，随着抗体药物的发展，W美罗华为代表的抗CD20单抗制剂极大改善了淋己瘤的临床 疗效。
[0003] 目前，培养动物细胞制备抗体的方法中，多使用有含血清> 10%培养基才能使细 胞正常生长。然而动物血清一方面会给细胞生长提供诸如激素，抗生素，微量元素等物质， 另一方面，在补料的过程中会导致培养液PH变化大，储存过程中容易被微生物污染，W及 不同批次的差异大，成本高。因此采用血清含量少或者无血清培养基培养动物细胞已成为 一种趋势。
【发明内容】
[0004] 本发明第一个目的是提供一种培养CH0细胞的培养基，所述CH0细胞其保藏号为 CCTCC NO. C201158,所述培养基包含氨基酸、无机盐、维生素、激素及其他物质，其含量分别 为：氨基酸749?1180mg/L，无机盐8411?10254mg/L，维生素8. 4mg/L?52. 5mg/L，激素 1. 0-5. 0E-08mg/L,其他物质 4302. 6mg/L ?9509. 6mg/L。
[0005] 优选地，所述氨基酸包括L-精氨酸，L-天口冬氨酸，L-半脫氨酸，L-谷氨酸， L-谷氨醜胺，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨 酸，L -脯氨酸，L -丝氨酸，L -苏氨酸，L -色氨酸，L -额氨酸，L -酪氨酸，L -丙氨酸 和甘氨酸；
[0006] 所述无机盐包括无水氯化巧，氯化裡，五水硫酸铜，硫酸铅，漠化钟，氣化轴，氯化 颂，氯化铅? 6肥0,无水磯酸氨二轴，走水硫酸亚铁，走水合硫酸锋，碳酸氨轴，氯化钟，氯化 轴，，六水合氯化镇，氯化領，醋酸顿，硝酸银，氯氧化铅?細20,楓化钟和氯化钻?細20 ;
[0007] 所述维生素包括氯化胆碱，核黄素，叶酸，维生素K3,烟醜胺，硫辛酸，维生素 B12,，维生素B6和肌醇；
[0008] 所述激素为氨化可的松；
[0009] 所述其他物质包括亚油酸，胸巧，腺巧，胞巧，尿巧，鸟巧，腐胺，亚砸酸轴，酵母粉， D-葡萄糖，丙丽酸轴和大豆蛋白腺。
[0010] 进一步优选地，每升培养基包括下表1所示的组份：
[0011] 表1本发明培养基
[0012]
【权利要求】
1. 一种培养CHO细胞的培养基，所述CHO细胞保藏号为CCTCC NO. C201158,所述培 养基包含氨基酸、无机盐、维生素、激素及其他物质，其特征在于所述培养基组份含量为： 氨基酸749?1180mg/L，无机盐8411?10254mg/L，维生素8. 4mg/L?52. 5mg/L，激素 L 0-5. 0E-08mg/L，其他物质 4302. 6mg/L ?9509. 6mg/L。
2. 根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述氨基酸包括L-精氨酸，L-天门冬 氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L -蛋氨酸，L -苯丙氨酸，L -脯氨酸，L -丝氨酸，L -苏氨酸，L -色氨酸，L -缬氨酸，L -酪氨酸，L -丙氨酸和甘氨酸； 所述无机盐包括无水氯化钙，氯化锂，五水硫酸铜，硫酸铬，溴化钾，氟化钠，氯化铷，氯 化铝·6H20,无水磷酸氢二钠，七水硫酸亚铁，七水合硫酸锌，碳酸氢钠，氯化钾，氯化钠，，六 水合氯化镁，氯化镉，醋酸钡，硝酸银，氯氧化锆· 8H20,碘化钾和氯化钴· 6H20 ; 所述维生素包括氯化胆碱，核黄素，叶酸，维生素 K3,烟酰胺，硫辛酸，维生素 B12,，维 生素 B6和肌醇； 所述激素为氢化可的松； 所述其他物质包括亚油酸，胸苷，腺苷，胞苷，尿苷，鸟苷，腐胺，亚硒酸钠，酵母粉，D -葡萄糖，丙酮酸钠和大豆蛋白胨。
3. 根据权利要求1所述培养基，其特征在于，每升培养基包括下表1所示的组份： 表1
4. 一种利用权利要求1?3任一项所述培养基培养CHO细胞生产抗⑶20抗体的方法， 该方法具体包括将CHO细胞复苏后接种到转瓶里培养，通过转瓶逐级放大培养，然后将细 胞接种至5L反应器中培养。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，5L反应器培养阶段，在培养初期到对数生 长期，控制培养温度为36?37°C，PH为7. 1?7. 2,搅拌转速为120?150rpm，当细胞生长 进入对数生长后期，即细胞密度达到3-4X IO6个/毫升时，调控温度为31?33°C，PH值为 6. 9?7. 0,搅拌转速为80?lOOrpm。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，复苏后细胞接种到转瓶里培养，接种量为 0. 3-0. 5 X IO6个细胞/毫升培养基。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，转瓶培养包括IOOmL转瓶到250mL转瓶再 到500mL转瓶的传代扩增培养。
8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，转瓶培养阶段，摇床转速为75?85rpm， 培养温度为36?37°C。
9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，转瓶培养到细胞总数达到LOX IO8个时， 接种至5L反应器中培养。
10. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，5L反应器培养阶段，控制葡萄糖浓度 0· 5 ?3g/L，溶氧 30%-60%。
【文档编号】C12R1/91GK104513805SQ201310470054
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年10月7日 优先权日:2013年10月7日
【发明者】赵志全, 赵丽丽, 程凡亮, 刘增田, 张继环 申请人:鲁南制药集团股份有限公司