一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒，组成：（1）DNA提取试剂：5-15mMTris、0.5-1.5mM?EDTA的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL；100%的氯仿；100%的异丙醇；乙醇，浓度70%；双蒸水；（2）PCR反应试剂，每个PCR反应管中含有10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度为10μM的dNTPs0.5μL，浓度为5U/μL的Taq?DNA聚合酶0.3μL，10μM的特异性寡核苷酸引物A0.5μL，10μM的特异性寡核苷酸引物B0.5μL，灭菌去离子水19.2μL，引物A：5’-CAGCGAGGAGGAAAGGTTGGTGGT-3’,引物B：5’-AAGCCACGCCTCAAGGGCACAA-3’。本发明用于检测舒伯特气单胞菌。
【专利说明】一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及用该试剂盒检测舒伯特气单胞菌的方法。
【背景技术】
[0002]舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)属气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼。该菌广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，人类接触后可引起感染，是急性腹泻的重要致病菌。然而有关该菌的检测试剂盒和检测技术虽已有专利申请(申请号:201210467910.1，名称:“一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法”)披露，但该申请的试剂盒和检测技术仅适用于“鳢源舒伯特气单胞菌”，对其它宿主来源的舒伯特气单胞菌并不都能准确检测，根据对该申请的核心检测引物“gyrB引物对”的分析发现，该引物对与部分水产动物来源的舒伯特气单胞菌对应基因不能很好的匹配，如GeneBank数据库中的HQ731455、HQ731454、HQ731457、JQ319030。而本发明的核心引物组对所有已公布序列的舒伯特气单胞菌对应基因序列特异并完全弥合。因此本发明根据舒伯特气单胞菌基因组中特异保守区域设计适用于组装试剂盒的引物，并结合组织和细菌基因组提取试剂建立了舒伯特气单胞菌检测试剂盒，弥补了该【技术领域】不能解决对所有来源舒伯特气单胞菌检测的缺陷。本发明的试剂盒和检测方法的建立为水产动物舒伯特气单胞菌的快速诊断和病原调查提供了技术支撑。
【发明内容】
[0003]为解决传统的舒伯特气单胞菌鉴定方法费时、准确率低的问题，本发明提供一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及其检测方法。根据舒伯特气单胞菌基因组保守区设计特异性引物，运用两步法PCR技术研制舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒和检测方法。该方法不但具有检测效率性，更具有检测的特异性，对同属的其它气单胞菌无交叉反应，扩增目的片段大小适中，检测技术中PCR程序的退火和扩增同时进行，大大降低了反应时间，并增加了反应特异性。该试剂盒可以以组织样品初提的DNA为起始物进行检测，利于临床试剂盒的应用。这也弥补了现今缺乏普适性的舒伯特气单胞菌检测试剂盒的空白。
[0004]为解决上述问题，本发明包括一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒以及用该试剂盒检测舒伯特气单胞菌的方法。
[0005]本发明一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，其特殊之处是所述DNA提取试剂和PCR反应试剂分别为:
[0006](I )DNA 提取试剂成分为 5-15mM Tris,0.5-1.5mM EDTA 的 pH8.0 的 TE 缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL ；100%的氯仿；100%的异丙醇；乙醇，浓度70% ;双蒸水；
[0007](2)PCR反应试剂分装于若干反应管，每个PCR反应管中含有IOXPCR反应缓冲液
2.5 μ L，浓度为10 μ M的dNTPs0.5 μ L,浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶0.3 μ L，浓度为10 μ M的特异性寡核苷酸引物A0.5 μ L，10 μ M的特异性寡核苷酸引物B0.5 μ L，灭菌去离子水19.2 μ L，其中——
[0008]引物A: 5，-CAGCGAGGAGGAAAGGTTGGTGGT-3，，
[0009]引物B: 5，-AAGCCACGCCTCAAGGGCACAA-3，。
[0010]本发明用所述的试剂盒检测舒伯特气单胞菌的方法，步骤为:(I)用所述提取试剂提取样品中的DNA ; (2)用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增；(3)所述扩增产品作凝胶电泳；其特殊之处是所述PCR扩增过程为95°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C复性延伸30s，循环35次；最后72°C延伸5~IOmin ;所述凝胶电泳后观察到413bp扩增产物。
[0011]本发明中所设计的舒伯特气单胞菌特异性检测引物,是根据GenBank中气单胞菌属25个种的对应基因组序列，以及所有已公布基因组序列的18株舒伯特气单胞菌，进行序列相似区比对和排列，寻找针对舒伯特气单胞菌核苷酸序列保守区域和位点作为引物设计区，设计对舒伯特气单胞菌特异的引物(引物A和引物B)。国内外尚未见对所有来源舒伯特气单胞菌特异检测引物设计的研究报道。
[0012]为保证特异针对舒伯特气单胞菌，并快速获得扩增，本发明对选取的引物进行局部优化设计，使得PCR反应中的退火温度接近延伸温度，从而可以利用2步PCR法对目的区进行扩增，这不但提高了检测的特异性，更大大减少了检测所需时间。本发明的试剂盒，弥补了该【技术领域】不能解决对所有来源舒伯特气单胞菌检测的缺陷。本发明的试剂盒和检测方法的建立为水产动物舒伯特气单胞菌的快速诊断和病原调查提供了技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明检测舒伯特气单胞菌的特异性图。
[0014]图1 中 M:DL1000DNA Marker;I:A.veronii;2:A.sobria;3:A.hydrophila;4:A.caviae;5:A.bestiarum;6:A.allosaccharophila;7:A.media;8:A.eucrenophila;9:A.1chthiosmia;10:A.caviae;11:Edwardsiella tarda;12:Escherichia coli;13:Pseudomonas aeruginosa;14:Staphylococcus aureus;15:Enterobacter cloacae;16:Streptococcus agalactiae;17:Vibrio harveyi;18:V.parahaemolyticus;19:V.alginolyticus; 20:Aeromonas schubertii ；21:Aeromonas schubertii ；22:患病组织。
【具体实施方式】
[0015]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0016]实施例一
[0017]舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒，以及用该试剂盒对不同细菌基因组DNA作特异性检测。
[0018]试剂盒组成为:
[0019]DNA提取试剂其组成为5mM Tris,0.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15mg/mL ；100%的氯仿；100%的异丙醇;乙醇,浓度70% ;双蒸水；
[0020]PCR反应试剂分装于若干反应管，每个PCR反应管中含有10XPCR反应缓冲液
2.5 μ L，浓度为10 μ M的dNTPs0.5 μ L,浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶0.3 μ L，浓度为10 μ M的特异性寡核苷酸引物Α0.5 μ L，10 μ M的特异性寡核苷酸引物B0.5 μ L，灭菌去离子水 19.2 μ L0
[0021]本发明所提供的试剂盒对样品中舒伯特气单胞菌的检测方法，是先用DNA提取试剂对样品进行DNA提取，再用PCR反应试剂对DNA进行PCR扩增，扩增反应结束后取5 μ LPCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，即可发现样品中是否含有舒伯特气单胞菌。整个检测过程3小时内即可完成，具体为:
[0022]1、提取样品中的DNA
[0023](I).称取病样0.lg，充分研磨后加入500 μ L所述组成为5mM Tris和0.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液，并加入20 μ L蛋白酶K溶液，混匀后于56°C放置Ihr ;加入100 μ L氯仿混匀，12000rpm离心15min,取上层液移至另一离心管,加入400 μ L异丙醇,室温沉淀IOmin, 12000rpm离心lOmi n，取沉淀物，用70%乙醇洗涤2次；
[0024](2).液体培养的21种不同菌种，包括舒伯特气单胞菌，各取500μ L细菌培养液离心，取沉淀物，加入500 μ L所述组成为5mM Tris和0.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液，并加入20 μ L蛋白酶K溶液，混匀后于56°C放置Ihr ;加入100 μ L氯仿混匀，12000rpm离心15min,取上层液移至另一离心管,加入400 μ L异丙醇,室温沉淀lOmin, 12000rpm离心lOmin，取沉淀物，用70%乙醇洗涤2次；
[0025]步骤(1)的沉淀物和步骤(2)的沉淀物分别于室温干燥，干燥后样品分别溶于双蒸水，得22个样品的基因组DNA溶液。
[0026]2、PCR 反应
[0027]取所述试剂盒中的反应管22支，与所述22个样品的基因组DNA溶液一一对应，分别在各反应管中加入一种所述基因组DNA溶液I μ L，并分别标记，反应管内DNA溶液与PCR反应试剂充分混匀后，放入PCR扩增仪反应。反应过程为95°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C复性延伸30s，循环35次；最后72°C延伸5min。
[0028]3、琼脂糖凝胶电泳
[0029]取5 μ L PCR扩增产物在含5 μ g/ml嗅化乙啶(EB)的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，30min后于紫外透射反射仪上观察结果，目的扩增片段为413bp。
[0030]4、试剂盒的检测特异性
[0031]结果显示只有舒伯特气单胞菌和感染了舒伯特气单胞菌的组织的核酸扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在413bp处出现一条特异性核酸带；而其它种类细菌未见片段大小为413bp的特异性核酸带(见图1所示)。结果表明本试剂盒对舒伯特气单胞菌检测特异。
[0032]实施例二
[0033]舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒，以及用该试剂盒对不同细菌基因组DNA作特异性检测。
[0034]试剂盒组成为:
[0035]DNA提取试剂其组成为15mM TrisU.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度18mg/mL ；100%的氯仿；100%的异丙醇；乙醇,浓度70% ;双蒸水；
[0036]PCR反应试剂分装于若干反应管，每个PCR反应管中含有IOXPCR反应缓冲液
2.5 μ L，浓度为10 μ M的dNTPs0.5 μ L,浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶0.3 μ L，浓度为10 μ M的特异性寡核苷酸引物Α0.5 μ L，10 μ M的特异性寡核苷酸引物B0.5 μ L，灭菌去离子水 19.2 μ Lo[0037]本发明所提供的试剂盒对样品中舒伯特气单胞菌的检测方法，是先用DNA提取试剂对样品进行DNA提取，再用PCR反应试剂对DNA进行PCR扩增，扩增反应结束后取5 μ LPCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，即可发现样品中是否含有舒伯特气单胞菌。整个检测过程3小时内即可完成，具体为:
[0038]1、提取样品中的DNA
[0039](I).称取病样0.lg，充分研磨后加入50(^1^所述组成为15通Tris和1.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液，并加入20 μ L蛋白酶K溶液，混匀后于56°C放置Ihr ;加入100 μ L氯仿混匀，12000rpm离心15min,取上层液移至另一离心管,加入400 μ L异丙醇,室温沉淀lOmin, 12000rpm离心lOmin，取沉淀物，用70%乙醇洗涤2次；
[0040](2).液体培养的21种不同菌种，包括舒伯特气单胞菌，各取500μ L细菌培养液离心，取沉淀物，加入500 μ L所述组成为15mM Tris和1.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液，并加入20 μ L蛋白酶K溶液，混匀后于56°C放置Ihr ;加入100 μ L氯仿混匀，12000rpm离心15min,取上层液移至另一离心管,加入400 μ L异丙醇,室温沉淀lOmin, 12000rpm离心lOmin，取沉淀物，用70%乙醇洗涤2次；
[0041]步骤(1)的沉淀物和步骤(2)的沉淀物分别室温干燥，干燥后样品溶于双蒸水，得样品基因组DNA溶液。
[0042]以下PCR反应、琼脂糖凝胶电泳与观察结果以及试剂盒的检测特异性与上例的相同，不再赘述。·
【权利要求】
1.一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，其特征是所述DNA提取试剂和PCR反应试剂分别为: (1)0嫩提取试剂成分为5-151111Tris,0.5-1.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液；蛋白酶K,浓度15-20mg/mL ；100%的氯仿；100%的异丙醇；乙醇,浓度70% ;双蒸水； (2)PCR反应试剂分装于若干反应管，每个PCR反应管中含有10XPCR反应缓冲液2.5 μ L，浓度为10 μ M的dNTPs0.5 μ L,浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶0.3 μ L，浓度为10 μ M的特异性寡核苷酸引物Α0.5 μ L，10 μ M的特异性寡核苷酸引物B0.5 μ L，灭菌去离子水19.2 μ L，其中——
引物 A:5’ -CAGCGAGGAGGAAAGGTTGGTGGT-3’，
引物 B:5’ -AAGCCACGCCTCAAGGGCACAA-3’。
2.用权利要求1所述的试剂盒检测舒伯特气单胞菌的方法，步骤为:(I)用所述提取试剂提取样品中的DNA ; (2)用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增；(3)所述扩增产品作凝胶电泳；其特征是所述PCR扩增过程为95°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C复性延伸30s，循环35次；最后72°C延伸5~IOmi`n ;所述凝胶电泳后观察到413bp扩增产物。
【文档编号】C12Q1/68GK103571950SQ201310482323
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】沈锦玉, 潘晓艺, 尹文林, 郝贵杰, 姚嘉赟, 徐洋, 蔺凌云, 袁雪梅 申请人:浙江省淡水水产研究所