将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离的制作方法
【专利摘要】本发明涉及精子的分离【技术领域】，具体而言，涉及将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括：向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液，其中，荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg荧光染料；采用流式细胞仪对混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。本发明上提供的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。
【专利说明】将四溴化1, 1, 2, 2-四-[4- (2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙
烯应用于精子分离
【技术领域】
[0001]本发明涉及精子的分离【技术领域】，具体而言，涉及将四溴化1，I, 2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离。
【背景技术】
[0002]流式细胞仪分离动物X精子和Y精子，是动物性别控制的一条新途径，其工作原理是:利用动物含有X染色体和含有Y染色体的精液中DNA含量存在差异，借助荧光染料染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机判别精子类别，再通过给精液液滴附加电荷，根据静电原理，将含有X染色体的精液和Y染色体的精液分离。
[0003]在相关技术中，上述方法常用的荧光染料易发生聚集荧光猝灭现象:当染料的浓度较高时，染料分子会聚集进而导致发射的荧光强度骤降。当待分离的精液密度较高时，此时需要较高浓度的荧光染料进行标记，但是高浓度的染料分子会发生聚集，进而发生聚集荧光猝灭，导致精子的分离效果不理想。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供将四溴化1，I, 2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，以解决上述的问题。
[0005]在本发明的实施例中提供了将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤:
[0006]向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液；其中，所述荧光染料为四溴化1，1,2, 2-四-[`4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7 μ g所述荧光染料；
[0007]采用流式细胞仪对所述混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。
[0008]本发明上述实施例的将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，所用的荧光染料一四溴化1，1,2, 2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯(即TTAPE)是一种具有聚集诱导发光现象的分子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料分子内旋转被冻结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏度高、背景噪音低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是=TTAPE与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限制了分子间转动，致使其发荧光。
【具体实施方式】
[0009]下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
[0010]实施例一[0011]该实施例提供了将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤:
[0012]第一步:向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液(staining talp)，再孵育，得到混合液。
[0013]第二步:采用流式细胞仪对混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。
[0014]其中，荧光染料为四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7 μ g荧光染料。
[0015]以上应用所用的荧光染料为四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯(即TTAPE)，其是一种具有聚集诱导发光现象的分子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料分子内旋转被冻结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏度高、背景噪音低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。由此可见，TTAPE可替代现有技术中用于分离精子的其它染色体，采用一种新型的发光原理一聚集诱导发光进行检测。
[0016]另外，上述应用还具有另外的一个优点:由于TTAPE在光源的照射下不会发生猝灭现象，因此上述应用中的所有步骤不需要在避光条件下操作。由此可见，本发明的应用降低了对操作条件的要求，更易推广。
[0017]其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是=TTAPE与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限制了分子间转动，致使其发荧光。
[0018]上述应用中所用的荧光染料TTAPE通常采用如下的制备方法:
[0019]第一步:DHBP(4，4’二羟基二苯酮)3克和碳酸钾5克，50mL丙酮加入到4mLl，2-二溴乙烷中，将混合物以回流方式`搅拌、加热24小时，过滤，蒸干溶剂。粗产物用硅胶柱(氯仿)得到4，4’ - 二羟基苯丙酮(BBEBP)白色粉末。产物经过红外和核磁测试的验证。
[0020]第二步:1克BBEBP在50mL四氢呋喃(THF)悬浮液中，加入四氯化钛0.26mL和锌粉0.31克，沸腾20小时，反应混合物冷却到室温，过滤。真空干燥，溶剂挥发，粗产物过硅胶柱(氯仿/环己烷1:4)。产物经过红外和核磁共振光谱测试。
[0021]第三步:在250mL烧瓶中，磁力搅拌，溶解100mgl，l，2，2-四-(溴乙氧基)四苯乙烯(TBEPE)在IOOmLTHF中，然后加入过量的三乙基胺(5mL)，保持回流3天。在此过程中，间断加入IOmL水，减压蒸馏，水溶液用氯仿洗三次，溶剂挥发之后真空50°C干燥得到TTAPE。
[0022]上述制备方法的化学反应式如下，“reflux”是指回流，“Et3N”是指三乙胺:
[0023]
【权利要求】
1.将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，包括下列步骤: 向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液，其中，所述荧光染料为四溴化1，1,2, 2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7 μ g所述荧光染料； 采用流式细胞仪对所述混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。
2.根据权利要求1所述的将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于 ，所述孵育的时间为:
40_50mino
3.根据权利要求1所述的将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述待分离的精液为:活力>0.6，密度> 10亿/mL的精液。
4.根据权利要求1所述的将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述孵育的步骤之后和所述分离的步骤之前还包括: 向所述混合液中加入蛋黄工作液。
5.根据权利要求1所述的将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括: 向所述待分离的精液中加入抗生素。
6.根据权利要求1所述的将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括: 在30-35 °C下将所述荧光染料和所述染色用工作液预热。
7.根据权利要求4所述的将四溴化1，I,2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向所述混合液中加入蛋黄工作液的步骤之前还包括: 在30-35°C下将所述蛋黄工作液预热。
8.根据权利要求1所述的将四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括: 用孔径为45-55 μ m的过滤器过滤所述待分离的精液。
9.根据权利要求4所述的将四溴化1，I,2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向所述混合液中加入蛋黄工作液的步骤之后和所述分离的步骤之前还包括: 用孔径为45-55 μ m的过滤器过滤混合液。
【文档编号】C12N5/076GK103555662SQ201310530972
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】于建香, 帅志强, 苏冠宇, 武光明, 姚天宇 申请人:大连金弘基种畜有限公司, 北京石油化工学院