模式识别受体rig-i在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术和医学诊断领域，本发明研究发现，肿瘤患者的肿瘤组织中模式识别受体RIG-I分子的表达会显著下调，且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性，其低表达与患者的预后差显著相关。本发明提供了模式识别受体RIG-I在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，以及相应的检测试剂盒。
【专利说明】模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]在病原生物感染机体的过程中，机体的固有免疫应答首先被激活。固有免疫应答的激活主要依赖于机体免疫细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)对病原生物特有成分的识别。目前发现的PRR主要分为三类:1、TLRs (Toll-likereceptors) ;2、RLHs (RIG-1-1ike helicases) ;3、NLRs (Nucleotide-oligomerizationdomain-like receptors)。在抗病毒固有免疫应答的过程中，病毒成分如DNA或RNA等能够被免疫细胞的TLRs和RLHs识别，进而活化下游信号途径，促使免疫细胞活化并表达促炎症细胞因子和I型干扰素，提高细胞的抗病毒活性并能促使病毒感染细胞的凋亡，从而发挥清除病毒感染的作用(Takeuchi, O 等，MDA5/RIG-1 and virus recognition.Curr OpinTmmunol.2008, 20:17-22)。
[0003]RLHs是细胞内识别病毒RNA的主要受体，主要有两个成员:RIG_I (retinoicacid-1nducible gene I)和 MDA5(melanoma differentiation-associated gene5)。RLHs的分子结构由两部分组成:N端的CARDs (caspase-recruitment domains)和C端的RNA解螺旋酶结构域。RNA解螺旋酶结构域主要司职病毒RNA的识别，其结构与Dicer酶相似。CARDs结构域主要司职与下游接头分子结合，进而传导活化信号。在病毒感染或I型干扰素刺激的条件下，RLHs的表达能够被显著活化，进而发挥增强病毒RNA识别及活化其下游抗病毒信号途径的作用，达到清除病毒感染的目的(Meylan E等，Toll-1ikereceptors and RNA helicases:two paral`lel ways to trigger antiviral responses.Mol Cell.2006, 22:561-569)。
[0004]以往研究认为，RIG-1主要识别病毒复制的产物dsRNA。然而，目前研究表明，5’端磷酸化的病毒RNA才是RIG-1识别的主要配体。事实上，绝大多数胞内感染病毒来源的RNA5’端都要经过磷酸化修饰，RIG-1也正是通过识别RNA的5’端是否有磷酸化修饰来区分来源于自我和非我的RNA。然而，机体自身表达的RNA最初也有5’端的磷酸化修饰，但自身RNA表达都须在核内进行剪切或修饰，如mRNA需在5’端进行甲基化加帽修饰、tRNA需经过5’端的剪切、核糖体RNA需与核糖体蛋白结合等。因此，在正常情况下机体自身来源的RNA均不会在胞浆中激活RIG-1信号。但是，机体内仍存在少量5’端磷酸化的自身RNA，这些自身RNA如何实现逃避RIG-1识别的机制还不十分清楚(YoneyamaM 等，Function of RIG-1-1ike receptors in antiviral innate immunity.J BiolChem.2007, 282:15315-15318)。此外，RIG-1和MDA5虽然同为RLHs家族病毒RNA识别受体，但它们识别的病毒种类不尽相同。RIG-1主要识别的病毒包括水泡性口炎病毒(VSV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、仙台病毒(SeV)、流感病毒(influenza virus)和乙型脑炎病毒(JEV)等；而MDA5主要识别小核糖核酸病毒，包括脑心肌炎病毒(EMCV)、脑脊髓炎病毒(Theiler’ svirus)和门戈病毒(Mengo virus)等(Kato H 等，Differential roles of MDA5and RIG-1helicases in the recognition of RNA viruses.Nature.2006，441:101-105)。
[0005]RIG-1通过其C端解螺旋酶结构域识别病毒RNA后，分子构像发生改变，暴露N端的CARDs结构域，并与下游位于线粒体膜表面的接头分子IPS-1 (IFN- β promoterstimulator)结合。IPS-1 亦称为 MAVS (mitochondrial antiviral signaling)或 VISA(virus-1nduced signaling adaptor),其活化后与 TRAF3 (tumor necrosis factorreceptor-associated factor3)结合并活化下游两条主要的信号通路:一是通过结合FADD(Fas-associated death domain-containing protein)进而活化下游转录因子 NF-κ B,激活促炎症细胞因子的表达；二是通过活化TBK-1 (TANK binding kinase-1)进而活化下游的IRF3和IRF7，促使细胞表达I型干扰素(Takeuchi等，MDA5/RIG-1 and virusrecognition.Curr Opin Tmmunol.2008, 20:17-22)。
[0006]RIG-1信号通路受胞内调控蛋白的精确调控，主要分为正向调控蛋白和负向调控蛋白两大类。正向调控蛋白一般直接参与了 RIG-1信号的活化，起到增强RIG-1信号并抑制病毒复制的作用，如 TRIM25(tripartite motif25)>RNFl35(ring-finger proteinl35)等。负相调控蛋白起抑制RIG-1信号传导的作用，避免因RIG-1信号过度活化导致的炎症损伤。目前已经发现RIG-1信号通路的负向调控蛋白有数十种，主要分为来源于机体自身表达的胞内调控蛋白和来源于病毒表达的蛋白分子两类(Komuro A等,Negative regulation ofcytoplasmic RNA-mediated antiviral signaling.Cytokine.2008，43:350-358)。前者主要包括 LGP2 (laboratory of genetics and physiology-2)、A20、Pinl、SIKE (suppressorof IKK ε )、Atg5_Atgl2、RNFl25 (ring-finger proteinl25)、DUBA (deubiquitinatingenzyme A)、CYLD(cylindromatosis)、NLRXl (nucleotide-binding domain andleucine-rich repeat XI)、gClqR 和 ISG15 (IFN stimulated genel5)等。后者由病毒自身表达，能够通过许多巧妙的机制躲避和抑制宿主抗病毒固有免疫的识别与清除。目前已经发现部分被RLHs所识别的病毒能够利用自身表达的蛋白负向调控RLHs下游信号通路，抑制干扰素的产生，从而实现 免疫逃逸。具体为:流感病毒的非结构蛋白NSl能够直接结合RIG-1并抑制其功能；丙型肝炎病毒(HCV)表达的NS3-4A蛋白和甲型肝炎病毒(HAV)表达的3ABC蛋白能够裂解IPS-1 ;埃博拉病毒(Ebola virus)的VP35蛋白和呼吸道合胞病毒virus的NS1、NS2蛋白能够抑制IRF3的磷酸化；牛痘苗病毒(VACV)表达的E3L、N1L和K7R能够抑制RIG-1的识别和下游信号等(Bowie AG等，Viral evasion and subversionof pattern-recognition receptor signalling.Nat Rev Immunol.2008，8:911-922)。
[0007]RIG-1信号通路的活化是机体I型干扰素表达的重要途径，在抗病毒固有免疫应答中发挥关键作用，是机体抵御病毒感染的重要信号途径。目前，关于RIG-1信号通路的调控机制以及病毒与宿主RIG-1信号的相互作用研究是固有免疫应答乃至免疫学研究的重点和热点。明确RIG-1信号的调控机制对于深刻理解机体抗病毒固有免疫应答，探求病毒感染性疾病的发病过程及其与机体的相互作用关系，达到预防与治疗病毒性疾病的目的，具有重要意义。
[0008]由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一，为了有效地治疗和预防肿瘤(如肝细胞癌)，目前人们已经越来越关注肿瘤的早期诊断和预后。[0009]以原发性肝癌(即原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC))为例，该疾病是我国常见的恶性肿瘤，患者死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。根据世界卫生组织的统计，全球每年新增约60万HCC患者，而每年死于肝癌的人数也约为60万。HCC的发生是一个多步骤渐进的过程，和慢性肝炎及肝硬化紧密相关。我国约有1.2亿乙肝病毒携带者，占全球感染人数的1/3。HCC根治术后5年的复发率约为60-70%，其中术后I年的复发率所占比例高达51.4-72.3%，即使是小肝癌获根治性切除后的5年复发率也达30-40%。因此术后复发转移已经成为进一步提高肝癌治疗效果的主要障碍。
[0010]术后灌注化疗转移等治疗方法有可能降低肝癌患者术后复发率，但是一些长期研究显示采用这些术后化疗后患者的生存率反而相对与未行化疗的患者降低。这些现象提示术后具有较高复发转移风险的患者可能会受益于这些术后治疗，但术后复发转移风险较低的患者采用这些术后治疗可能会适得其反。如果能够通过有效的预测方法预测术后复发风险高的患者，就可以通过一系列的干预预防措施，降低复发率，延长患者的生存期。
[0011]因此，如何有效的诊断和干预HCC的发生并适应性地选择治疗HCC患者的方法是一个紧迫的重要问题。
[0012]用临床指标(如TW分级、肝硬化程度)和单个分子指标(如AFP、MMP)预测肝癌复发转移的研究已经有较长的历史。但是，临床指标或者病理类型相似的患者却有截然不同的临床结局，所以用临床指标或者单独的分子标志来预测或评价患者难以取得满意的效果。对肿瘤实行个体化、预见性的治疗有助于更加深入理解临床病理学特征，改善对患者的临床处理，从而提高肿瘤患者的无瘤生存期及绝对生存期。确定肝癌相关基因及其参与肝癌发病机理，可为肝癌个体化预见性治疗提供基础，也为新的治疗方案提供靶点，从而有利于提高 HCC 的治愈率( Thorgeirsson, S.等，Hunting for tumor suppressor genes inliver cancer (月干癌中肿瘤抑制基因的探索).Hepatology.2003; 37:739-741)。
[0013]目前，由肿瘤基因表达模式所回顾的分子模拟，已经被用于确定不同的癌症类型包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和脑瘤的预后的新的分子标准。
[0014]1999年，Tamayo等率先利用基因芯片技术对急性白血病进行研究，根据肿瘤的基因表达谱对白血病进行分型，并根据所建立的模型对新的患者进行肿瘤类型预测，从而为利用基因芯片对肿瘤的分类和预测开创了先河(Tamayo, P.等，Interpreting patternsof gene expression with self-organizing maps:methods and application tohematopoietic differentiation(具有自组织地图的基因表达翻译模式:造血分化的方法和应用).Proc Natl Acad Sci USA.1999; 96:2907-12)。此后，类似的方法也用于对弥漫性大B细胞淋巴瘤和乳腺癌进行分析预测。这些研究结果说明，基因芯片技术能够从分子水平对肿瘤进行更准确的分类，并预测肿瘤亚型、预后和对治疗的反应性等特性。
[0015]Van t Veer等基于70个基因的乳腺癌预后诊断模型和相关诊断用芯片MammqaPrint被FDA批准上市，显示出基于基因表达谱模型来基因疾病分型和预后判断的良好前景。但是，基于微阵列的、由基因表达引起的HCC早期复发的预测的新近研究仅报道在一小组患者I年内的肝内复发并且使用6000个基因的基因芯片(Matoba，K.等，Tumor HLA-DR expression I inked to early intrahepatic recurrence ofhepatocellular carcinoma (与肝细胞癌的早期肝内复发关联的肿瘤HLA-DR表达).Int JCancer.2005; 115(2):231-40)。这就增加了 HCC预后判断的复杂度，降低了可操作性。[0016]虽然本领域中已知某些模式识别受体与肿瘤具有一定的相关性，如TLR4信号的活化促使胃癌恶化(X，Yuan 等，Activation of TLR4signaling promotes gastriccancer progression by inducing mitochondrial ROS production.Cell Death andDisease.2013;4, e794),帮助肺癌细胞实现免疫逃逸(Wei gang, H.等，TLR4signalingpromotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressivecytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology.2007;44(11):2850-2859) ;TLR3在乳腺癌细胞中发挥促凋亡作用(Salaun B.等，TLR3can directly triggerapoptosis in human cancer cells.J Immunol.2006; 176:4894-4901)。但本领域中已知的PRR功能各异，要从中筛选出与肿瘤相关且可作为发病、治疗方案选择和预后指标的特定PRR存在较大的难度。
[0017]目前，国内外尚无有关模式识别受体RIG-1与肿瘤相关性的研究报道。
[0018]而本领域迫切需要寻找到可有效用于肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的PRR分子，并将其用于这些用途中。
【发明内容】
[0019]本发明的目的在于寻找到可有效用于肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的PRR分子，本发明的另一目的在于提供该PRR分子在临床相应的检测试剂盒中的应用。
[0020]本发明从基因芯片中筛选出了肿瘤(尤其是肝癌)表达相关性及其对肝癌生长的具有调控作用的分子一模式识别受体RIG-1，由此本发明进一步提供了 RIG-1分子在用于对象中肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估中的新用途，并提供了相应的检测试剂盒。
[0021]本发明的第一方面，提供了模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用。
`[0022]所述的模式识别受体RIG-1来自:人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴等。
[0023]所述的模式识别受体RIG-1，Gene ID:23586。
[0024]所述的模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，所述的试剂盒包含检测生物样品中模式识别受体RIG-1表达量的试剂。
[0025]检测生物样品中模式识别受体RIG-1表达量的试剂，选自:对RIG-1具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物等。
[0026]所述试剂优选自:SEQ ID NOs: 1_4所示的序列、RIG-1的反义序列、寡核苷酸，或其他引物序列等。
[0027]所述的生物样品选自:获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。
[0028]所述的肿瘤具体为肝癌，所述的肝癌选自:原发性肝癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、转移性肝癌、或继发性肝癌等。
[0029]本发明的第二方面，提供了一种检测试剂盒，其包含:
[0030](i)检测生物样品中模式识别受体RIG-1表达量的一种或多种试剂；
[0031](ii)选自下组的一种或多种物质:容器、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂、溶剂，或使用说明书。[0032]所述的试剂还带有可检测标记，优选的可检测标记选自:放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)。
[0033]所述的检测试剂盒，检测模式识别受体RIG-1的方法选自以下任一:实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印记法原位杂交法。
[0034]所述的检测试剂盒，优选以实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中RIG-1的表达，试剂盒包含:
[0035](a)反转录酶；
[0036](b) RNA 酶抑制剂；
[0037](c)反转录5 X缓冲液；
[0038](d)目的基因反转录引物和PCR上游引物和下游引物:
[0039]RIG-1 反转录引物为:01igo (dT)；
[0040]PCR上游引物如SEQ ID NO:1所示；
[0041]PCR下游引物如SEQ ID NO: 2所示；
[0042](e)内参反 转录引物和PCR上游引物和下游引物:
[0043]内参β-actin的反转录反应引物为:01igo (dT)；
[0044]PCR上游引物如SEQ ID NO: 3所示；
[0045]PCR下游引物如SEQ ID N0:4所示；
[0046](f) 10 X PCR 缓冲液；
[0047](g) dNTP ；
[0048](h)Taq DNA 聚合酶。
[0049]所述的检测试剂盒，通过以下步骤可用于肿瘤诊断或肿瘤预后评估:(a)检测生物样品(组织或细胞)中的模式识别受体RIG-1表达量；(b)将(a)中检测到的模式识别受体RIG-1表达量与正常对照值进行比较。
[0050]得到的检测结果显示生物样品中的RIG-1分子的水平低于正常对照的，则提示所述生物样品的对象存在肿瘤、或肿瘤预后不良。
[0051]肿瘤预后不良，表现为 ?与RIG-1分子的水平未降低的患者相比生存期缩短、易发肝硬化、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、门静脉癌栓出现比例增加、或TNM分级上升。
[0052]上述步骤(a)中检测的RIG-1分子的水平至少比正常对照值低10_50%，优选20-40%,更优选 30-35%。
[0053]所述的正常对照值为:由非肿瘤的正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的RIG-1分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
[0054]在本发明中，正常对照值，是经qRT-PCR检测，，并使用SPSS17.0中的T test计算得到的值，具体相对定量值为-6.7 (相对于对照基因β-actin)。
[0055]本发明人经过长期而深入的研究发现:肿瘤患者的肿瘤组织中RIG-1分子的表达会显著下调，且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性，其低表达与患者的预后差显著相关，从而证实了 RIG-1分子在肿瘤进展和患者预后中起重要作用。发明人在此基础上进行进一步的研究发现=RIG-1分子可在体、内外有效抑制肿瘤细胞的繁殖和生长，从而发挥抗肿瘤的作用。由此，发明人发现了 RIG-1分子在用于对象中肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，从而在此基础上完成了本发明。
[0056]如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本
上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构
成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0057]检测试剂
[0058]如本文所用，术语“检测试剂”或“检测RIG-1分子的试剂”或“检测生物样品中模式识别受体RIG-1表达量的试剂”可互换使用，均是指特异性针对RIG-1分子，且可用于直接或间接检测出RIG-1分子的存在和/或含量的试剂。
[0059]由于RIG-1分子的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对RIG-1分子的试剂。例如，本发明中可用的检测试剂包括但不限于:对RIG-1分子具有检测特异性的探针、基因芯片、或PCR引物，如RIG-1分子的反义序列、本发明实施例中所用的SEQ ID N0:2-4所示的序列、寡核苷酸或其他引物序列。
[0060]为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于:放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。
[0061]本发明的检测试剂可存在于溶液中、固定于载体(如基片、吸附物)上或以其它本领域中常规的方式存在，只要该存在方式适于对生物样品中RIG-1分子的检测即可。例如，当本发明的检测试剂为核苷酸探针时，其可以生物芯片(或称“微阵列”)的形式存在。
[0062]检测试剂盒和生物 样品
[0063]本发明中还提供了一种检测试剂盒，其包含:(i)检测有效量的检测RIG-1分子的一种或多种试剂；(ii)选自下组的一种或多种物质:容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
[0064]本发明的检测试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择和/或对预后进行评估。
[0065]采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测RIG-1分子:实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。
[0066]生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印迹法和原位杂交法可参考《分子印迹技术》刘朝奇等主编,化学工业出版社出版。
[0067]当然，所述试剂盒还包含临床上用于对象中肿瘤发展的判断、治疗方案的选择和/或预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测RIG-1分子所得到的结果。本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。
[0068]如本文所用，术语“生物样品”或“待测样品”可互换使用，均是指获自对象且用于RIG-1分子检测的样品。生物样品可以是获自对象的新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织、体液、血液、或细胞等，优选为新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液、RNA提取物等适于检测的各种形式存在，例如可在检测前抽提组织或细胞中的总RNA。
[0069]用于肿瘤诊断或肿瘤预后评估
[0070]通常，可利用本发明的检测试剂盒，采用如下方法进行肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估:(a)从对象获得待测样品；(b)使待测样品与本发明检测试剂盒中的检测试剂接触；(C)检测该待测样品中RIG-1分子的水平，并将该水平与对照水平相比较；(d)根据检测结果进行肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估:如检测结果显示对象组织中的RIG-1分子的水平低于对照水平，则提示所述对象已患有肿瘤、适于采用提高RIG-1分子的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良。
[0071]如本文所用，术语“正常对照”是指用作参照的RIG-1分子的水平，其包括但不限于:由同一对象的非肿瘤正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的RIG-1分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
[0072]可用于提示所述对象已患有肿瘤、适于采用提高RIG-1分子的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良的水平差异可为:待测样品中的RIG-1分子水平比对照水平低
10-50%,优选 20-40%，更优选 30-35%。
[0073]如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本发明中所述的预后不良包括但不限于:生存期缩短、易发肝硬化、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、门静脉癌栓出现比例增加、TNM分级上升等。在预测了患者预后情况后，可结合提高RIG-1分子的量的治疗方法改善患者的预后。
[0074]本发明的有益效果 在于:
[0075]本发明揭示了 RIG-1分子在肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，为RIG-1样受体、乃至其它模式识别受体的研究和开发利用提供了新的思路和途径；
[0076]本发明的RIG-1分子可有效用于肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的肿瘤诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0077]图1:RIG_I在HCC组织与癌旁组织中的表达情况的qRT-PCR检测，其中图1A为组
I;图1B为组2 ;P值使用SPSS17.0中的T test计算。
[0078]图2 =HCC中RIG-1的表达与患者无瘤生存时间的Kaplan-Meier生存曲线，其中图2A为组I ;图2B为组2 ；P值使用SPSS17.0中的log-rank test计算。
[0079]图3 =HCC中RIG-1的表达与患者总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线，其中图3A为组I ;图3B为组2 ；P值使用SPSS17.0中的log-rank test计算。
【具体实施方式】
[0080]现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0081]本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆:实验室指南》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。[0082]实施例1:检测试剂盒的制备
[0083]按如下组成制备检测试剂盒，该试剂盒适于以实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中RIG-1的表达:
[0084](a)装有反转录酶(200U/ μ I)的容器；
[0085](b)装有RNA酶抑制剂(40U/ μ I)的容器；
[0086](c)装有反转录 5Χ 缓冲液(75mM KCl, 5 O O mMTris-Cl, ρΗ8.3，25°C，3mMMgCl2, IOmM DTT)的容器；
[0087](d)装有目的基因反转录引物和PCR上游引物和下游引物(10 μ M)的容器=RIG-1反转录引物为:01igo (dT)；
[0088]定量PCR引物:
[0089]5，-TGT GCT CCT ACA GGT TGT GGA-3，(上游，SEQ ID NO:1)和
[0090]5，-CAC TGG GAT CTG ATT CGC AAA A-3，(下游，SEQ ID NO:2)；
[0091](e)装有内参反转录引物和PCR上游引物和下游引物(ΙΟμΜ)的容器:内参β -actin的反转录反应引物为:01igo (dT)；
[0092]定量PCR引物为:
[0093]5，-ACA ATG AGC TGC TGG TGG CT-3，(上游，SEQ ID NO:3);和
[0094]5，-GAT GGG CAC AGT GTG GGT GA-3，(下游，SEQ ID NO:4)；
[0095](f)装有 IOXPCR 缓冲液(50mM KCl, IOOmM Tris-Cl, ρΗ9.0, 25 °C，1.0%TritonX-100)；
[0096](g)装有dNTP (每种IOmM)的容器；
[0097](h)装有Taq DNA聚合酶(3U/ μ I)的容器；
[0098](i)装有荧光染料(SYBR I)的容器；以及
[0099](j)使用说明书。
[0100]实施例2 =RIG-1表达量与HCC的关系
[0101]采用实时定量反转录PCR (qRT-PCR)方法，用实施例1中的检测试剂盒对1999至2006年收集的两组共292例HCC患者的HCC组织与癌旁组织中RIG-1 mRNA水平的表达进行了分析(组I组织切片来自广州中山大学，组2组织切片来自广西医科大学附属医院)。
[0102]采用TRIzol (Invitrogen公司)抽提组织总RNA。qRT-PCR采用实施例1的测试试剂盒在LightCyclerl.5 (Roche公司)实时定量PCR仪上完成。
[0103]RIG-1的相对定量使用2_Δ "ct法计算(β -actin为内参)(Livak，KJ.等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe2-Δ Δ Ct method.Methods.2001 ；25:402_408)。
[0104]qRT-PCR分析结果发现，与癌旁非肿瘤组织相比，各组中RIG-1在HCC组织中表达均降低(图1)。
[0105]将组I中152例HCC患者按RIG-1表达中位数分为高低两组，各76人；组2中140例HCC患者按RIG-1表达中位数分为高低两组，各70人。分别对RIG-1的低表达与患者生存时间的相关性进行分析，P值使用SPSS17.0中的log-rank test计算,结果分别如图1A和图1B所示。
[0106]结果发现=RIG-1的低表达与患者更低的无瘤生存时间显著相关(图2A和图2B)。[0107]结果发现:RIG_I的低表达与患者更低的总体生存时间显著相关(图3A和图3B)。
[0108]对影响HCC预后的危险因素进行Cox回归分析，危害比(95%可信区间)和P值使用SPSS17.0中的单因素和多因素Cox回归分析计算。表1-4示出了影响HCC患者预后危险因素的单因素和多因素Cox回归分析结果，其中HCC患者两组共计292例(与图1相同)。HCC中RIG-1的表达量分组见图1。多因素分析使用了年龄性别校正。
[0109]表1影响组IHCC患者无瘤生存危险因素的单因素和多因素Cox回归分析
【权利要求】
1.模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包含检测生物样品中模式识别受体RIG-1表达量的试剂。
3.根据权利要求2所述的模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，其特特征在于，所述的检测生物样品中模式识别受体RIG-1表达量的试剂，选自:对RIG-1具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
4.根据权利要求2所述的模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂为SEQ ID NOs: 1-4所示的序列、RIG-1的反义序列、寡核苷酸，或引物序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品选自:获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
6.根据权利要求1-4任一所述的模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌。
7.根据权利要求6所述的模式识别受体RIG-1在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述的肝癌选自:原发性肝癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、转移性肝癌，或继发性肝癌。
8.—种检测试剂盒,其包含: (i)检测生物样品中模式识别受体RIG-1表达量的一种或多种试剂； (?)选自下组的一种或多种物质:容器、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂、溶剂，或使用说明书。`
9.根据权利要求8所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂还带有可检测标记，所述的可检测标记选自:放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子，或配体。
10.根据权利要求8所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒，检测模式识别受体RIG-1的方法选自:实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法，或RNA印记法原位杂交法。
【文档编号】C12Q1/68GK103695543SQ201310688018
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】周烨, 曹雪涛, 侯晋 申请人:中国人民解放军第二军医大学