基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶及制备方法和应用，制备方法如下：（1）将连接肽与自聚集短肽拼接，构建得到表达载体；（2）将腈水解酶基因与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得工程菌；（3）上述工程菌诱导表达后，对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即腈水解酶体内酶聚集体；（4）将得到的腈水解酶体内酶聚集体在海藻酸盐中固定化，得到固定化腈水解酶。本发明固定化所得腈水解酶聚集体，固定化酶颗粒直径约1mm。该固定化该颗粒可以冻干保存，在37℃情况下保存20天，酶活保留90%，而且固定化的腈水解酶酶活性高，操作流程简单。
【专利说明】基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程、生物催化领域。本发明涉及一种基于自聚集短肽诱导的腈水解酶聚集表达，再固定化的方法。更具体的，本发明构建了一种以体内酶聚集体形式表达的腈水解酶基因工程菌，将该具有腈水解酶活性的聚集体在海藻酸钠溶液中固定，在水溶液中催化外消旋腈类化合物转化为对应的羧酸。
【背景技术】
[0002]腈水解酶(Nitrilase)在水溶液中可通过一步催化反应，将腈转化为相应的羧酸和氨。近年来，许多专家学者利用腈水解酶催化脂肪腈、芳腈和脂环腈等生成相应有机羧酸生物转化过程，而且已有在工业生产上应用非常成功的例子。
[0003]近些年来生物催化的快速发展已成为化学品合成的重要途径之一。腈水解酶因其具有广泛的底物适应性，反应产物羧酸是有机合成中的重要中间体，使得腈水解酶在有机合成中表现出巨大的潜力。但腈水解酶的稳定性差是限制其进一步推广应用的瓶颈(Enzymes in Organic Chemistry.Wiley-VCH-Verlag, 2005)。Bernner 研究小组推测，臆水解酶催化活性部分含有Glu-Lys-Cys残基，而其中的Cys残基对氧化剂敏感，易发生自氧化，从而降低腈水解酶的稳定性(Curr.0pin.Struct.Biol.，2002，12:775-782)。因此工业应用中多采用固定化方法以提高腈水解酶的稳定性。
[0004]欧洲专利(EP2338987)利用将腈水解酶表达于膜上的全细胞催化方法催化产R-扁桃酸，但该专利没有讨论其酶活保留率，而且底物耐受性也较差。陈敬华等人(CN102120994)用海藻酸盐/PEG400固定化表达腈水解酶的E.coli，该方法也未提及固定化后腈水解酶的酶活保留率及稳定性。总体来讲，全细胞固定化腈水解酶方法，一方面由于存在底物跨膜运输屏障，导致酶催化效率降低；此外，由于受细胞内腈水解酶表达量限制，导致固定化酶的负载量不高；而且由于细胞内其他酶的存在，也可能产生底物竞争抑制，产物成分复杂 化，限制了其在药品及食品行业的应用。
[0005]鉴于此，有研究者近年开发出新的酶固定化方法，通过在E.coli胞内可溶表达腈水解酶，纯化后用沉淀剂处理，再用戊二醛、聚乙烯亚胺等交联剂对沉淀的酶进行交联形成交联聚集体(Cross-Linked Enzyme Aggregations, CLEAs),实现对腈水解酶的固定化(Biotechnol.Bioeng.2004, 86, 273-276)。Mateo 等人使用交联剂聚醒葡聚糖(dextranpolyaldehyde,DPA)对腈水解酶进行固定化,优化后酶活保留率为50~60% (Biotechnol.Bioeng.2004,86:273_276)。采用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)为交联剂，固定化的腈水解酶最大酶活保留率略有提高，达64% (J.Mol.Catal.B:Enzymatic, 2006，38:154-157)。Baner jee等人系统研究了来源于Pseudomonas putida MTCC5110的腈水解酶在E.coli中表达,通过CLEAs方法,通过对沉淀剂和交联剂的优化,腈水解酶活力保留达70%,但固定化后酶的温度稳定性较差(Adv.Synth.Catal.2007, 349:2167 - 2176 ；BioresourceTechnol.,2010,101:6856 - 6858)。CLEAs方法固定化腈水解酶，因需对沉淀剂和交联剂进行摸索，且交联过程会在一定程度上“锁定”酶的结构，导致交联后酶活损失较大。并且由于CLEAs方法获得的固定化酶颗粒较小(直径20-60 μ m)，不利于酶的回收再利用。
[0006]如前所述，开发高负载量、高酶活保留率、重复利用次数多的腈水解酶固定化方案，将有助于推动腈水解酶在生物催化有机合成羧酸类药物中间体的应用开发。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有腈水解酶固定化方法的缺点，提供一种基于自聚集短肽诱导聚集的腈水解酶固定化方法。更具体的，本发明构建了一种以体内酶聚集体形式表达腈水解酶的重组菌，通过细胞破碎离心获得活性腈水解酶聚集体颗粒，进一步采用海藻酸钠包埋获得高酶负载量、高酶活回收率、利于多次重复利用的固定化方法。
[0008]本发明的另一个目的在于提供上述方法制得的固定化腈水解酶。
[0009]本发明的再一个目的在于利用上述固定化腈水解酶催化外消旋扁桃腈水解生成R-扁桃腈的应用。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0011]一种基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶的制备方法，包括如下步骤:
[0012](I)将连接肽与自聚集短肽拼接，连接顺序为连接肽-自聚集短肽，构建得到表达载体；
[0013](2)将腈水解酶基因(Nit)与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得能表达腈水解酶-短肽融合蛋白的工`程菌；
[0014](3)上述工程菌诱导表达后，对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即腈水解酶体内酶聚集体；
[0015](4)将得到的腈水解酶体内酶聚集体，在海藻酸盐中固定化，得到乳白色固定化腈水解酶。
[0016]所述表达载体为可在E.coli中过量表达的诱导型载体，该载体特征为其含有下拉标签。所述的载体含有下拉标签序列不重要，只要其具有诱导目的蛋白在E.coli体内自聚集为活性聚集体即可，所述自聚集短肽序列包括但不局限于口蹄疫病毒衣壳蛋白VPl(foot-and-mouth disease virus capsid protein VP1)、人 β -淀粉样蛋白 A β 42 (F19D)(Human β -amyloid peptide Αβ42)、麦芽糖结合蛋白突变体(Maltose-bindingprotein mutant, MalE31 )、纤维素结合域(Cellulose-binding domain, CBDclos)、类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)、ELK16、L6KD> 18A,优选 18A,其序列为EffLKAFYEKVLEKLKELF (SEQ2)。
[0017]所述的腈水解酶基因，并不严格要求恰好为腈水解酶编码基因的开放阅读框，只要该序列插入表达载体可正常转录翻译出腈水解酶编码氨基酸序列即可。优选腈水解酶编码基因的开放阅读框。所述腈水解酶基因可选自于粪产碱杆菌Alcaligenes faecalisJM3,敏捷食酸菌Acidovorax facilis ATCC55746,不动杆菌Acinetobacter AK226,农杆菌Agrobacterium sp.DSM6336,产喊杆菌Alcaligenes sp.ECU0401,拟南芥菜Aradobidopsisthaliana,幾产喊菌 Alcaligenes faecalis DSM6335,突光假单胞菌 Pseudomonasfluorescens DSM7155。
[0018]步骤(2)所述的受体菌，只要步骤(1)所述的表达载体可在其体内表达即可，包括但不局限于 E.coli DH5a ,E.coli JM109, E.coli JM110, E.coli T0P10, E.coliBL21, E.coli BL21 (DE3)，Ε.coli BL21 (DE3)/pLysS, Ε.coli BL21Rosetta, Ε.coliBL21Rosetta(DE3)，优选 E.coli BL21 (DE3)。
[0019]步骤(2)所述的转化方法为热激法，CaCl2方法、电转化方法等现有方法。
[0020]步骤(3)所述对细胞进行破壁处理方法，包括但不局限于超声破碎法、溶菌酶破壁法、高压破碎法等，及其上述方法的组合，优选为超声破碎法。
[0021]步骤(4)所述固定化的方法如下:将腈水解酶体内酶聚集体与海藻酸钠溶液按体积比1:5-5:1充分混合，海藻酸钠溶液浓度为2-5%，采用氮气剥离的方法，滴至浓度为
0.1-lmol/L的CaCl2溶液中固定45~180min即可。
[0022]所述腈水解酶体内酶聚集体与海藻酸钠溶液的体积比为1:1，海藻酸钠溶液浓度为3% ；CaCl2的浓度为0.5mol/L,固定时间为90min。
[0023]固定化腈水解酶颗粒直径为0.3~3mm。
[0024]所述固定化腈水解酶颗粒直径为1mm。
[0025]以扁桃腈为底物，用固定化的腈水解酶聚集体在水相体系催化反应制备R-扁桃酸。反应体系如下:pH为4~10的缓冲液，初始浓度25~lOOmmol/L的扁桃腈，反应温度为10°C~65°C。所述反应体系扁桃腈终浓度范围为10~200mmol/L，优选为100mmol/L。
[0026]所述的缓冲液不重要，只要其可以控制缓冲液pH为目标pH即可，所述的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液。优选Tris-HCl缓冲液。
[0027]所述的缓冲液优选ρΗ7.5。
[0028]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0029]１)固定化操作简单。该方法通过自聚集短肽诱导腈水解酶在大肠杆菌体内聚集为活性颗粒，通过常规的细胞破碎离心即可获得纯度大于95%的活性腈水解酶。由于本发明活性聚集体具有强的机械操作稳定性，足以承受超声，高压或其他强烈的物理破碎细胞过程，因此可通过简单的细胞破碎、离心操作即可获得纯度较高的蛋白样品，从而省去了传统CLEAs酶固定化过程中需外加沉淀剂的繁琐操作，同时避免了沉淀剂对酶催化活力的影响。
[0030]2)酶固定化颗粒的酶活保留率高，稳定性好，便于保存，可多次重复利用，底物耐受性较好，立体选择性好(e.e≥99.5%)。
[0031]3)本发明E.coli体内形成的纳米尺度(50_500nm)聚集体具有多孔性，有利于底物和产物的高效传递。此外，该活性聚集体的水溶性较差，有利于长期储存；因此，该固定化方法有利于推进腈水解酶的工业应用，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为pET-alB载体图谱。
[0033]图2为腈水解酶纯度的SDS-PAGE检验。其中I为Nit-18A，即融合有18A标签的腈水解酶，2为纯化后的Nit，即通过镍柱亲和纯化获得的未融合18A标签的腈水解酶。
[0034]图3为腈水解酶固定化前后酶活稳定性研究。其中Nit表示普通重组表达的腈水解酶，即通过镍柱亲和纯化获得的未融合18A标签的腈水解酶，Nit-1SA表示融合有18A标签的腈水解酶；Nit-1SEA表示Nit-1SA经海藻酸钙法固定化的样品。普通表达的腈水解酶(Nit)在时间点为O时的酶活定义为100%。[0035]图4Nit_iSEA重复利用酶活保留情况。第一次反应酶活定义为100%。
[0036]图5不同扁桃腈浓度条件下Nit-1SEA的催化情况。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0038]所采用的腈水解酶基因来源于粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis JM3,其基因在NCBI数据库ID为D13419.1(见SEQ1)。下述实施例中有未注明具体条件的实验方法，则是按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。
[0039]实施例1
[0040]1、含有编码短肽的表达载体的构建
[0041]根据PT-1inker及18A的氨基酸序列，在基因合成公司合成相应的DNA序列PT-linker+18A，在PT-linker+18A DNA序列的上游引入Hind III酶切位点，下游引入XhoI酶位点。以质粒pET-30a(+)为基本质粒，用Hind II1、XhoI双酶切，连接入相应酶切的PT-1inker+18A序列，转化至E.coli DH5 α感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到质粒pET-alB，如图1所示。
[0042]2、大肠杆菌胞内表达腈水解酶活性聚集体工程菌的构建
[0043]以粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis JM3)的基因组为模板,在引物1、引物2的作用下PCR扩增长约Ikb的腈水解酶基因片段。
[0044]引物1:5' ~TTAGCCCCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG~3/。下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点。
[0045]引物2:5' ~TCTGTAAGCTTGGACGGTTCTTGCACCAGTAG~3/ 下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点。
[0046]纯化的PCR产物、pET-30a和pET-alB载体分别用Nde I和Hind III双酶切，纯化后连接转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子 E.coli BL21(DE3)/pET-Nit 和 E.coli BL21 (DE3)/pET_Nit_18A。
[0047]3、腈水解酶聚集体的获得
[0048]步骤2 所得的工程菌 E.coli BL21(DE3)/pET-Nit 和 E.coliBL21 (DE3) /pET-Nit-18A分别接种在含有50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，培养至OD6tltl达到0.4-0.6，加入终浓度为0.lmmol/L IPTG，在22°C、180rpm条件下诱导22小时。离心收获菌体，采用溶菌酶和/或超声波破碎，高速离心。对E.coli BL21(DE3)/pET-Nit保留上清，采用镍柱亲和层析纯化常规可溶表达的腈水解酶(标记为Nit)。对E.coli BL21(DE3)/pET-Nit-18A 去除上清，沉淀用用含有 0.8%(v/v) Triton X-1OO 的 Tris-HCl (ρΗ7.5)缓冲液洗涤I次，再用ΡΗ7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，所得样品即为纯度大于95%的腈水解酶聚集体NU-18A。见图2。
[0049]4、 腈水解酶聚集体的固定化
[0050]将获得的NU-18A与3%(ν/ν)海藻酸钠溶液，按体积比1:1充分混合，采用氮气剥离方法，滴至2mol/L CaCl2溶液中固定。在固定90min后，去除CaCl2溶液，换成Tris-HCl(pH7.5)缓冲液洗涤两次，制备获得固定化的Nit-1SEA。操作过程中，控制Nit-1SEA颗粒直径约为1mm。将Nit-1SEA于10% (v/v)蔗糖中冷冻干燥，保存于-80°C备用。使用时取适量在pH7.5的Tris-HCl中浸泡至颗粒溶胀，再用pH7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤I次进行后续反应。
[0051]研究表明，腈水解酶聚集体经海藻酸钙包埋固定化后，酶活保留率为85-90%。
[0052]5、腈水解酶酶活的测定
[0053]以扁桃腈为底物，用游离的腈水解酶(Nit)和固定化的腈水解酶聚集体(Nit-1SEA)在水相体系催化反应制备R-扁桃酸。 [0054]反应体系如下(ImL):50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5), 30mmol/L扁桃腈，2(^8酶，37 1:、200卬111条件下反应201^11，加入10(^1^111101/1 HCl 终止反应。15000g离心2min，取上清检测底物转化率。R-扁桃酸含量测定采用HPLC法及外标定量法(J.Biotechnol.,2011, 152:24-29)。酶活单位(U)定义为:在 37°C ρΗ7.5 条件下，Imin 内催化扁桃腈生成I μ mol扁桃酸所需要的酶量。扁桃酸的手性纯度测定采用HPLC法(Appl.Microbiol.Biot., 2012, 95:91-99)。
[0055]研究表明，本发明构建获得的可溶表达腈水解酶(Nit)比酶活为19.8U/mg，ee≥99.5% ;游离的腈水解酶聚集体(Nit_18A)比酶活为15.4U/mg, ee≥99.5%。
[0056]6、腈水解酶聚集体固定化前后温度稳定性研究
[0057]Nit-18A，Nit-1SEA, Nit 分别于 4°C、37°C条件下放置 1、2、3、5、8、10、15、20 天后，
测定酶活保留率。结果如图3所示，可溶表达的腈水解酶(Nit)在4°C条件下保存5天，酶活损失接近50%。游离的腈水解酶聚集体(Nit-1SA)在37°C条件下保存20天，酶活保留达85%。而海藻酸钙固定化的腈水解酶聚集体(Nit-1SEA)在37°C条件下保存20天，酶活保留率接近95%。由此可见，在腈水解酶(Nit) C端添加18A短肽(NU-18A)以及Nit_18A经海藻酸钙固定化，有助于提高腈水解酶的温度稳定性。
[0058]7、Nit-1SEA重复利用效果评估
[0059]取适量固定化的腈水解酶聚集体Nit-1SEA，依照步骤5进行多次扁桃腈水解生成R-扁桃酸的催化反应，评估其重复利用酶活保留率。结果表明，海藻酸钙包埋固定化的腈水解酶聚集体，重复利用20次没有明显酶活损失，酶活保留率超过90%。如图4所示。
[0060]8、Nit-1SEA底物浓度耐受能力评估
[0061]在IOml体系中，取20mg步骤4所制得的Nit-1SEA分别于含有25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、lOOmmol/L 扁桃腈的 50mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.5)中，于 40°C、200rpm 的条件反应 20min、40min、60min、90min、120min> 150min> 180min>240min,分别取样进行检测，酶活测定如步骤5中所述，见图5。在lOOmmol/L的高浓度扁桃腈底物情况下，催化水解4h，转化率>75%。表明Nit-1SEA短肽诱导及包埋固定化后，底物耐受性明显提高，而且在高浓度的底物下依然保持很好的底物转化率。
【权利要求】
1.一种基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将连接肽与自聚集短肽拼接，连接顺序为连接肽-自聚集短肽，构建得到表达载体； (2)将腈水解酶基因与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得能表达腈水解酶-短肽融合蛋白的工程菌； (3)上述工程菌诱导表达后，对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即腈水解酶体内酶聚集体； (4)将得到的腈水解酶体内酶聚集体，在海藻酸盐中固定化，得到乳白色固定化腈水解酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自聚集短肽序列为口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、人β -淀粉样蛋白Αβ 42(F19D)、麦芽糖结合蛋白突变体、纤维素结合域、类弹性蛋白多肽、ELK16、L6KD或18A。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶基因来源于粪产碱杆菌 Alcaligenes faecalis JM3,敏捷食酸菌 Acidovorax facilis ATCC55746,不动杆菌 Acinetobacter AK226,农杆菌 Agrobacterium sp.DSM6336,产喊杆菌 Alcaligenessp.ECU0401,拟南芥菜 Aradobidopsis thaliana,幾产喊菌 Alcaligenes faecalisDSM6335,突光假单胞菌 Pseudomonas f luorescensDSM7155。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述受体菌包括E.coli DH5 α , Ε.coli JM109, E.coli JM110, E.coli T0P10, E.coli BL21, E.coli BL21 (DE3)，Ε.coliBL21(DE3)/pLysS, E.coli BL21Rosetta, E.coli BL21Rosetta(DE3)。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固定化的方法如下: 将腈水解酶体内酶聚集体与海藻酸钠溶液按体积比1:5-5:1充分混合，海藻酸钠溶液浓度为2-5%，采用氮气剥离的方法，滴至浓度为0.1-lmol/L的CaCl2溶液中固定45~180min 即可。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶体内酶聚集体与海藻酸钠溶液的体积比为1:1，海藻酸钠溶液浓度为3%;CaCl2的浓度为0.5mol/L，固定时间为90mino
7.权利要求1~6任一项方法制备的固定化腈水解酶，其特征在于，固定化腈水解酶颗粒直径为0.3~3mm。
8.权利要求7所述固定化腈水解酶，其特征在于，所述固定化腈水解酶颗粒直径为Imnin
9.权利要求7或8所述固定化腈水解酶的应用，其特征在于，以扁桃腈为底物，用固定化的腈水解酶聚集体在水相体系催化反应制备R-扁桃酸。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，反应体系如下:pH为4~10的缓冲液，初始浓度25~lOOmmol/L的 扁桃腈，反应温度为10°C~65°C。
【文档编号】C12N11/10GK103757042SQ201410019182
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】李爽, 杨晓锋, 林章凛, 王菊芳, 王小宁 申请人:华南理工大学, 清华大学