尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其通过使用hMeDIP-Chip技术得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因，深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明尿毒症的发病机理，为尿毒症的诊断和治疗提供新途径。上述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种尿毒症差异表达基因的图谱模型，获取作为中间结果的尿毒症的相关信息。
【专利说明】尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及表观遗传学研究领域，尤其是涉及一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用。
【背景技术】
[0002]慢性肾衰竭是指各种肾脏病导致肾脏功能渐进性不可逆性减退，直至功能丧失所出现的一系列症状和代谢紊乱所组成的临床综合征，简称慢性肾衰。慢性肾衰的终末期即尿毒症。尿毒症不是一个独立的疾病，而是各种晚期的肾脏病共有的临床综合征，是慢性肾功能衰竭进入终末阶段时出现的一系列临床表现所组成的综合征。
[0003]慢性肾脏疾病(CKD)是复杂的疾病，近几十年来，其发病率逐年增长，调查结果发现中国人群中CKD的发病率为11.8%—13.0%，预测在全国范围内CKD患者已超过I亿。我国的尿毒症患者在100万以上,此类患者每年治疗总费用将超过500—1000亿元，因而解决好肾脏疾病的早期预警和有效防治问题有重要的意义。目前临床上尚缺乏早期诊断手段和行之有效治疗方法，其中部分患者进展至尿毒症。CKD患者发病较隐匿，疾病的发生往往先是功能和分子的变化，继而是形态学的改变，很多患者首诊时就已经出现肾病综合征或肾小球肾炎的临床症状。因此，有必要用创新的方法寻找并发现尿毒症特异性的生物标志物。
[0004]表观遗传学是研究DNA序列没有发生改变的情况下而基因表达和表型却发生可遗传改变的学科。这种变化涉及组蛋白修饰，主要包括乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化。研究表明，表观遗传异常与尿毒症发病相关，表观遗传学研究的发病机制密切相关可能为阐明尿毒症的发病机制和开发新的策略来治疗这种疾病的线索。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用。
[0006]一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，包括如下步骤:
[0007]分别采集尿毒症患者和健康人的血液样本，并从所述血液样本中提取DNA ；
[0008]将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段，并加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链作为阳性对照；
[0009]将含有所述阳性对照的所述DNA片段加热变性，再将得到的单链DNA样本分成两份，其中一份作为实验组加入抗5’-羟甲基化胞嘧啶核苷抗体得到DNA片段抗体复合物，另一份作为对照组，记为Input，其中，实验组用免疫磁珠法分离所述DNA片段抗体复合物，共沉淀后非羟甲基化的DNA片段被清洗除去，得到纯化的DNA片段抗体复合物，记为hMedIP ；
[0010]对上述实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段进行扩增；
[0011]对扩增后的实验组DNA片段抗体复合物和对照组DNA片段分别使用Cy5和Cy3染料标记；
[0012] 将染料标记后的实验组DNA片段抗体复合物与对照组DNA片段混合后与羟甲基化微阵列检测芯片杂交，使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果，得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因。
[0013]在其中一个实施例中，在将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段之前，所述分析方法还包括对提取的DNA使用NanoDrop ND-100分析仪测定所述DNA的数量和质量以及用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性的步骤。
[0014]在其中一个实施例中，在对上述实验组纯化的DNA片段和对照组的DNA片段进行扩增之前，所述分析方法还包括对免疫磁珠法分离得到的DNA片段抗体复合物的富集效率进行评估的步骤。
[0015]在其中一个实施例中，所述使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果包括如下步骤:
[0016]使用高解析度芯片扫描仪分别检测尿毒症患者组与健康人的芯片杂交信号，获取Cy3及Cy5的荧光扫描图像；
[0017]使用Bioconductor packages Ringo、Iimma 及 MEDME 对杂交结果进行数据提取、标准化和峰值分析；
[0018]经过校正得到所述羟甲基化微阵列检测芯片上每个检测探针的log2(hMeDIP/Input)值以及p-value值，log2 (hMeDIP/Input)值代表每个探针在实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段中的相对富集强度，p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率，P-value由修正的KS检验算法计算。
[0019]在其中一个实施例中，所述分析方法还包括在筛选得到所述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因之后针对筛选得到的差异表达基因使用实时荧光定量PCR对hMeDIP-Chip分析结果进行验证的步骤。
[0020]上述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法通过使用hMeDIP-Chip技术来分析尿毒症羟甲基化状态的改变，得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因，深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明尿毒症的发病机理，为尿毒症的诊断和治疗提供新途径。上述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种尿毒症差异表达基因的图谱模型，获取作为中间结果的尿毒症的相关疾病信肩、O
[0021]一种基因检测芯片，所述基因检测芯片上固定有上述任一实施例所述的方法得到的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因。
[0022]在其中一个实施例中，所述差异表达基因为HMGCR、THBD及STAT3中的至少一种。
[0023]通过上述基因检测芯片，可以为初步诊断尿毒症提供中间结果信息，检测过程方便，不需要使用传统的繁杂的检测步骤，但由于尿毒症往往是一种综合病征，获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是尿毒症疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为hMeDIP-Chip技术在 全基因组范围内分析尿毒症患者5_hmC状态技术路线图；
[0025]图2为尿毒症患者和健康人的总DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
[0026]图3为尿毒症组的芯片杂交结果图；[0027]图4为健康对照组的芯片杂交结果图；
[0028]图5为19号染色体上(Chr 19)存在5_hmC水平差异的位点分析；
[0029]图 6 为 5-hmC、un5_hmC 基因在 HCP、ICP、LCP 分布；
[0030]图7为HCP、ICP、LCP的羟甲基化状态；
[0031]图8为HCP、ICP、LCP中羟甲基化基因所占总数比例；
[0032]图9为在启动子(promoter，下同)区(_800bp的~+200bp)，5_hmC基因在HCP、ICP、LCP分布情况；
[0033]图10为CpG岛上5-hmC、un5_hmC基因的分布情况,其中两个intergenic表示CpG岛上 5_hmC、un5-hmC 基因；
[0034]图11为启动子区表达上调基因在各染色体上的分布(顺时针从I号染色体X和Y性染色体);
[0035]图12为CpG岛表达上调基因在各染色体上的分布(顺时针从I号染色体X和Y性染色体);
[0036]上述图中，纵坐标Enrichment peaks表示扫描图像中的富集峰值，黑色表示尿毒症组的羟甲基化，灰色表示健康对照组的羟甲基化，ALL代表所有DNA片段，Hydroxymethylated表不轻甲基化，Unhydroxymethylated表不轻甲基化表不未甲基化，下同。
【具体实施方式】
[0037]下面主要结合附图及具体实施例对尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用作进一步详细的说明。
[0038]一实施方式尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其包括如下步骤:
[0039]步骤SllO:分别采集尿毒症患者和健康人的血液样本。
[0040]血液样本可以直接采集自患者或者健康人，也可以取自医院或研究机构的血液样本库。
[0041]步骤S120:从血液样本中提取DNA。
[0042]优选的，在本步骤提取DNA之后还包括使用NanoDrop ND-100分析仪测定提取的DNA的数量和质量以及使用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA的完整性进行评估的步骤。
[0043]步骤S130:将DNA消化成200~1000bp的DNA片段，并加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链作为阳性对照。
[0044]在本实施方式中，使用Mse I限制性内切酶将DNA消化成小DNA片段。76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链可选用市售的通用完全羟甲基化的寡核苷酸链。76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链可选用市售的通用完全羟甲基化的寡核苷酸链。
[0045]步骤S140:将含有阳性对照的DNA片段加热变性，再将得到的单链DNA样本分成两份，其中一份作为实验组加入抗5’-羟甲基化胞嘧啶核苷抗体得到DNA片段抗体复合物，另一份作为对照组，记为Input，其中，实验组用免疫磁珠法分离DNA片段抗体复合物，共沉淀后非羟甲基化的DNA片段被清洗除去，得到纯化的DNA片段抗体复合物，记为hMeDIP。
[0046] 因目前在人类基因组中发生羟甲基化的特定基因未明确，发生羟甲基化水平也未知，而将基因片段上芯片与芯片上探针杂交，需要对羟甲基化水平有一定的要求，因此，在本实施方式中，当得到纯化的DNA片段抗体复合物之后,该分析方法还包括使用NanoDropND-1000光谱分析仪对该DNA片段抗体复合物的富集效率进行评估的步骤。
[0047]步骤S150:使用Sigma WGA Kit对上述实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段进行扩增。
[0048]步骤S160:对扩增后的实验组DNA片段抗体复合物和对照组DNA片段分别使用Cy5和Cy3染料标记。
[0049]步骤S170:将染料标记后的实验组DNA片段抗体复合物与对照组DNA片段混合后与羟甲基化微阵列检测芯片杂交，使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果，得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因。
[0050]在本实施方式中，所述使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果包括如下步骤:
[0051]使用高解析度芯片扫描仪分别检测尿毒症患者组与健康人的芯片杂交信号，获取Cy3及Cy5的荧光扫描图像；
[0052]使用Bioconductor packages Ringo、Iimma 及 MEDME 对杂交结果进行数据提取、标准化和峰值分析；
[0053]经过校正得到羟甲基化微阵列检测芯片上每个检测探针的log2 (HMeDIP/Input)值以及p-value值,log2 (HMeDIP/Input)值代表每个探针在实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段中的相对富集强度，p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率，P-value由修正的KS检验算法计算。
[0054]进一步，在筛选得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因之后，本实施方式的分析方法还包括针对筛选得到的差异表达基因使用实时荧光定量PCR对hMeDIP-Chip分析结果进行验证的步骤。
[0055]具体在本实施方式中得到3个较大差异表达的基因，分别是三个表达上调的HMGCR、THBD 及 STAT3 基因。
[0056]上述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法通过使用hMeDIP-Chip技术来分析尿毒症羟甲基化状态的改变，得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因，深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明尿毒症的发病机理，为尿毒症的诊断和治疗提供新途径。上述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种尿毒症差异表达基因的图谱模型，获取作为中间结果的尿毒症的相关疾病信息。[0057]此外，本实施方式还提供了一种基因检测芯片，在该基因检测芯片上固定有上述方法得到的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因作为检测探针。
[0058]一种基因检测芯片，基因检测芯片上固定有由上述方法得到的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因。
[0059]在其中一个实施例中，差异表达基因为HMGCR、THBD及STAT3中的至少一种。
[0060]通过上述基因检测芯片，可以初步检测待测患者血液内上述三种差异表达基因的表达情况，为初步诊断尿毒症提供中间结果信息，检测过程方便，不需要使用传统的繁杂的检测步骤，但由于尿毒症往往是一种综合病征，获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是尿毒症疾病。[0061]以下为具体实施例部分:
[0062]1.实验对象
[0063]本实验中共有30个样本，见表1，其中，疾病组15人，健康对照组15人。疾病组患者来源于桂林市第181医院肾脏科。健康对照组与疾病组年龄、种族、性别相匹配。本研究征得了桂林市第181医院伦理委员会的同意。
[0064]表1.疾病组和对照组的人口学和临床特征
[0065]
【权利要求】
1.一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，包括如下步骤: 分别采集尿毒症患者和健康人的血液样本，并分别从所述血液样本中提取DNA ； 将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段，并加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链作为阳性对照； 将含有所述阳性对照的所述DNA片段加热变性，再将得到的单链DNA样本分成两份，其中一份作为实验组加入抗5’ -羟甲基化胞嘧啶核苷抗体得到DNA片段抗体复合物，另一份作为对照组，记为Input，其中，实验组用免疫磁珠法分离所述DNA片段抗体复合物，共沉淀后非羟甲基化的DNA片段被清洗除去，得到纯化的DNA片段抗体复合物，记为hMeDIP ； 对上述实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段进行扩增； 对扩增后的实验组DNA片段抗体复合物和对照组DNA片段分别使用Cy5和Cy3染料标记； 将染料标记后的实验组DNA片段抗体复合物与对照组DNA片段混合后与羟甲基化微阵列检测芯片杂交，使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果，得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因。
2.如权利要求1所述的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，在将所述DNA消化成200~1000bp的DNA片段之前，所述分析方法还包括对提取的DNA使用NanoDrop ND-100分析仪测定所述DNA的数量和质量以及用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性的步骤。
3.如权利要求1所述的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，在对上述实验组纯化的DNA片段和对照组的DNA片段进行扩增之前，所述分析方法还包括对免疫磁珠法分离得到的DNA片段抗体复合物的富集效率进行评估的步骤。
4.如权利要求1所述的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，所述使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果包括如下步骤: 使用高解析度芯片扫描仪分别检测尿毒症患者组与健康人的芯片杂交信号，获取Cy3及Cy5的荧光扫描图像； 使用Bioconductor packages Ringo、Iimma及MEDME对杂交结果进行数据提取、标准化和峰值分析； 经过校正得到所述羟甲基化微阵列检测芯片上每个检测探针的log2(hMeDIP/Input)值以及p-value值,log2 (hMeDIP/Input)值代表每个探针在实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段中的相对富集强度，p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率，P-value由修正的KS检验算法计算。
5.如权利要求1所述的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，所述分析方法还包括在筛选得到所述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因之后针对筛选得到的差异表达基因使用实时荧光定量PCR对hMeDIP-Chip分析结果进行验证的步骤。
6.一种基因检测芯片，其特征在于，所述基因检测芯片上固定有如权利要求1~5中任一项所述的方法得到的尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因。
7.如权利要求6所述的基因检测芯片，其特征在于，所述差异表达基因为HMGCR、THBD及ST AT3中的至少一种。
【文档编号】C12Q1/68GK103911438SQ201410093631
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】眭维国, 戴勇, 谭秋培, 薛雯 申请人:眭维国, 戴勇