一种重组肺炎支原体蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组肺炎支原体蛋白，以及该重组肺炎支原体蛋白在制备检测试剂盒中的应用。本发明的重组肺炎支原体蛋白制备的诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，很好的满足了肺炎支原体感染临床诊断的需要。
【专利说明】一种重组肺炎支原体蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种肺炎支原体蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae, MP)是引起上呼吸道感染、气管支气管炎及非典型肺炎的常见病原体之一。由于肺炎支原体感染所致的社区获得性肺炎患者临床表现不典型，经过10-20d的潜伏期，可出现一些非特异性症状如头痛和发热，常伴有无力和干咳，根据临床症状不易作出鉴别诊断。常被忽视而导致严重的合并症。由于肺炎支原体无细胞膜，作用于细胞膜的抗菌药物对其无杀伤作用，加上其感染初期临床表现不明显，另外，MP感染还可以造成肺外各系统改变，且有死亡病例的报道，已引起临床关注。因此，及时、有效的进行肺炎支原体感染的实验室诊断变得尤为重要。
[0003]MP感染可在任何年龄发生，尤其以5~20岁更多见。MP通过飞沫，以气溶胶微粒的形式传播，感染后引起肺炎支原体肺炎(Mycoplasmalpneumonia,MPP),每隔3~5年出现I次地区性流行，占各类肺炎总数的10%~20%，入伍新兵患肺炎者30%~50%由MP引起，约占非细菌性肺炎的1/3以上。另外，还可以造成肺外各系统改变，且有死亡病例的报道，已引起临床关注。
[0004]肺炎支原体肺炎的临床表现、X线征象均缺乏特异性，且须与病毒性肺炎、军团菌肺炎相鉴别，只能通过实验室检查病原体分离阳性和血清学试验进行鉴别诊断、确诊。虽然分离培养虽然是最可靠的确诊依据，但存在着临床标本中病原体含量少、呼吸道污染的杂菌较多、分离培养需要时间长、阳性率低以及支原体培养要求高，一般实验室难以开展等缺点。因而不能作为临床快速诊断的方法。而血清学检查具有简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种重组肺炎支原体蛋白，本发明的另一目的是提供该重组肺炎支原体蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
[0006]本发明提供了一种编码肺炎支原体蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQIDN0.1所不。同时提供了由该重组DNA序列编码的肺炎支原体蛋白，其氣基酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0007]本发明还提供了一种肺炎支原体蛋白的表达载体pET-28a-rMP_pll6,它是将SEQIDN0.1所示所述的重组DNA序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒,其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-28a-rMP-pll6导入大肠杆菌中，得到表达肺炎支原体蛋白的工程菌株，其保藏编号为CGMCCN0.8895，于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。[0008]本发明利用SEQIDN0.1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备肺炎支原体蛋白可以通过如下步骤实现:
[0009]I)获得具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列；
[0010]2)将该核苷酸序列导入质粒,优选pET_28a质粒；
[0011]3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21 (DE3)菌株中；
[0012]4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下(转速200r/min、37°C培养3小时，加入Immol/mL诱导剂，转速200r/min、37°C诱导表达5小时)培养所述宿主细胞；
[0013]5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
[0014]本发明提供的检测肺炎支原体感染的试剂盒，其组分中的抗原是本发明所述的重组肺炎支原体蛋白。优选地，用于标记肺炎支原体蛋白的标记物为体金。
[0015]本发明所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，MP抗原划线包被浓度为1.0mg/ml, MP抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫，胶体金结合物喷点量为60.0 μ L/cm2。兔抗MP抗体包被量为1.0 μ 1/cm，包被浓度为5.0mg/ml。
[0016]以下将更详细的描述本发明的技术方案:
[0017]本发明提供了一种编码肺炎支原体蛋白的如SEQIDN0.1所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备肺炎支原体蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQIDN0.2所示氨基酸序列的肺炎支原体蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测肺炎支原体感染的应用。
[0018]SEQIDN0.1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，选择其强抗原表位即肺炎支原体MP129-B7基因组(GenBank:NP_109974.1)中DNA序列为模板，设计两对PCR引物(Pl，P2)和(P3，P4)。pi和p2用于扩增pll6中第31位到第912位核苷酸，p3和p4用于扩增P116第1015位到第1395核苷酸；引物pl和p4分别带有BamHl和XhoI的酶切位点，引物P2和p3顺序互补；利用P2中的连接引物将中间部分疏水片断去除，并根据大肠杆菌的表达子偏爱性对基因序列进行了部分点突变。
[0019]引物序列如下:
[0020]Pl:ATAGGATCCGGGCACAGATATGGGAATGACCAC
[0021]P2:
[0022]GAATCTTCCAAAGCCACCCTGATCTTAATCAAACCCCGGTCGGGTTAC
[0023]P3:CCGAGGTAACCCGACCGGGGTTTGATTAAGATCAGGGTGGCTTTGG
[0024]P4:
[0025]TATCTCGAGTTAATGATGGTGATGGTGATGCCAGAGGAACCTACTTTTTTCCC
[0026]以肺炎支原体培养物为模板，以引物Pl和P2扩增pll6第11位到第304位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增pll6第389位到第465核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物Pl和P4，扩增pll6片段；得到串联的目的基因重组片段pll6。
[0027]本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。
[0028]本发明还提供应用如SEQIDN0.1所示的核苷酸序列制备肺炎支原体蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码肺炎支原体蛋白的如SEQIDN0.1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。
[0029]编码本发明蛋白的核酸与pET_28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。
[0030]在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQIDN0.1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导培养后，收集菌体，得到大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-28a-rMP-pll6。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。
[0031]本发明还提供用上述方法制备、纯化的肺炎支原体蛋白，该蛋白具有SEQIDN0.2所示氨基酸序列。
[0032]本发明还提供包含本发明肺炎支原体蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人肺炎支原体感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的检测肺炎支原体感染。任何生物学样品，只要它们含有肺炎支原体抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。
[0033]本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成肺炎支原体感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断肺炎支原体感染。在用于肺炎支原体感染检测的试剂盒中，本发明的肺炎支原体蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金
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[0034]目前市场上只有日本富士瑞必欧株式公社生产的“肺炎支原体抗体检测试剂盒(被动凝集法)”是对肺炎支原体抗体进行检测的。
[0035]而采用本发明提供的重组肺炎支原体蛋白制备的诊断试剂盒，与该试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，很好的满足了肺炎支原体感染临床诊断的需要。
[0036]本发明涉及的表达肺炎支原体蛋白的工程菌株为大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-28a-rMP-pl 16，其保藏编号为CGMCCN0.8895，于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M表示Marker，I表示扩增产物；
[0038]图2是表达质粒pET-28a-rMP_pll6的构建流程图；
[0039]图3是诱导后菌体12% SDS — PAGE电泳图，其中M表示Marker，I表示目的蛋白。【具体实施方式】
[0040]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
[0041 ] 实施例1肺炎支原体蛋白的制备
[0042]1.1肺炎支原体蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆
[0043]通过计算机分析肺炎支原体的全部氨基酸序列筛选出肺炎支原体蛋白的强抗原表位，所述的重组蛋白质从N-末端到C-末端依次含有MP129-B7基因组中pl 16从N-末端第11位到第289位核苷酸，和第339位到第421位核苷酸的421个氨基酸。其中上述重组蛋白质的DNA序列如SEQIDN0.2所示。
[0044]根据肺炎支原体MP129-B7基因组中目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(Pl，P2)和(P3，P4)。pl和p2用于扩增pll6中第11位到第304位核苷酸，P3和p4用于扩增pll6第389位到第465核苷酸；引物pl和p4分别带有BamHI和XhoI的酶切位点，引物p2和p3部分核苷酸序列互补。
[0045]引物序列如下:
[0046]Pl:ATAGGATCCGGGCACAGATATGGGAATGACCAC
[0047]P2:CAGGGTGGCTTTGGAAGATTCCGAGTCCGTGGAGGGTAA
[0048]P3:TCGGAATCTTCCAAAGCCACCCTGATCTTAATCAAACCC
[0049]P4:
[0050]TATCTCGAGTTAATGATGGTGATGGTGATGCCAGAGGAACCTACTTTTTTCCC
[0051]上述引物由(华美生物技术有限公司)合成。
[0052]以肺炎支原体培养物(中国预防医学科学院病毒研究所赠)为模板，以引物Pl和P2扩增pll6第11位到第304位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增pll6第389位到第465核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物Pl和P4，扩增pll6片段；得到串联的目的基因重组片段P116 ;扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称:TAKARA MiniBESTPlasmidpurification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。
[0053]1.2表达载体pET-28a-rMP_pll6的构建及鉴定
[0054]pET_28a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物目的DNA片段经BamHI和XhoI双酶切，产物纯化(采用TAKARAMiniBESTPlasmidpurification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司)后经T4DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶BamHI和XhoI双酶切、鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒 pET-28a-rMP-pll6。
[0055]1.3表达肺炎支原体蛋白的工程菌的构建
[0056]将表达质粒pET-28a-rMP_pll6用化学转化法((美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.)转入大肠埃希氏菌BL21 (DE3)菌株(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12% SDS 一 PAGE分析(同上文献)，结果如附图3所示，确定表达肺炎支原体蛋白的菌株即为所需的工程菌株大肠埃希氏菌 Escherichiacoli YNTpET-28a_rMP-pll6 (CGMCCN0.8895)，用甘油冷冻保存。
[0057]1.4重组肺炎支原体蛋白的表达制备及纯化[0058]诱导培养已构建的表达肺炎支原体蛋白的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1:10 (W/V)加入菌体裂解液(50mmpH8.0Tris-Cl，50mmNaCl，50%甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次)、组氨酸亲和柱(300ml200mm的NiCl2过柱，流速5ml/min ；500ml平衡缓冲液洗注，流速10ml/min ;超声离心后的沉淀用200ml平衡缓冲液稀释后上样,流速3ml/min, 500ml平衡缓冲液洗注，流速5ml/min ;用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS — PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白。1.5肺炎支原体重组融合蛋白鉴定
[0059]1.5.1纯度和分子量的测定:经SDS — PAGE电泳检测(蛋白上样量10 μ g)，为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95.8%。分子量约为49Kd，检测结果见附图3。
[0060]1.4.2浓度测定:经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为 5.0±0.5mg/mL。
[0061]1.4.3 重组蛋白 Western-blot 验证
[0062]为验证重组rMP_pll6型蛋白质与抗MP抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为:10份兔抗MP抗体阳性血清(购自北京百安天地医药科技有限公司)和30份人抗MP抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为:10份对照正常兔血清和30份人抗MP抗体阴性血清(经ELISA法检测证实)。结果如表1。
[0063]表1重组蛋白Western-blot验证结果
【权利要求】
1.一种编码肺炎支原体蛋白核酸，如SEQIDN0.1所示。
2.一种肺炎支原体蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的核酸编码，其氨基酸序列如 SEQIDN0.2 所示。
3.包含权利要求1所述核酸的肺炎支原体蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求I所述的核酸插入到质粒pET-28a上得到的重组pET-28a-rMP-pll6质粒。
4.一株表达肺炎支原体蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-28a-rMP-pll6，宿主菌为大肠杆菌，保藏编号为CGMCCN0.8895。
5.一种重组肺炎支原体蛋白的制备方法，其特征在于I)获得具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列； 2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-28a质粒； 3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21(DE3)菌株中； 4)培养所述宿主细胞； 5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
6.一种检测肺炎支原体感染的试剂盒，其特征在于其组分中的抗原是根据权利要求2所述的肺炎支原体蛋白。
7.根据权利要求6所述的检测肺炎支原体感染的试剂盒，其特征在于所述抗原是以胶体金标记的。
8.根据权利要求6所述的检测肺炎支原体感染的试剂盒，其特征在于所述肺炎支原体抗原划线包被浓度为1.0mg/ml，胶体金结合物喷点量为60.0 μ L/cm2，兔抗肺炎支原体抗体包被量为1.0 μ 1/cm,包被浓度为5.0mg/ml。
9.根据权利要求2所述的肺炎支原体蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12R1/19GK103834668SQ201410097117
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】张秀杰, 张晓刚, 华艳 申请人:英诺特（唐山）生物技术有限公司