脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法
【专利摘要】本发明公开的脂肪酶固定化载体是以皮胶原为基材，与交联剂依次在酸性条件和中偏碱性条件下进行交联后，用中性缓冲溶液冲洗除去未反应的交联剂即可，所得载体的游离醛基含量为0.5～5.0mmol/g，干热变性温度为80～100℃，比表面积为2.0～20m2/g。本发明还公开了利用前述的脂肪酶固定化载体来固定脂肪酶的方法，该方法所得固定化脂肪酶活力在70U/g以上，常温下保存一个月后，酶活力在95％以上。本发明提供的载体原材料来源丰富，天然可再生，价格低廉，且比表面积大，化学性能稳定，热稳定性高，制备成本低，固定的脂肪酶活力及活力保持率高，常温下存放1个月，酶的活性仍能保持95％以上。
【专利说明】脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酶工程中酶固定化载体及其固定脂肪酶的制备【技术领域】，具体涉及一种脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法。
【背景技术】
[0002]脂肪酶已被广泛应用于食品、油脂、生物柴油、制药等领域，但如果使用游离脂肪酶，后期脂肪酶与产品的分离、再生和循环使用均很困难。
[0003]固定化酶是采用物理或化学方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中。酶固定化后一般稳定性会增加，也易从反应系统中分离，便于运输和贮存，且易于控制，能反复多次使用，有利于自动化生产。已有的研究还表明，通过固定化后可使酶催化原来不能催化的反应，而且固定化后可以改变酶的微环境，同时有利于酶的分散，提高其活性和稳定性，在生产工艺上易于实现连续化和自动化。
[0004]固定化脂肪酶是将脂肪酶通过物理或化学的方法与某种物体结合制备成为不溶于水的，但仍具有催化活性的复合体，现已广泛应用于食品加工、生物柴油的制备、工业皮革的处理和手性药物的拆分等领域。对于脂肪酶的固定化方法现在也很多，如吸附法、共价偶联法、共价交联法和包埋法等等。但不管哪种脂肪酶的固定化方法，其载体的性能和具体的固定化方式对于脂肪酶固定化后的性能优劣至关重要。首先作为酶固定化载体材料就要求具有良好的机械强度、热稳定性、化学稳定性、抗微生物特性、酶结合能力及价廉易得等。但现有技术在载体的选用上，主要选择的是一些天然物质如活性炭、丝瓜络、硅藻土、大孔树脂，或一些高分子单体如苯乙烯、壳聚糖、丙烯酰胺等聚合制备的载体，如刘娟等【刘娟，杨楠等.固定化脂肪酶的制备及其酶学性质的研究.油脂化学，2013，38(1):44-47.】以大孔树脂为载体吸附固定脂肪酶，使酶的稳定性得到明显提高，循环6次，酶活回收率仍可达到50%。又如Dong Huaping等【Dong Huaping, Li Jianfa,Li Yimin, et al.1mprovement of catalytic activity and stability of lipase byimmobilizat1n on organobentonite.Chemical Engineering，2012，181-182:590-596.]是以有机膨润土固定猪胰脂肪酶，固定化后脂肪酶的水解活性得到提高，催化效率也更高，且在相同条件下储存8天后，固定酶的相对活性比自由酶高出2.7倍。Reshmi等【R.Reshmi, S.Sugunan, et al.Super1r activities of lipase immobilized on pureand hydrophobic clay supports: Characterizat1n and catalytic activity studies.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2013，97:36-44.】是先将蒙脱土改性，再用戊二醛进行交联，最后通过吸附和共价结合将酶固定在该载体上，于相同条件下储存40天，固定酶和自由酶的残余酶活分别为85%、15%。这些载体用于固定化脂肪酶虽然使酶的稳定性得到了提高，但由于大多是物理吸附，固定效果一般，且这些载体在分离上还需要采取重力沉降、过滤、抽滤，甚至离心等多种手段才能实现，导致工艺流程长，费时费力，不利于工业实际运用。其次，在一些固定脂肪酶的方法方面也存在着许多问题，如采用简单的、较为传统的固定化方法——吸附法【黄卓楠.介孔材料SBA-15固定化脂肪酶的研究进展.硅酸盐通报，2013,32(7):1312-1313;隋颖，张立平等.吸附法固定化脂肪酶研究进展.山东化工，2013，42:46-47.】时所制备的固定化脂肪酶不仅因为酶与载体之间的作用力弱，容易脱落、解吸附而失效，且重复使用较差，活力下降较快。而包埋法【张闻修，刘丽波等.脂肪酶固定化技术的研究进展.食品工业科技，2013，34(22):339-341.】由于包埋材料的特殊结构会使传质受到影响，不利于制得的固定化脂肪酶与底物更好的结合，从而导致催化效率低。交联法【刘志勤，宋笛等.脂肪酶固定化及固定化脂肪酶的应用研究进展.农产品加工，2012，28(5):89-92.】因是利用双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联凝集而形成固定化酶，由于交联反应条件较剧烈，制备过程复杂，其化学试剂的使用会使酶在处理过程中易于失活。共价结合【R.Reshmi, S.Sugunan, etal.Super1r activities of lipase immobilized on pure and hydrophobic claysupports: Characterizat1n and catalytic activity studies.Journal of MolecularCatalysis B:Enzymatic, 2013,97:36-44.】因是先将载体上引进活泼基团，然后该活泼基团与酶分子上某一基团反应形成共价键的结合方法。虽然共价结合固定的酶，酶与载体间的相互作用较强，在反应中比较稳定，但其制备步骤繁琐复杂，制备条件苛刻。
[0005]因此，进一步寻求实用、有效的脂肪酶固定化载体及其固定化方法仍是本领域的重要研究开发课题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术存在的不足之处，首先提供一种实用有效、来源丰富、可再生的脂肪酶固定化载体，该固定化载体稳定性良好，对脂肪酶的固定化效果突出，重复利用性好。
[0007]本发明的另一目的是提供一种利用上述脂肪酶固定化载体来固定脂肪酶的方法。该方法能够大大简化固定化酶的操作步骤，无需对载体材料进行前期活性基团修饰。
[0008]本发明提供的脂肪酶固定化载体，其特征在于该载体是以皮胶原为基材，与交联剂依次在酸性条件和中偏碱性条件下进行交联后，用中性缓冲溶液冲洗除去未反应的交联剂即可，所得载体的游离醛基含量为0.5?5.0mmol/g，干热变性温度为80?100°C，比表面积为2.0?20m2/g。
[0009]以上所述的脂肪酶固定化载体具体是由以下方法制得的:
[0010]将质量分数为10%的皮胶原分散液100份，用酸性物调节pH至2.5?5.0，充分搅拌分散后，先加入质量分数为10%交联剂50?150份，在20?45°C搅拌交联反应2?8小时，然后用碱性物调节pH值至7.0?8.0，继续反应0.5?I小时，再用pH为中性的缓冲溶液充分洗涤即可或再冷冻干燥后保存。
[0011]更优选地，将质量分数为10%的皮胶原分散液100份，用酸性物调节pH至3.5?4.2，充分搅拌分散后，先加入质量分数为10%交联剂80?120份，在35?45°C搅拌交联反应6?8小时，然后用碱性物调节pH值至7.0?8.0，继续反应0.5?I小时，再用pH为中性的缓冲溶液充分洗涤即可或再冷冻干燥后保存。
[0012]上述方法中所述的交联剂为甲醛、乙二醛、丙二醛、丁二醛和戊二醛中的至少一种。
[0013]上述方法中所述的皮胶原为皮胶原纤维、皮胶原海绵或脱脂、脱毛后动物皮块中的任一种。
[0014]上述方法中所述的酸性物为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、柠檬酸、琥珀酸或酒石酸中的任一种。
[0015]上述方法中所述的碱性物为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或氨水中的任一种。
[0016]上述方法中所述的pH为中性的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液。
[0017]本发明提供的利用上述脂肪酶固定化载体来固定脂肪酶的方法，其特征在于该方法是将脂肪酶与以上方法制备的脂肪酶固定化载体按100?200活力单位/每克载体的用量，于pH为7.1?8.5弱碱性的缓冲溶液中，在20?45°C温度下反应0.5?6小时后用去离子水充分洗涤即可。所得固定化脂肪酶活力在70U/g以上，常温下保存一个月后，酶活力在95%以上。
[0018]上述方法中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-盐酸缓冲液。
[0019]本发明与现有技术相比，具有以下优点:
[0020]1、由于本发明提供的脂肪酶固定化载体是将皮胶原用醛类化合物交联后制得，因而其不仅原材料来源丰富，天然可再生，价格低廉，比表面积大，为2.0?20m2/g，且载体的化学性能稳定，用差式扫描量热法测得该载体的干热变性温度在80?100°C，比交联处理iu的皮I父原提闻20?40°C，显不其热稳定性也大大提闻。
[0021]2、由于本发明提供的脂肪酶固定化载体的胶原蛋白分子含有丰富的氨基/羧基/羟基等活性基团，因而不需要为原料专门引入与交联剂反应的活性基团，大大简化了制备工序，降低了制备成本。
[0022]3、由于本发明交联过程是采用酸性和中性交联两步法，因而使所得载体的游离醛基含量为0.5?5.0mmol/g，能够为后续固定的脂肪酶提供更多的反应活性基团，以提高酶的固定率。
[0023]4、由于本发明提供的脂肪酶固定化载体的原料为皮胶原，这不仅为脂肪酶固定化载体找到了一种新的原材料，且也为皮胶原的应用提供了一条新的途径。
[0024]5、由于本发明提供的脂肪酶固定化载体的原料为胶原蛋白，且酶的固定化又为化学交联，因而不仅固定化脂肪酶活力高，在70U/g以上，且固定化酶的效率高，常温下存放I个月，酶的活力仍能保持95%以上。
【具体实施方式】
[0025]下面给出实施例以对本发明作进一步说明。有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。
[0026]值得说明的是:1)以下实施例所得脂肪酶固定化载体游离醛基含量测定是按盐酸羟胺-电位滴定方法进行测定。2)脂肪酶活力测定是按照GB/T 23535-2009标准方法进行测定。3)脂肪酶固定化载体比表面积和孔隙率采用掺BET法(布鲁诺-埃麦特-泰勒法)测试，样品量0.300g，高纯氮气为吸附气。4)脂肪酶固定化载体干热变性温度采用DSC(差式扫描量热法)测定，测定温度区间为20°C?180°C，升温速率为5°C /分钟。
[0027]实施例1
[0028]将质量分数10%的皮胶原纤维分散液100克，用l.0Mol/L柠檬酸调节pH值到
3.5，充分搅拌均匀后，加入质量分数为10%戊二醛100克，在30°C水浴，搅拌交联反应5小时，然后用质量分数10 %氢氧化钠溶液，缓慢调节pH值至7.0?8.0，继续反应0.5小时，过滤，再用pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3?5次，待用或再冷冻干燥后保存。所得载体比表面积为20m2/g，干热变性温度84.5°C，游离醛基含量3.8mmol/g。
[0029]将活力单位为10000U/g的脂肪酶(深圳绿微康公司)I克与上述制备的脂肪酶固定化载体100克(脂肪酶与载体比例为100U/g载体)，放入200毫升pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液中，在25°C温度下反应2小时。反应完成后，过滤，用去离子水洗涤3?5次。
[0030]所得固定化脂肪酶酶活力为80U/g。常温下存放一个月后，酶活力为78U/g。
[0031]实施例2
[0032]将牛皮胶原海绵10克放入0.5Mol/L醋酸溶液90克中分散，用甲酸调节pH值到2.8，充分搅拌均匀后，加入质量分数为10%丁二醛120克，在45°C水浴，搅拌交联反应8小时，然后用质量分数10%碳酸氢钠溶液，缓慢调节pH值至7.0?8.0，继续反应I小时，过滤，再用pH为7.0的Tris-盐酸缓冲液洗涤3?5次，待用或再冷冻干燥后保存。所得载体比表面积为16.3m2/g，干热变性温度89.6°C，游离醛基含量5.0mmol/g。
[0033]将活力单位为50000U/g的脂肪酶(诺维信公司)0.3克与上述制备的脂肪酶固定化载体100克(脂肪酶与载体比例为150U/g载体)，放入200毫升pH为7.1的Tris-盐酸缓冲液中，在45°C温度下反应6小时。反应完成后，过滤，用去离子水洗涤3?5次。
[0034]所得固定化脂肪酶酶活力为105U/g。常温下存放一个月后，酶活力为102U/g。
[0035]实施例3
[0036]将质量分数40%的脱脂、脱毛牛皮块25克放入75克去离子水中，用1.0MoI/L的甲酸调节PH值到5.0,充分搅拌均匀后，加入质量分数为10%戊二醛30克、质量分数为10%乙二醛20克，在20°C水浴，搅拌交联反应6小时，然后用质量分数10%碳酸钠溶液，缓慢调节PH值至7.0?8.0，继续反应I小时，过滤，再用pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3?5次，待用或再冷冻干燥后保存。所得载体比表面积为2.0m2/g，干热变性温度100°C，游离醛基含量1.7mmol/go
[0037]将活力单位为20000U/g的脂肪酶(深圳绿微康公司)0.2克与上述制备的脂肪酶固定化载体20克(脂肪酶与载体比例为200U/g载体)，放入200毫升pH为8.0的Tris-盐酸缓冲液中，在40°C温度下反应6小时。反应完成后，过滤，用去离子水洗涤3?5次。
[0038]所得固定化脂肪酶酶活力为98U/g。常温下存放一个月后，酶活力为96U/g。
[0039]实施例4
[0040]将质量分数10%的皮胶原纤维分散液100克，用l.0Mol/L琥珀酸调节pH值为
4.2，充分搅拌均匀后，加入质量分数为10%戊二醛60克，甲醛20克，在35°C水浴，搅拌交联反应2小时，然后用质量分数10%氨水溶液，缓慢调节pH值至7.0?8.0,继续反应45分钟，过滤，再用pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3?5次，待用或再冷冻干燥后保存。所得载体比表面积为19.5m2/g，干热变性温度80.(TC，游离醛基含量0.5mmol/g。
[0041]将活力单位为50000U/g的脂肪酶(诺维信公司)0.2克与上述制备的脂肪酶固定化载体100克(脂肪酶与载体比例为100U/g载体)，放入200毫升pH为7.8的Tris-盐酸缓冲液中，在35°C温度下反应0.5小时。反应完成后，过滤，用去离子水洗涤3?5次。
[0042]所得固定化脂肪酶酶活力为75U/g。常温下存放一个月后，酶活力为75U/g。
[0043]实施例5
[0044]将牛皮胶原海绵10克放入0.1Mol/L醋酸溶液90克中，用甲酸调节pH值到2.5，充分搅拌均匀后，加入质量分数为10%乙二醛60克，质量分数为10%丁二醛90克，在25°C水浴，搅拌交联反应8小时，然后用质量分数10%碳酸钠溶液，缓慢调节pH值至7.0?8.0，继续反应I小时，过滤，再用pH为7.0的Tris-盐酸缓冲液洗涤3?5次，待用或再冷冻干燥后保存。所得载体比表面积为15.7m2/g，干热变性温度90.20C，游离醛基含量3.6mmol/g°
[0045]将活力单位为20000U/g的脂肪酶(深圳绿微康公司)I克与上述制备的脂肪酶固定化载体100克(脂肪酶与载体比例为200U/g载体)，放入200毫升pH为8.5的磷酸盐缓冲液中，在30°C温度下反应4小时。反应完成后，过滤，用去离子水洗涤3?5次。
[0046]所得固定化脂肪酶酶活力为85U/g。常温下存放一个月后，酶活力为82 U/g。
[0047]实施例6
[0048]将质量分数10%的皮胶原纤维分散液100克，用1.0 Mo I/L的柠檬酸调节pH值到3.8，充分搅拌均匀后，加入质量分数为10%乙二醛100克，在40°C水浴，搅拌交联反应7小时，然后用质量分数10%碳酸氢钠溶液，缓慢调节pH值至7.0?8.0，继续反应I小时，过滤，再用pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3?5次，待用或再冷冻干燥后保存。所得载体比表面积为18.2m2/g，干热变性温度83.2°C，游离醛基含量4.2mmol/go
[0049]将活力单位为50000U/g的脂肪酶(诺维信公司)0.4克与上述制备的脂肪酶固定化载体100克(脂肪酶与载体比例为200U/g载体)，放入200毫升pH为7.5的Tris-盐酸缓冲液中，在45°C温度下反应4小时。反应完成后，过滤，用去离子水洗涤3?5次。
[0050]所得固定化脂肪酶酶活力为165U/g。常温下存放一个月后，酶活力为160U/g。
[0051]对比例
[0052]将质量分数10%的皮胶原纤维分散液100克，用质量分数10%碳酸氢钠溶液，缓慢调节PH值至7.0?8.0，加入质量分数为10%乙二醛100克，在40°C水浴，搅拌交联反应7小时，过滤，再用pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3?5次，待用或再冷冻干燥后保存。所得载体比表面积为16.2m2/g，干热变性温度85.2°C，游离醛基含量0.45mmol/g。
[0053]将活力单位为50000U/g的脂肪酶(诺维信公司)0.4克与上述制备的脂肪酶固定化载体100克(脂肪酶与载体比例为200U/g载体)，放入200毫升pH为7.5的Tris-盐酸缓冲液中，在45°C温度下反应4小时。反应完成后，过滤，用去离子水洗涤3?5次。
[0054]所得固定化脂肪酶酶活力为35U/g。常温下存放一个月后，酶活力为32U/g。
【权利要求】
1.一种脂肪酶固定化载体，其特征在于该载体是以皮胶原为基材，与交联剂依次在酸性条件和中偏碱性条件下进行交联后，用中性缓冲溶液冲洗除去未反应的交联剂即可，所得载体的游离醛基含量为0.5?5.0mmol/g，干热变性温度为80?100°C，比表面积为2.0 ?20m2/g。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶固定化载体，其特征在于该载体具体是由以下方法制得的: 将质量分数为10%的皮胶原分散液100份，用酸性物调节pH至2.5?5.0，充分搅拌分散后，先加入质量分数为10%交联剂50?150份，在20?45°C搅拌交联反应2?8小时，然后用碱性物调节PH值至7.0?8.0，继续反应0.5?I小时，再用pH为中性的缓冲溶液充分洗涤即可或再冷冻干燥后保存。
3.根据权利要求1所述的脂肪酶固定化载体，其特征在于该载体具体是由以下方法制得的: 将质量分数为10%的皮胶原分散液100份，用酸性物调节pH至3.5?4.2，充分搅拌分散后，先加入质量分数为10%交联剂80?120份，在35?45°C搅拌交联反应6?8小时，然后用碱性物调节PH值至7.0?8.0，继续反应0.5?I小时，再用pH为中性的缓冲溶液充分洗涤即可或再冷冻干燥后保存。
4.根据权利要求1或2或3所述的脂肪酶固定化载体，其特征在于所述的交联剂为甲醛、乙二醛、丙二醛、丁二醛和戊二醛中的至少一种。
5.根据权利要求1或2或3所述的脂肪酶固定化载体，其特征在于所述的皮胶原为皮胶原纤维、皮胶原海绵或脱脂、脱毛后动物皮块中的任一种。
6.根据权利要求4所述的脂肪酶固定化载体，其特征在于所述的皮胶原为皮胶原纤维、皮胶原海绵或脱脂、脱毛后动物皮块中的任一种。
7.根据权利要求1或2或3所述的脂肪酶固定化载体，其特征在于所述的酸性物为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、柠檬酸、琥珀酸或酒石酸中的任一种；所述的碱性物为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或氨水中的任一种；所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液。
8.根据权利要求6所述的脂肪酶固定化载体，其特征在于所述的酸性物为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、柠檬酸、琥珀酸或酒石酸中的任一种；所述的碱性物为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或氨水中的任一种；所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
9.一种利用权利要求1所述的脂肪酶固定化载体来固定脂肪酶的方法，其特征在于该方法是将脂肪酶与以上方法制备的脂肪酶固定化载体按100?200活力单位/每克载体的用量，于pH为7.1?8.5弱碱性的缓冲溶液中，在20?45°C温度下反应0.5?6小时后用去离子水充分洗涤即可，所得固定化脂肪酶活力在70U/g以上，常温下保存一个月后，酶活力在95%以上。
10.根据权利要求9所述的固定脂肪酶的方法，其特征在于该方法中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
【文档编号】C12N11/02GK104293763SQ201410433204
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】程海明, 宋德伟, 陈敏, 李志强 申请人:四川大学