一种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，配制100mL该培养基的配方中含有下列组分：CAS蓝色检测液3-8mL，1mmol/L的CaCl2溶液0.1-0.3mL，1mmol/L的MgSO4·7H2O溶液0.1-0.3mL，质量浓度为8-12％的酸水解酪蛋白溶液4-8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g，琼脂粉1-3g。本发明还公开了该培养基的制备方法。采用本发明的培养基能够快速获得同时具有嗜铁和解磷能力的细菌菌株，缩短了筛选或检测的时间，提高了筛选效率。
【专利说明】一种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基。
【背景技术】
[0002]解磷细菌通过溶解土壤中难溶性或不溶性的磷素，为作物提高可吸收的磷素，提高土壤中磷的利用效率，促进植物生长，是一类重要的植物促生细菌(PlantGrowth-Promoting Bacteria,简称 PGPB)。
[0003]嗜铁细菌通过分泌嗜铁素，与病原微生物争夺有限的铁营养，抑制病原微生物的生长繁殖，发挥生物防治的作用，同时时利用嗜铁素螯合的铁，改善植物铁营养，防治植物缺铁失绿症，促进植物生长。
[0004]现有技术中，嗜铁细菌或解磷细菌是使用不同的选择性培养基分别进行筛选的，对于具有解磷能力的细菌主要通过无机磷细菌培养基和有机磷细菌培养基进行筛选；对于具有嗜铁能力的细菌主要通过CAS检测平板进行筛选。
[0005]但是，由于土壤中嗜铁细菌或解磷细菌的数量本来就不多，如果一次性筛选同时具有嗜铁和解磷能力的菌株，成功的概率会更低，即使有些菌株同时具有嗜铁和解磷能力，其嗜铁或解磷能力是分别检测用于验证所筛选出的菌株是否具有其他的促生机制，并不是直接作为筛选条件来进行的，但采用两种不同的促生机制分别检测或筛选，所需时间长，步骤繁杂，筛选效率低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，采用该培养基能够快速获得具有嗜铁和解磷能力的细菌菌株，缩短了筛选或检测的时间，提高了筛选效率。
[0007]本发明的另一目的是提供该培养基的制备方法。
[0008]为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0009]—种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，配制10mL该培养基的配方中含有下列组分:
[0010]CAS 蓝色检测液 3_8mL, Immol /I,的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL, Immol /I,的 MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL，质量浓度为8-12%的酸水解酪蛋白溶液4_8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g，琼脂粉 l_3g。
[0011]优选的，该用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，配制10mL该培养基的配方中含有下列组分:
[0012]CAS 蓝色检测液 5mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.2mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.2mL，质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液6mL，Ca3(PO4)20.5g，琼脂粉2g。
[0013]该用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基的制备方法，具体步骤如下:
[0014]将lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL、lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液 0.1-0.3mL、质量浓度为8-12%的酸水解酪蛋白溶液4-8mL混合均匀，向其中加入Ca3(PO4)20.3-0.8g，调节pH为6.8-7.0，用水定容至10mL,加入l_3g琼脂粉，灭菌，灭菌后待温度降至50_60°C时，再加入3-8mL CAS蓝色检测液，混匀后倒平板，即得，并将该平板命名为:CAS_P检测平板。
[0015]所述CAS蓝色检测液的制备方法为:将0.07g的铬天青(Chrome azurol S, CAS)溶于50mL去离子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL),为溶液 A;将 0.06g 的溴化十六烧基三甲铵(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合均匀，即得到CAS蓝色检测液。
[0016]调节pH所用的试剂为生物缓冲液1，4-哌嗪二乙磺酸。
[0017]所述定容用的水为去离子水、纯化水或蒸馏水。
[0018]所述灭菌的温度为121°C，灭菌时间为15分钟。
[0019]本发明的用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，其中，CAS蓝色检测液用于检测和显示能够在该培养基上生长的菌株的嗜铁能力；磷酸三钙用于检测和显示能够在该培养基上生长的菌株的解磷能力。
[0020]本发明的用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，颜色由蓝色变为棕黄色，能够在此培养基上生长的菌株均同时具有嗜铁和解磷的能力。
[0021]本发明的培养基在筛选嗜铁解磷细菌中的应用，具体应用方法为:将自然风干并去除植物根系或石头等杂质的土壤接种于灭菌水中，于30°C，150-200rpm条件下培养2小时，静置后取上清液200 μ L接种于CAS-P检测平板，于30°C条件下培养3_5天，观察平板上菌落的生长。
[0022]本发明的有益效果:
[0023](I)缩短了筛选或检测时间，将细菌的嗜铁和解磷能力的筛选或检测步骤合二为一，能够一次性同时筛选和检测细菌的嗜铁和解磷能力，可在较短的时间内筛选获得同时具有嗜铁和解磷能力的菌株，显著提高嗜铁解磷细菌的分离筛选效率，缩短了筛选或检测时间。
[0024](2)培养基的制备方法简单，可操作性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明实施例1制备的CAS-P检测平板；
[0026]图2为CAS-P检测平板初筛结果；
[0027]图3为CAS检测平板初筛结果；
[0028]图4为细菌嗜铁能力的检测结果，图中a为菌株在CAS检测平板上产生的嗜铁圈子；b为阴性对照，即无嗜铁能力的菌株在CAS检测平板上的生长情况；c为空白CAS检测平板；
[0029]图5为细囷解憐能力的检测结果。
【具体实施方式】
[0030]下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0031]实施例中所用到的的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]实施例1
[0033]—种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，配制10mL该培养基的配方中含有下列组分:
[0034]CAS 蓝色检测液 5mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.2mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.2mL，质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液6mL，Ca3(PO4)20.5g，琼脂粉2g。
[0035]该培养基的制备方法为:先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgSO4.7Η20溶液、质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分钟单独灭菌)；再分别取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10 %的酸水解酪蛋白溶液，向其中加入Ca3 (PO4) 20.5g,用生物缓冲液 1，4-哌嗪二乙横酸[piperazine-N, N-bis (2-ethanesulfonic acid)，Pipes]，调ρΗ6.8?7.0。去离子水定容到100mL。加入2g琼脂粉，121°C，15分钟灭菌。灭完菌后，当温度降低到60°C时，以5mL CAS蓝色检测液/每10mL培养基的量沿着三角瓶壁加入，混合均匀后倒平板。注意不要产生气泡，影响平板检测实验。将该平板命名为CAS-P检测平板。
[0036]CAS蓝色检测液的制备方法为:将0.07g的铬天青(Chrome azurol S，CAS)溶于50mL去离子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，为溶液A ;将0.06g 的溴化十六烧基三甲铵(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于 40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合均匀，即得到CAS蓝色检测液。
[0037]实施例2
[0038]—种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，配制10mL该培养基的配方中含有下列组分:
[0039]CAS 蓝色检测液 3mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.3mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.3mL，质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液8mL，Ca3(PO4)20.3g，琼脂粉3g。
[0040]该培养基的制备方法同实施例1，不再赘述。
[0041]实施例3
[0042]—种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，配制10mL该培养基的配方中含有下列组分:
[0043]CAS 蓝色检测液 8mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.lmL，质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液4mL，Ca3(PO4)20.8g，琼脂粉lg。
[0044]该培养基的制备方法同实施例1，不再赘述。
[0045]性能实验
[0046]无机磷细菌固体培养基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4)21g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，琼脂粉 18 ?20g,定容至100mL, ρΗ7.0?7.5。分装后121。。，15分钟灭菌。
[0047]CAS检测平板:I) CAS蓝色检测液的制作:将0.07g的铬天青(Chrome azurol S,CAS)溶于50mL去离子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，为溶液 A ;将 0.06g 的溴化十六烧基三甲铵(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A沿着烧杯的壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合均匀，即得到溶液C =CAS蓝色检测液。121°C，15分钟灭菌。2)CAS检测平板的制作:先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分钟单独灭菌);再分别取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10%的酸水解酪蛋白溶液，用生物缓冲液1，4-哌嗪二乙磺酸[piperazine-N, N~bis (2-ethanesulfonic acid), Pipes],调 ρΗ6.8 ?7.0。去离子水定容到100mL。加入2g琼脂粉，121°C，15分钟灭菌。当以上的固体培养基灭完菌后，温度降低到60°C时，以5mL CAS蓝色检测液/每10mL培养基的量沿着三角瓶壁加入，混合均匀后倒平板。注意不要产生气泡，以免影响平板检测实验。
[0048]1.嗜铁解磷细菌的初步筛选
[0049]采集作物根围土壤，自然风干后去除植物根系或石头等杂质，接种于灭菌水中，于30°C,150-200rpm条件下培养2小时，静置后取上清液200 μ L接种于本发明实施例1制备的CAS-P检测平板上(图1)，以接种于CAS检测平板为对照，于30°C条件下培养3_5天，观察平板上菌落的生长。
[0050]结果显示:在CAS-P检测平板上仅长出少数几个细菌菌落，没有明显的晕圈(图2);而CAS检测平板上的菌落密集，有明显的橘黄色晕圈(图3)。说明用CAS检测平板筛选获得的具有嗜铁能力的菌落相对较多，但功能单一；而通过CAS-P检测平板筛选获得的菌落数相对偏少，这是因为土壤中具有嗜铁能力或解磷能力的细菌本身并不是很多，筛选同时具有嗜铁能力和解磷能力的细菌，其获得的数量必定显著少于筛选单独具有嗜铁或解磷能力的细菌所获得的数量，因此，尽管在平板上生长的菌落无晕圈产生，但能在此CAS-P平板上生长的菌落均同时具有嗜铁和解磷的能力。说明本发明的CAS-P检测平板对于嗜铁解磷细菌的筛选针对性强。
[0051]2.细菌嗜铁能力的检测
[0052]将CAS-P平板上长出的菌落接种于CAS检测平板上，将无嗜铁能力的菌株接种于CAS检测平板上作为阴性对照，未接种菌种的CAS平板作为空白对照，30°C条件下培养3天，观察菌落生长状况及橘黄色晕圈的产生，并测定菌落和橘黄色晕圈的直径。
[0053]结果显示，橘黄色晕圈/菌落直径比值为3.58 (图4)，说明该菌株具有较强的嗜铁能力。
[0054]3.细菌解磷能力的检测
[0055]将CAS-P平板上长出的菌落同时接种于无机磷固体培养基平板上，30°C条件下培养3天，观察菌落生长状况及解磷圈的产生，并测定菌落和解磷圈的直径。
[0056]结果显示，解磷圈/菌落直径比值为2.92(图5)，说明该菌株具有较强的解磷能力。
[0057]由此可见，采用本发明的CAS-P检测平板可以快速筛选获得同时具有嗜铁和解磷能力的菌株。
【权利要求】
1.一种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，其特征在于，配制10mL该培养基的配方中含有下列组分:
CAS 蓝色检测液 3-8mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.1-0.3mL，质量浓度为8-12%的酸水解酪蛋白溶液4_8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g，琼脂粉l-3g。
2.如权利要求1所述的一种用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基，其特征在于，配制10mL该培养基的配方中含有下列组分:
CAS 蓝色检测液 5mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.2mL, lmmol/L 的 MgSO4.7Η20 溶液 0.2mL,质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液6mL，Ca3(PO4)20.5g，琼脂粉2g。
3.权利要求1或2所述的用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基的制备方法，其特征在于，具体步骤如下:
将 lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL、lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液 0.1-0.3mL、质量浓度为8-12%的酸水解酪蛋白溶液4-8mL混合均匀，向其中加入Ca3(PO4)20.3-0.8g，调节pH为6.8-7.0，用水定容至10mL,加入l_3g琼脂粉，灭菌，灭菌后待温度降至50_60°C时，再加入3-8mL CAS蓝色检测液，混匀后倒平板，即得。
4.如权利要求3所述的用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述CAS蓝色检测液的制备方法为:将0.07g的铬天青溶于50mL去离子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液，为溶液A ;将0.06g的溴化十六烷基三甲铵溶于40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A加入到B溶液中，混合均匀，即得到CAS蓝色检测液。
5.如权利要求3所述的用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基的制备方法，其特征在于，调节pH所用的试剂为生物缓冲液1，4-哌嗪二乙磺酸。
6.如权利要求3所述的用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述定容用的水为去离子水、纯化水或蒸馏水。
7.如权利要求3所述的用于筛选同时具有嗜铁和解磷能力细菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述灭菌的温度为121°C，灭菌时间为15分钟。
8.权利要求1或2所述的培养基在筛选嗜铁解磷细菌中的应用。
【文档编号】C12Q1/04GK104357537SQ201410433007
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】余贤美, 艾呈祥, 王海荣, 安淼, 付丽, 刘嘉芬 申请人:山东省果树研究所