一种微生物油脂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种微生物油脂及其制备方法和应用，其中微生物油脂以经过氧降解的碱木质素为碳源，经浑浊红球菌（Rhodococcusopacus）DSM1069发酵后，通过酯交换反应制备得到。微生物油脂的制备方法包括氧降解、混合、发酵、酯交换反应等步骤，其制备得到的微生物油脂可应用于生物柴油、食品添加剂的制备。本发明提供的微生物油脂的生产工艺简单，运行成本低廉，提供了碱木质素应用的新途径，能有效减少碱木质素排放所带来的资源浪费和环境污染。
【专利说明】一种微生物油脂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物油脂生产【技术领域】，尤其涉及一种微生物油脂，还涉及该微生物油脂的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]木质素是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生有机资源。木质素是由四种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种无定型酚类高聚物，由于其结构的复杂性，迄今为止没有得到高效的利用。碱木质素主要来自于造纸厂黑液，年产量达到I亿吨以上,然而,只有1%?2%的碱木质素用于商业化应用，大部分直接排入水体或焚烧作为热源。因此，如何挖掘木质素的潜在价值受到社会的广泛重视。
[0003]生物柴油是一种可再生的新型清洁能源，主要来自于动物脂肪，植物油脂和微藻，通过其与醇类(如甲醇)在催化剂作用下进行酯交换反应得到脂肪酸酯类物质。然而，生物柴油制备过程中油料供给成本大，约占整个生产成本的60?75%。为满足日益扩大的生物柴油市场的需求，开发新型的油脂生产方式成为未来重要的发展方向之一。目前，以氧降解碱木质素作为微生物生长及油脂生产潜在碳营养物来源，其研究未见相关报导。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术中碱木质素的利用率不高，生物柴油的原料成本过高的技术问题，提供一种价格低廉、易于加工的微生物油脂，同时还提供了一种生产工艺简单，运行成本低廉，易于大规模连续生产，以氧降解碱木质素为碳源的微生物油脂的制备方法，该微生物油脂可作为原料应用于生物柴油或食品添加剂中的制备。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供了一种微生物油脂，前述微生物油脂以经过氧降解的碱木质素为碳源，经浑池红球菌(热ot/ococciAs opacus) DSM 1069发酵后,通过酯交换反应制备得到。
[0006]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述的微生物油脂的制备方法，包括以下步骤:
S1:将碱木质素进行氧降解处理；
52:将经过氧降解处理的碱木质素与营养液混合得到培养基；
53:将浑池红球菌(TSotZococciAs opacus ) DSW 1069添加至前述步骤S2制备得到的培养基中进行发酵得到发酵液，将前述发酵液分离得到菌体；
54:将前述S3步骤中制备得到的菌体进行酯交换反应得到微生物油脂。
[0007]进一步的，前述SI步骤中前述氧降解处理的步骤具体为:将前述碱木质素溶于氢氧化钠溶液中，在80°C?15CTC下以100 psi?150 psi通氧反应30 min?90 min。将经过氧降解处理的碱木质素溶液的PH调节为2?4，使得碱木质素沉淀，离心分离出碱木质素，经冷冻干燥得到碱木质素，再与营养液进行混合制备培养基。
[0008]进一步的，前述S2步骤中前述经过氧降解处理的碱木质素与前述营养液的质量体积比为I g?3 g: 200 mL。
[0009]进一步的，前述S3步骤中前述浑浊红球菌DSM 1069的接种量为1%?5% ;前述发酵步骤具体为在25°C?37°C下，以150 rpm?250 rpm转速振荡培养16 h?60 h。在前述振荡培养过程中进行通风。
[0010]优选的，在前述浑浊红球菌DSM 1069接种于培养基之前，先将浑浊红球菌DSM1069置于种子培养基中进行活化培养得到种子液，再将种子液添加至前述步骤S2制备得到的培养基中进行振荡培养。
[0011]进一步优选的，种子培养基的配方为:IL种子培养液中添加30 g大豆胰化蛋白HTrypticase Soy调节 pH 值为 7 ?7.5。
[0012]进一步的优选的，前述步骤S3中经过振荡培养得到的菌体利用调节pH值的方法与碱木质素基质分离，具体为:用2 M NaOH溶液调节发酵液的pH为10?13使碱木质素溶解,在4000 rpm?10000 rpm转速下分离得到菌体,将菌体采用生理盐水洗漆后冷冻干燥，备用。
[0013]进一步的，前述S4步骤中前述酯交换反应具体包括以下步骤:前述S4步骤中前述酯交换反应具体包括以下步骤:将菌体加入含有氯仿和甲醇的混合溶液中，以浓硫酸为催化剂于90°C?100°C条件下反应微生物油脂。优选的，前述反应时间为2?3 h。
[0014]进一步优选的，前述菌体和甲醇的质量体积比为3mg?1mg:1mL?5mL。
[0015]进一步的，前述营养液包括0.5 g/L?I g/L的(NH4)2SO4'0.5 g/L?1.5 g/L的MgSO4.7Η20、0.010 g/L ?0.015 g/L 的 CaCl2.2Η20、0.5 ml/L ?1.5 ml/L 的微量元素液、0.5 ml/L?1.5 ml/L的Stock A溶液和30 ml/L?40 ml/L的磷酸盐缓冲液。
[0016]进一步的，前述微量元素液包括0.3 g/L?0.6 g/L的FeSO4.7H20、0.3 g/L?0.5 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L ?0.02 g/L 的 MnSO4.H2O,0.010 g/L ?0.020 g/L 的H3BO3>0.005 g/L ?0.015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L ?0.25 g/L 的 EDTA、0.04 g/L ?0.06 g/L 的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L ?0.006 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0017]进一步的，前述Stock A 溶液包括 1.5 g/L ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2H20 及 4.0 g/L?5.0 g/L的乙二胺四乙酸铁钠(FeNa.EDTA)。
[0018]进一步的,前述磷酸盐缓冲液包括110 g/L?115 g/L的K2HPO4、45 g/L?48 g/L 的 KH2PO4。
[0019]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述的微生物油脂或前述的制备方法制备得到的微生物油脂作为原料在制备生物柴油或食品添加剂中的应用。
[0020]本发明的创新点在于:
基于碱木质素结构复杂难以被微生物直接利用的特点，本发明首次将碱木质素进行氧降解，并作为产油微生物的碳源。在氧降解的过程中，碱木质素发生复杂结构变化，脂肪醚及醇类结构(木质素单体之间连接键)断裂，同时羧基含量增加，木质素溶解性增强。反应过程还伴随少量缩合结构的形成。另一方面，氧降解后碱木质素大分子结构发生一定程度的破碎，表面积增大，有利于微生物对其进行利用。
[0021]自然界中的产油微生物，如浑浊红球菌DSM 1069，可降解木质素模型物并在体内积累油脂。
[0022]与现有技术相比，本发明的优点在于: (I)本发明采用微生物发酵发制备微生物油脂，与传统的油脂生产相比，微生物可以利用多种碳源，且生产周期短，不受季节和地域的影响，易于大规模连续生产。
[0023](2)本发明采用经过氧降解处理后的碱木质素为碳源，通过废物回收利用减少了环境污染，同时为生物油脂的生产提供更广泛的原料来源，有助于促进生物柴油推广中成本的降低，解决现有技术中碱木质素的利用率不高、生物柴油的原料成本过高的技术问题。
[0024](3)本发明采用(NH4) 2S04、MgSO4.7H20、CaCl2.2H20、微量元素液、Stock A 溶液和磷酸盐缓冲液作为产油微生物发酵的营养液，可为细菌生长提供必需的氮源及微量元素，成本低廉，操作简易。
[0025](4)本发明微生物油脂为脂肪酸甲酯，以C16和C18为主，可应用于生物柴油的制备；本发明的微生物油脂与一般植物油类似，可推广应用于其他领域，如食品添加剂的原料。将本发明的微生物油脂作为原料在制备生物柴油或食品添加剂中的应用具有工艺简单，运行成本低，改进空间大，有利于工业化生产的潜在价值等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0027]图1为实施例1中微生物油脂的生产流程图。
[0028]图2为实施例1中产油阶段的细菌生长，油脂积累及基质消耗随时间的变化情况示意图。
【具体实施方式】
[0029]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0030]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售，其中浑池红球菌(Modococcusopacus) DSM 1069,购买于德国微生物及细胞培养中心，DSMZ,www.dsmz.de。碱木质素购买于 Sigma-Aldrich 公司。
[0031]实施例1
一种微生物油脂，该微生物油脂以经过氧降解的碱木质素为碳源，经浑浊红球菌{Rhodococcus opacus) DSM 1069发酵后,通过酯交换反应制备得到。
[0032]参见图1，一种上述本实施例的微生物油脂的制备方法，具体包括以下步骤:
S1:将碱木质素进行氧降解处理，具体步骤为:称取3 g碱木质素,溶于2.5 wt%的氢氧化钠溶液中，在高压釜中以100 psi氧压，在100°C下通氧反应I小时得到经过氧降解处理的喊木质素溶液(在80°C?150°C下以10psi?150psi通氧反应30min?90min均可实现氧降解处理)。调节碱木质素溶液的PH为3，经过离心，分离出碱木质素沉淀(由于碱木质素不溶于酸性溶液中，调节碱木质素的PH为2?4均可实现碱木质素的分离)，将碱木质素沉淀洗涤后冷冻干燥得到经过氧降解处理的碱木质素。
[0033]S2:取1.5g经过氧降解处理的碱木质素溶于200mL的营养液中得到培养基(碱木质素与营养液的质量体积比为I g?3 g: 200 mL均可实施)。其中营养液配方为:在I L去离子水中添加 1.0 g 的(NH4) 2S04、1.0 g 的 MgSO4.7Η20、0.015 g 的 CaCl2.2H20、1.0 ml的微量元素液、1.0 ml的Stock A溶液和35.2 ml的磷酸盐缓冲液。
[0034]在前述营养液配方中，微量元素液包括具有以下成分的去离子水溶液:0.5 g/L的FeSO4.7Η20、0.4 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.02 g/L 的 MnSO4.H2O,0.015 g/L 的 Η3Β03、0.01 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.25 g/L 的 EDTA、0.05 g/L 的 CoCl2.6Η20、0.005 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0035]Stock A溶液包括具有以下成分的去离子水溶液:2 g/L的NaMoO4.2Η20及5.0 g/L的乙二胺四乙酸铁钠(FeNa.EDTA )。
[0036]磷酸盐缓冲液的配制方法为:取113 g的K2HPO4和47g的KH2PO4溶于IL去离子水中。
[0037]S3:在固体培养基中取浑浊红球菌DSM 1069接入已经过无菌处理的种子培养基中进行活化培养得到种子液；种子培养基的配方为:1L种子培养液中添加30 g大豆胰化蛋白胨Soy调节pH值为7.2(7?7.5均可实施)。将种子液用步骤S2中的营养液洗涤三次，按接种量为1%，将浑浊红球菌DSM 1069接入到步骤S2制得的培养基中进行发酵，发酵条件为:温度30°C，转速150 rpm，振荡培养7天，于振荡培养开始后每间隔12小时取样，得到发酵液。
[0038]在制备得到的发酵液中分离菌体，具体采用调节pH值得方法与碱木质素基质分离:用2 M NaOH溶液调节发酵液pH为12 (pH为10?13均可实施)使碱木质素溶解，6000rpm转速下(转速为4000?10000 rpm均可实施)分离得到菌体,将菌体采用生理盐水进行洗涤后冷冻干燥，备用。
[0039]S3步骤中浑浊红球菌DSM 1069的接种量还可以为1%?5% ;发酵过程在25V?37°C下，以150rpm?250rpm转速振荡培养均可实施，振荡培养的时间优选为16 h?60 h。
[0040]S4:将前述S3步骤中制备得到的菌体进行酯交换反应得到微生物油脂，具体步骤为:
收集3 mg菌体，加入2 mL氯仿，1.7 mL甲醇，0.3 mL浓硫酸，于100°C条件下反应140分钟(菌体和甲醇的质量体积比3mg?1mg:1mL?5mL ;反应时间为2h?3h均可实施)，菌体中的甘油三酯与醇发生酯交换反应生成长链脂肪酸甲酯，冷却后加入2 mL去离子水，振荡5分钟，静置分层后移出有机相部分，真空干燥，得到脂肪酸甲酯。
[0041]取S4步骤中得到的脂肪酸甲酯，加入I mL氯仿完全溶解，进行气相色谱-质谱联用仪的分析，分析结果如图2所示:细菌油脂的较高含量出现在16 h?60 h，最大含量出现在36 h，为14% (油脂质量占细菌干重的百分数)，碱木质素降解可达到28%;油脂产量为
0.067 mg/mL，其中棕榈酸(C16)占46.9 %，硬脂酸(C18)占42.7 %。图2中，菌体干重表示细胞菌体冷冻干燥后的干重。
[0042]按照本发明制备方法制备得到微生物油脂为脂肪酸甲酯，以C16和C18为主，与一般植物油类似，可应用于生物柴油的制备以及其他领域，如食品添加剂的原料。
[0043]实施例1所米用的营养液仅为本发明优选的营养液，在本发明中营养液的成分还可以包括以下组分:0.5 g/L?I g/L 的(NH4)2S04、0.5g/L?1.5g/I^3MgS04*7H20、0.010g/L ?0.015g/L 的 CaCl2.2H20、0.5ml/L ?1.5ml/L 的微量元素液、0.5ml/L ?1.5ml/L 的Stock A溶液和30ml/L?40ml/L的磷酸盐缓冲液。
[0044]微量元素液包括以下组分:0.3 g/L?0.6 g/L的FeSO4.7Η20、0.3 g/L?0.5 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L ?0.02 g/L 的 MnSO4.H20、0.010 g/L ?0.020 g/L 的 H3BO3、0.005 g/L ?(λ 015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L ?(λ 25 g/L 的 EDTA、0.04 g/L ?(λ 06g/L 的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L ?0.006 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0045]Stock A 溶液包括 1.5 g/L ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2H20 及 4.0 g/L ?5.0 g/L 的乙二胺四乙酸铁钠(FeNa.EDTA)。
[0046]磷酸盐缓冲液包括以下组分:110 g/L?115 g/L的K2HPO4、45 g/L?48 g/L的KH2PO4。
[0047]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【权利要求】
1.一种微生物油脂，其特征在于，所述微生物油脂以经过氧降解的碱木质素为碳源，经浑池红球菌(/Soi/ococciAs opacus) DSM 1069发酵后,通过酯交换反应制备得到。
2.一种如权利要求1所述的微生物油脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51:将碱木质素进行氧降解处理； 52:将经过氧降解处理的碱木质素与营养液混合得到培养基； 53:将浑池红球菌(TSotZococciAs opacus) DSM 1069添加至所述步骤S2制备得到的培养基中进行发酵得到发酵液，将所述发酵液分离得到菌体； 54:将所述S3步骤中制备得到的菌体进行酯交换反应得到微生物油脂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述SI步骤中所述氧降解处理的步骤具体为:将所述碱木质素溶于氢氧化钠溶液中，在80°C?150°C下以100 psi?150 psi通氧反应30 min?90 min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中所述经过氧降解处理的碱木质素与所述营养液的质量体积比为I g?3 g: 200 mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S3步骤中所述浑浊红球菌DSM1069的接种量为1%?5% ;所述发酵步骤具体为在25°C?37°C下，以150 rpm?250 rpm转速振荡培养16 h?60 h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S4步骤中所述酯交换反应具体包括以下步骤:将菌体加入含有氯仿和甲醇的混合溶液中，以浓硫酸为催化剂于90°C?100°C下反应得到微生物油脂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述菌体和甲醇的质量体积比为3mg ?1mg ； ImL ?5mL。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述营养液包括0.5g/L ?I g/L 的(NH4) 2S04、0.5 g/L ?1.5 g/L 的 MgSO4.7Η20、0.010 g/L ?0.015 g/L 的CaCl2.2Η20、0.5 ml/L ?1.5 ml/L 的微量元素液、0.5 ml/L ?1.5 ml/L 的 Stock A 溶液和30 ml/L?40 ml/L的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素液包括0.3 g/L?0.6g/L 的 FeSO4.7Η20、0.3 g/L ?0.5 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L ?0.02 g/L 的 MnSO4.H2O、0.010 g/L ?0.020 g/L 的 H3BO3、0.005 g/L ?0.015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L ?0.25g/L 的 EDTA、0.04 g/L ?0.06 g/L 的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L ?0.006 g/L 的 CuCl2.2Η20 ；所述 Stock A 溶液包括 1.5 g/L ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2Η20 及 4.0 g/L ?5.0 g/L 的乙二胺四乙酸铁钠；所述磷酸盐缓冲液包括110 g/L?115 g/L的K2HPO4,45 g/L?48 g/L的KH2PO4。
10.一种如权利要求1所述的微生物油脂或权利要求2?9任一项所述的制备方法制备得到的微生物油脂作为原料在制备生物柴油或食品添加剂中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK104357500SQ201410600214
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】曾光明, 危臻, 黄丹莲, 赖萃, 黄超, 许飘, 李宁杰, 程敏, 张辰, 刘媛媛 申请人:湖南大学