一种快速检测北方优质杂交粳稻隆优619纯度的技术方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测北方优质杂交粳稻隆优619纯度的技术方法。本发明解决了传统的田间种植检测费工费时、检测结果易受环境的影响，可较早预知杂交种纯度，便于安排下一步工作计划。该方法包括下列步骤：①供试材料DNA的提取；②针对隆优619的父母本特征特性，利用专利中的恢复基因Rfla分子标记InDel-Rfla，香味基因fgr的InDel功能标记GRFM04对提取的DNA进行PCR扩增检测；③对扩增DNA片段进行比较分析。该套标记用于水稻杂交种纯度和真伪鉴定，不仅具有环境的稳定性、品种间变异的可识别性及实验结果的可靠性等基本特点，在应用上还具有快速、简便、低成本的优点，适合于大样品的杂交种隆优619种子纯度快速分析、假冒伪劣品种的检测鉴定、分子标记辅助育种等方面的应用。
【专利说明】一种快速检测北方优质杂交粳稻隆优619纯度的技术方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用分子标记快速检测杂交粳稻619纯度的技术方法。该方法主 要是根据品种特性，依靠分子检测技术，利用分子标记对杂交水稻种子基因片段进行鉴定， 由于是直接反映 DNA水平的差异，所以准确率可以达到99. 99%，且鉴定时间缩短到3-4小 时。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国的第一大粮食作物，占世界稻米总产量的1/3。目前水稻育种方法仍 以杂交育种和杂种优势利用为主，其它方法为辅。通过杂交育种，水稻在产量方面实现了大 突破。杂交稻播种面积大，种子销售利润高，在我国粮食生产中占有十分重要地位。杂交水 稻种子纯度好坏直接影响杂交优势的强弱和产量高低。因此，从种子生产开始，直至收、运、 贮、售等过程中都要十分注意严格防止生物混杂和机械混杂。此外，人为造假导致的坑农事 件曾给农业生产带来巨大损失。
[0003] 种子的纯度检测是杂交种生产上的一项重要工作，直接关系到农业的发展和农民 的切身利益，因此受到国家的高度重视。为了确保生产用种安全，常规的种子纯度鉴定方法 是海南加代种植，进行形态学鉴定。通过田间种植即生长测验鉴别种子纯度，但这种检测方 法费时费工，不利于下一步的工作安排，且检测结果易受生长季节和环境的限制，不利于种 子鉴定的商品化运作和司法举证。因此，根据水稻品种特征特性，结合分子检测杂交种子的 纯度是一个很好的选择。
[0004] 目前蛋白质指纹鉴定技术具有分辨率高、多态性高，并且具有重演性、高度的个体 特异性和环境稳定性，因此能鉴别生物个体之间的微小差异，被用于种子的纯度鉴定等。美 国、加拿大、法国已经把这一技术运用于种子真伪和纯度检测，但在我国利用该方法检测种 子春娣还存在困难，原因是该方法复杂、技术难度大、成本昂贵。近20年来，随着基因组计 划研宄的不断深入，DNA分子标记得到了迅速发展并被广泛用于分子生物学研宄的各个领 域。已经发展起来的分子标记多达60多种，如RFLP、RFAP、SSR、SNP、InDel等，这些标记无 疑为各种品种鉴定提供了坚实的技术基础。
[0005] 多条分子标记固然可以鉴定杂交组合的纯度和真实性，但无疑增加了鉴定的经济 成本和时间。因此，在杂交种子生产过程中，根据父母本含有的特殊基因型，减少分子标记 的使用，达到纯度鉴定的理想结果。本研宄在对北方优质杂交粳稻隆优619的父本和母本 已检测含有恢复基因 Rfla和香味基因 fhr的基础上，对杂交种子用这两个基因的分子功能 标记进行纯度的鉴定。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速检测北方优质杂交粳稻隆优619的技术方法，该 套方法用于隆优619的纯度鉴定，不仅具有环境的稳定性、实验结果的可靠性等基本特性， 在应用上还具有快速、简便、低成本的鉴定，适用于大样品的种子纯度快速分析、假冒伪劣 品种的检测鉴定及分子标记辅助育种。该方法由原来大量的田间种植鉴定工作转变为简单 的实验室操作，较准确快速检测隆优619的纯度，节省人力资源，提高工作效率和准确度。 将有力促进保护品种选育和合法经营者的合法权益以及育种研宄的科技创新。
[0007] 为实现以上目的，本发明的技术方案步骤如下：
[0008] 1. 一种快速检测北方优质杂交粳稻隆优619纯度的技术方法，其特征在于：
[0009] 对于收获的北方优质杂交粳稻隆优619进行浸种催芽、DNA提取、PCR扩增、电泳检 测及分析，最后统计杂交种纯度。
[0010] 2.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中收获的北方优质杂交粳稻隆优 619浸种时具有随机性，且种子含水量控制在14 %左右，符合大田种植规律。
[0011] 3.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中浸种催芽时，每个培养皿选择 50?100粒种子，加清水15ml，25?28°C光照培养10-15天左右，待幼苗长至3-4叶期开 始取样。取样时具有随机性，不区分幼苗大小、强弱，每个完整植株的根、茎、叶放入一个2ml 离心管，取样群体可根据实验条件决定，至少100株以上，以备DNA提取。
[0012] 4.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中DNA提取，已加样的2ml离心管 中放入直径2. 75mm和4. 75mm大小不同的普通钢珠，加入800 y I SDS提取液，在高通量组织 研磨仪上研磨，频率为55HZ、时间为180S。研磨后65°C水浴30分钟左右。在水雨后的离心 管中加入800 yl酚：氯仿：异戊醇25 : 24 : 1，体积比，充分混匀，台式离心机IOOOOrpm 离心lOmin，取上清500 y 1转移至另一 I. 5ml离心管。然后进行第二次抽提，加入500 y 1 酷：氯仿：异戊醇25 : 24 : 1，体积比，充分混勾，台式离心机IOOOOrpm离心lOmin，取 上清400 y 1转移至另一 I. 5ml离心管。加入320 y 1异丙醇，混匀，4°C或冰上放置20min， IOOOOrpm离心lOmin，倒掉上清液，将离心管倒置10-15min左右滤干酒精，然后将DNA溶于 100 U 1双蒸水，-20°C保存备用。DNA溶液稀释15倍，用于PCR扩增。
[0013] 5.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中PCR扩增时，根据隆优619的 品种特性选择分子标记。经过基因检测，隆优619母本含有香味基因 fgr，父本含有恢复基 因 Rf la，所以选择香味基因的相关分子标记GRFM04 (F :3 '-GTTAGGTTGCAITTACTGGGAG-5'， R :3 '-GAATGATGCTCAAAGTGTCT-5'）和恢复基因的相关分子标记 InDel-Rfla(F : 3 '-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-5'，R:3 '-TAACGCGTCTTCCATCCTACT-5'）进行 PCR 扩增。
[0014] (1)扩增反应体系如下：
[0015]
【权利要求】
1. 一种快速检测北方优质杂交粳稻隆优619纯度的技术方法，其特征在于： 对于收获的北方优质杂交粳稻隆优619进行浸种催芽、DNA提取、PCR扩增、电泳检测及 分析，最后统计杂交种纯度。
2. 根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中收获的北方优质杂交粳稻隆优619浸 种时具有随机性，且种子含水量控制在14 %左右，符合大田种植规律。
3. 根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中浸种催芽时，每个培养皿选择50? 100粒种子，加清水15ml，25?28°C光照培养10-15天左右，待幼苗长至3-4叶期开始取 样。取样时具有随机性，不区分幼苗大小、强弱，每个完整植株的根、茎、叶放入一个2ml离 心管，取样群体可根据实验条件决定，至少100株以上，以备DNA提取。
4. 根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中DNA提取，已加样的2ml离心管中放 入直径2. 75mm和4. 75mm大小不同的普通钢珠，加入800μISDS提取液，在高通量组织研 磨仪上研磨，频率为55ΗΖ、时间为180S。研磨后65°C水浴30分钟左右。在水雨后的离心 管中加入800μ1酚：氯仿：异戊醇25 : 24 : 1，体积比，充分混匀，台式离心机IOOOOrpm 离心lOmin，取上清500μ1转移至另一I. 5ml离心管。然后进行第二次抽提，加入500μ1 酷：氯仿：异戊醇25 : 24 : 1，体积比，充分混勾，台式离心机IOOOOrpm离心lOmin，取 上清400μ1转移至另一I. 5ml离心管。加入320μ1异丙醇，混匀，4°C或冰上放置20min， IOOOOrpm离心lOmin，倒掉上清液，将离心管倒置10-15min左右滤干酒精，然后将DNA溶于 100μ1双蒸水，_20°C保存备用。DNA溶液稀释15倍，用于PCR扩增。
5. 根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中PCR扩增时，根据隆优619的品种 特性选择分子标记。经过基因检测，隆优619母本含有香味基因fgr，父本含有恢复基因 RfIa，所以选择香味基因的相关分子标记GRFM04(F: 3 ' -GTTAGGTTGCATTTACTGGGAG-5 '， R:3 '-GAATGATGCTCAAAGTGTCT-5'）和恢复基因的相关分子标记InDel-Rfla(F: 3 '-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-5'，R:3 '-TAACGCGTCTTCCATCCTACT-5'）进行PCR扩增。 (1) 扩增反应体系如下： 2XTaqPCRMix 5μ1 前引物（浓度ΙΟμιη) 0.2μ1 后引物（浓度ΙΟμιη) 0.2μ1 ddH20 3.6μ1 稀释15倍后的总DNAΙμ? (2) 扩增反应条件 香味基因的相关分子标记GRFM04扩增反应条件如下： 94°C预变性 5min;94°Clmin，55°Clmin，72°C2min，共 35 个循环；最后进行 72°C延伸 5min。4°C保存待用。 恢复基因的相关分子标记InDel-Rfla扩增反应条件如下： 94°C预变性 5min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，共 35 个循环；最后进行 72°C延伸 7min。4°C保存待用。 (3) 电泳检测：香味基因的相关分子标记GRFM04扩增后的产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测，恢复基因的相关分子标记InDel-Rfla扩增后的产物用3%琼脂糖凝胶进行检测。凝 胶成像仪中观察有无多态并照相保存。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤1中纯度统计如下：香味基因条带大小为 209bp，非香味基因条带大小为201bp;恢复基因条带大小为1145bp，非恢复基因条带大小 为575bp。两者分别进行条带读取，综合考虑进行纯度计算。真正的杂交种是香味基因和恢 复基因都是杂合条带；恢复系是恢复基因纯合，无香味基因；不育系是无恢复基因，香味基 因纯合；如存在其他条带情况则划分为杂株或者有可能是父母本制种纯度不够导致。
【文档编号】C12Q1/68GK104450944SQ201410837719
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】亓娜, 李志彬, 刘欣, 朱崴, 刘桂林, 肖艳云, 曲丽君 申请人:天津天隆农业科技有限公司