一种基于磁珠法提取真菌基因组dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，通过真菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA三个步骤得到真菌基因组DNA。常规的真菌基因组DNA的提取方法通常是利用无水乙醇低温沉淀基因组，往往需要耗时20h以上，而本发明基于磁珠法提取真菌基因组DNA，仅需要不到8h的时间，便可提取得到真菌基因组DNA。本发明与常规的真菌基因组DNA提取方法相比，能够有效、快速、经济地提取到真菌基因组DNA，节省了大量提取时间，适用于商业化生产，具有可观的经济价值。
【专利说明】一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方 法。
【背景技术】
[0002] 真菌是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母。现 在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分入动物或植 物，现在成为自己的界，分为四门。真菌自成一门，和植物、动物和细菌相区别。真菌和其他 三种生物最大的不同之处在于，真菌的细胞有含甲壳素（又叫几丁质、甲壳素、壳多糖）为 主要成分的细胞壁，和植物的细胞壁主要是由纤维素组成的不同。
[0003] 完整真菌基因组的测序为真核界乃至整个生物界进化研宄提供了空前的机会，重 要的人类病原菌、植物病原菌和腐生菌基因组序列的测定，不仅推动繁殖方式的选择、顶端 生长、致病机制、宿主-真菌相互作用等基础研宄，还能更好地寻找抗菌药物靶点，促进疫 苗和抗菌药物的开发研制。应用比较基因组学方法研宄真菌基因组有助于人们理解不同生 态环境下真菌的生理特性、形态差异、进化和代谢多样性。
[0004] 因此，为了更好地研宄真菌的遗传信息，需要提取真菌基因组DNA。而常规的提取 真菌基因组DNA样品的方法，存在提取时间长的缺陷。如果能够实现有效、快速的提取真菌 基因组DNA，就能为后续进行基因分析与基因克隆提供重要保证，从而丰富基因组学的研宄 内容。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于解决使用常规方法所获得的真菌基因组DNA样品提取时间长 的问题，提供一种方便、快捷、实用的基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，包括真菌细胞的破碎，DNA的游离与 杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，所述方法具体包括以下步骤：
[0008] 1)真菌细胞的破碎：挑取真菌样本于研钵中，加入液氮研磨成真菌粉末，将真菌 粉末加入1.5ml离心管中，每0. 3-lg真菌样本对应的真菌粉末加入200-700ml工作液 A，20-50 y 1工作液B和10-50 y 1工作液C，然后于50-60°C温浴5-10h ;
[0009] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入200-700 y 1工作液D抽提， 10000-15000rpm/min离心5_15min，然后将一次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管中，加入 500 y 1工作液E抽提，10000-15000rpm/min离心5_15min，然后将二次上清液转移至无菌的 1. 5ml离心管中；
[0010] 3)磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液 等体积的工作液F，震荡10-30s后，室温放置l-10min，将离心管放在磁力架上，进行一次磁 珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入〇. 5-1. 5ml工作液G，打匀后 室温静置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行二次磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后 往含有磁珠的离心管中加入30-60 y 1工作液H，将离心管放在磁力架上，进行三次磁珠分 离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此液体即为真菌基因组DNA ;后续于1 %琼脂糖 凝胶中电泳检测；
[0011] 所述工作液A由终浓度0? 08-0. lmol/L氯化钠（NaCl)，终浓度0? 08-0. 16mol/ L三羟甲基氨基甲烷（Tris)和终浓度0? 03-0. 06mol/L乙二胺四乙酸（EDTA)组成，pH = 7. 0-9. 0 ；
[0012] 所述工作液B为10-20mg/ml蛋白酶K ;
[0013] 所述工作液C为质量浓度5-15%的十二烷基硫酸钠（SDS);
[0014] 所述工作液D是体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0015] 所述工作液E是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0016] 所述工作液F是体积比为氯化钠：异丙醇：磁珠混悬液=1:47:2的混悬液，所述 氯化钠浓度为5mol/L，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
[0017] 所述工作液G由终浓度4. 3-21.4mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，终浓度 2. 1-4. 2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)，终浓度42. 9-85. 7mmol/L氯化钠（NaCl)和体积终浓 度60-80 %无水乙醇组成；
[0018] 所述工作液H为5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH= 7. 0-9. 0。
[0019] 所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品 编号：AK1-G1000。
[0020] 本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如所述工作液A由终浓度 0? 08-0. lmol/L氯化钠（NaCl)，终浓度0? 08-0. 16mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)和终浓 度0. 03-0. 06mol/L乙二胺四乙酸（EDTA)组成，pH = 7-9,是指氯化钠在工作液A中的浓度 为0? 08-0. lmol/L，Tris在工作液A中的浓度为0? 08-0. 16mol/L，EDTA在工作液A中的浓 度为 0? 03-0. 06mol/L,工作液 A 的 pH = 7. 0-9. 0。
[0021] 进一步，所述工作液A由终浓度0.lmol/L氯化钠，终浓度0.lmol/L三羟甲基氨基 甲烷和终浓度0. 06mol/L乙二胺四乙酸组成，pH = 8. 0。
[0022] 进一步，所述工作液B为20mg/ml蛋白酶K。
[0023] 进一步，所述工作液C为质量浓度10%的十二烷基硫酸钠。
[0024] 进一步，所述工作液G由终浓度8. 6mmol/L三羟甲基氨基甲烷，终浓度3. 4mmol/ L乙二胺四乙酸，终浓度60mmol/L氯化钠和体积终浓度70%无水乙醇组成。
[0025] 进一步，所述工作液H为8mmol/L三轻甲基氨基甲烧，pH = 8. 0。
[0026] 本发明采用以上技术方案，通过真菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁 珠法快速纯化基因组DNA三个步骤得到真菌基因组DNA。常规的真菌基因组DNA的提取方法 通常是利用无水乙醇低温沉淀基因组，往往需要耗时20h以上，而本发明主要通过磁珠对 基因组进行吸附，硅基磁珠表面固定有亲水性阴离子交换剂，它可以特异的吸附带负电的 基因组DNA分子，而对其他生物材料基本不吸附，磁珠具有磁性，可以被磁铁吸附，通过磁 力架可以将附有基因组DNA的磁珠吸附在离心管壁上，可以保障最大程度地回收样品中的 核酸，同时去除其他杂质，操作简便，仅需要不到8h的时间，便可提取得到真菌基因组DNA。
[0027] 本发明与常规的真菌基因组DNA提取方法相比，能够有效、快速、经济地提取到真 菌基因组DNA，节省了大量提取时间，适用于商业化生产，具有可观的经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为本发明方法提取的真菌基因组DNA的电泳检测图：泳道1，2,3分别 是本发明方法提取的酵母菌、镰刀菌、青霉菌的基因组DNA，泳道4为TAKARA公司的 DL4500Marker〇
【具体实施方式】
[0029] -种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，包括真菌细胞的破碎，DNA的游离与 杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
[0030] 1)真菌细胞的破碎：挑取真菌样本于研钵中，加入液氮研磨成真菌粉末，将真菌 粉末加入1.5ml离心管中，每0. 3-lg真菌样本对应的真菌粉末加入200-700ml工作液 A，20-50 y 1工作液B和10-50 y 1工作液C，然后于50-60°C温浴5-10h ;
[0031] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入200-700 yl工作液D抽提， 10000-15000rpm/min离心5_15min，然后将一次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管中，加入 500 y 1工作液E抽提，10000-15000rpm/min离心5_15min，然后将二次上清液转移至无菌的 1. 5ml离心管中；
[0032] 3)磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液 等体积的工作液F，震荡10-30s后，室温放置l-10min，将离心管放在磁力架上，进行一次磁 珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入〇. 5-1. 5ml工作液G，打匀后 室温静置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行二次磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后 往含有磁珠的离心管中加入30-60 y 1工作液H，将离心管放在磁力架上，进行三次磁珠分 离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此液体即为真菌基因组DNA ;后续于1 %琼脂糖 凝胶中电泳检测；
[0033] 所述工作液 A 由终浓度 0? 08-0. lmol/L NaCl，终浓度 0? 08-0. 16mol/L Tris 和终 浓度 0? 03-0. 06mol/L EDTA 组成，pH = 7. 0-9. 0 ;
[0034] 所述工作液B为10-20mg/ml蛋白酶K;
[0035] 所述工作液C为质量浓度5-15%的SDS ;
[0036] 所述工作液D是体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0037] 所述工作液E是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0038] 所述工作液F是体积比为氯化钠：异丙醇：磁珠混悬液=1:47:2的混悬液，所述 氯化钠浓度为5mol/L，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
[0039] 所述工作液 G 由终浓度 4. 3-21. 4mmol/L Tris,终浓度 2. 1-4. 2mmol/L EDTA,终 浓度42.9-85.7臟〇1/1恥(：1和体积终浓度60-80%无水乙醇组成；
[0040] 所述工作液 H 为 5-10mmol/LTris，pH = 7. 0-9. 0 ;
[0041] 所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品 编号：AK1-G1000。
[0042] 实施例1
[0043] 一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，包括真菌细胞的破碎，DNA的游离与 杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤： [0044] 1)真菌细胞的破碎：分别挑取0. 5g酵母菌、镰刀菌、青霉菌样本于研钵中，加入液 氮研磨成粉末，将粉末加入1. 5ml离心管中，加入500ml工作液A，30 y 1工作液B和30 y 1 工作液C，然后于55°C温浴6h ;
[0045] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入500 yl工作液D抽提， 12000rpm/min离心lOmin，然后将一次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管中，加入500 y 1 工作液E抽提，12000rpm/min离心lOmin，然后将二次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管 中；
[0046] 3)磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液 等体积的工作液F，震荡30s后，室温放置lOmin，将离心管放在磁力架上，进行一次磁珠分 离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入lml工作液G，打匀后室温静置 5min，将离心管放在磁力架上，进行二次磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的 离心管中加入30 y 1工作液H，将离心管放在磁力架上，进行三次磁珠分离，待磁珠吸附到 离心管一侧时吸取液体，此液体即为真菌基因组DNA;后续于1 %琼脂糖凝胶中电泳检测；
[0047] 所述工作液A由终浓度0?lmol/LNaCl，终浓度0?lmol/LTris和终浓度0? 06mol/ LEDTA组成，pH= 8. 0 ;
[0048] 所述工作液B为20mg/ml蛋白酶K;
[0049] 所述工作液C为质量浓度10 %的SDS;
[0050] 所述工作液D是体积比为酷：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0051] 所述工作液E是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0052] 所述工作液F是体积比为氯化钠：异丙醇：磁珠混悬液=1:47:2的混悬液，所 述氯化钠浓度为5mol/L，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成， 所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号： AK1-G1000 ；
[0053] 所述工作液G由终浓度8. 6mmol/LTris,终浓度3. 4mmol/LEDTA,终浓度60mmol/ LNaCl和体积终浓度70 %无水乙醇组成；
[0054] 所述工作液 H 为 8mmol/LTris, pH = 8. 0 ；
[0055] 实施例2
[0056] -种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，包括真菌细胞的破碎，DNA的游离与 杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
[0057] 1)真菌细胞的破碎：挑取0. 3g酵母菌于研钵中，加入液氮研磨成真菌粉末，将真 菌粉末加入1. 5ml离心管中，加入200ml工作液A，20 y 1工作液B和10 y 1工作液C，然后 于50°C温浴10h ;
[0058] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入200 yl工作液D抽提， 10000rpm/min离心15min，然后将一次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管中，加入500 y 1 工作液E抽提，10000rpm/min离心15min，然后将二次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管 中；
[0059] 3)磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液 等体积的工作液F，震荡10s后，室温放置lmin，将离心管放在磁力架上，进行一次磁珠分 离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入0. 5ml工作液G，打匀后室温静 置lOmin，将离心管放在磁力架上，进行二次磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁 珠的离心管中加入45 y 1工作液H，将离心管放在磁力架上，进行三次磁珠分离，待磁珠吸 附到离心管一侧时吸取液体，此液体即为真菌基因组DNA ;后续于1 %琼脂糖凝胶中电泳检 测；
[0060] 所述工作液A由终浓度0? 08mol/L NaCl，终浓度0? 08mol/L Tris和终浓度 0? 03mol/L EDTA 组成，pH = 7. 0 ;
[0061] 所述工作液B为10mg/ml蛋白酶K;
[0062] 所述工作液C为质量浓度5 %的SDS;
[0063] 所述工作液D是体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0064] 所述工作液E是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0065] 所述工作液F是体积比为氯化钠：异丙醇：磁珠混悬液=1:47:2的混悬液，所述 氯化钠浓度为5mol/L，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
[0066] 所述工作液G由终浓度4. 3mmol/LTris，终浓度2. lmmol/LEDTA，终浓度 42.9臟〇1/1恥(：1和体积终浓度60%无水乙醇组成；
[0067] 所述工作液 H 为 5mmol/LTris, pH = 7. 0 ；
[0068] 所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品 编号：AK1-G1000。
[0069] 实施例3
[0070] 一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，包括真菌细胞的破碎，DNA的游离与 杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
[0071] 1)真菌细胞的破碎：挑取lg青霉菌于研钵中，加入液氮研磨成真菌粉末，将真菌 粉末加入1. 5ml离心管中，加入700ml工作液A，50 y 1工作液B和50 y 1工作液C，然后于 60°C 温浴 5h ;
[0072] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入700 yl工作液D抽提， 15000rpm/min离心5min，然后将一次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管中，加入500 y 1工 作液E抽提，15000rpm/min离心5min，然后将二次上清液转移至无菌的1. 5ml离心管中；
[0073] 3)磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液 等体积的工作液F，震荡20s后，室温放置5min，将离心管放在磁力架上，进行一次磁珠分 离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入1. 5ml工作液G，打匀后室温静 置lOmin，将离心管放在磁力架上，进行二次磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁 珠的离心管中加入60 y 1工作液H，将离心管放在磁力架上，进行三次磁珠分离，待磁珠吸 附到离心管一侧时吸取液体，此液体即为真菌基因组DNA ;后续于1 %琼脂糖凝胶中电泳检 测；
[0074] 所述工作液A由终浓度0? lmol/L NaCl，终浓度0? 16mol/L Tris和终浓度 0? 45mol/L EDTA 组成，pH = 9. 0 ;
[0075] 所述工作液B为15mg/ml蛋白酶K ;
[0076] 所述工作液C为质量浓度15 %的SDS;
[0077] 所述工作液D是体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0078] 所述工作液E是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0079] 所述工作液F是体积比为氯化钠：异丙醇：磁珠混悬液=1:47:2的混悬液，所述 氯化钠浓度为5mol/L，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
[0080] 所述工作液G由终浓度21. 4mmol/LTris，终浓度4. 2mmol/LEDTA，终浓度 85.7臟〇1/1恥(：1和体积终浓度80%无水乙醇组成；
[0081] 所述工作液 H 为 10mmol/LTris, pH = 9. 0 ；
[0082] 所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品 编号：AK1-G1000。
[0083] 图1为实施例1的方法提取的真菌基因组DNA的电泳检测图。其中，泳道1，2， 3分别是本发明方法提取的酵母菌、镰刀菌、青霉菌的基因组DNA，泳道4为TAKARA公司的 DL4500Marker。从图中可看出本方法能够快速提取到真菌的基因组DNA。
[0084] 提取到的真菌基因组DNA，其纯度用0D26Qmi/0D28Qmi比值来衡量，纯度见表1。
[0085] 表1真菌基因组DNA的纯度
[0086]
【权利要求】
1. 一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，包括真菌细胞的破碎，DNA的游离与杂 蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤： 1) 真菌细胞的破碎：挑取真菌于研钵中，加入液氮研磨成真菌粉末，将真菌粉末加入离 心管中，每0. 3-lg真菌样本对应的真菌粉末加入200-700ml工作液A，20-50 yl工作液B 和10-50 y 1工作液C，然后于50-60° C温浴5-10h ; 2. DNA的游离与杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入200-700 y 1工作液D， 10000-15000rpm/min离心5-15min，然后将一次上清液转移至无菌的离心管中，加入 500 y 1工作液E，10000-15000rpm/min离心5_15min，然后将二次上清液转移至无菌的离 心管中； 3) 磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液等体 积的工作液F，震荡10-30s后，室温放置l-10min，将离心管放在磁力架上，进行一次磁珠分 离，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入0. 5-1. 5ml工作液G，打匀后室 温静置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行二次磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，然后往 含有磁珠的离心管中加入30-60 y 1工作液H，将离心管放在磁力架上，进行三次磁珠分 离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此液体即为真菌基因组DNA ; 所述工作液A由终浓度0? 08-0. 1 mol/L氯化钠，终浓度0? 08-0. 16 mol/L三羟甲基氨 基甲烷和终浓度0. 03-0. 06 mol/L乙二胺四乙酸组成，pH=7. 0-9. 0 ; 所述工作液B为10-20mg/ml蛋白酶K ; 所述工作液C为质量浓度5-15%的十二烷基硫酸钠； 所述工作液D是体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液； 所述工作液E是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液； 所述工作液F是体积比为氯化钠：异丙醇：磁珠混悬液=1:47:2的混悬液，所述氯化钠 浓度为5 mol/L，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成； 所述工作液G由终浓度4. 3-21.4 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，终浓度2. 1-4. 2 mmol/ L乙二胺四乙酸，终浓度42. 9-85. 7 mmol/L氯化钠和体积终浓度60-80%无水乙醇组成； 所述工作液H为5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH=7. 0-9. 0。
2. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于： 所述工作液A由终浓度0. 1 mol/L氯化钠，终浓度0. 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷和终浓度 0. 06 mol/L乙二胺四乙酸组成，pH=8. 0。
3. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于： 所述工作液B为20mg/ml蛋白酶K。
4. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于： 所述工作液C为质量浓度10%的十二烷基硫酸钠。
5. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于： 所述工作液G由终浓度8. 6 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，终浓度3. 4 mmol/L乙二胺四乙 酸，终浓度60 mmol/L氯化钠和体积终浓度70%无水乙醇组成。
6. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于： 所述工作液H为8mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH=8. 0。
【文档编号】C12N15/10GK104450686SQ201410837352
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】王清水, 余彦 申请人:福建师范大学