一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)的方法及其试剂盒和引物对。该引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1所示和如序列表中SEQ ID NO.2所示。所述的方法包括以下步骤：(1)提取待检样品的基因组DNA作为模板，以核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增；(2)检测步骤(1)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。所述的检测方法检测时间短；检测成本低；检测结果可靠，可以应用于乳制品中干酪乳杆菌的检测。
【专利说明】一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引 物。
【背景技术】
[0002] 干酿乳杆菌（Lactobacillus casei)属于乳杆菌属（Lactobacillus)，是革兰 氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶；最适生长温度为 37°C，G+C含量为45. 6%?47. 2%;菌体长短不一，两端呈方形，常成链；菌落粗糙，灰白色， 有时呈微黄色，能发酵多种糖。干酪乳杆菌存在于人的口腔、肠道内含物和大便及阴道中， 也常常出现在牛奶和干酪、乳制品、饲料、面团和垃圾中。干酪乳杆菌是一种有益于人体健 康的益生菌。2001年卫生部公布了可用于保健食品中的益生菌菌种名单，其中包括干酪乳 杆菌及干酪乳杆菌干酪亚种（又叫副干酪乳杆菌）。目前我国对干酪乳杆菌的研究甚少。
[0003] 干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的 酶、胃液中低PH值和小肠的胆汁酸等。所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存 活，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有高效降血压、 降胆固醇、促进细胞分裂，产生抗体免疫、增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功 能；还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用。近年来，由于干酪乳杆菌对其宿主营养、 免疫、防病等具有显著的益生功效，越来越成为人们研究、开发、生产的焦点。而高血压人群 的增加使得对干酪乳杆菌的研究以及用其开发功能性乳制品的意义显得愈加重要。
[0004] 干酪乳杆菌作为益生菌之一被用作牛奶、酸乳、豆奶、奶油和干酪等乳制品的发酵 剂及辅助发酵剂，尤其在干酪中应用较多，为了适应干酪中的高含量盐及低PH值，需要通 过一些重要氨基酸的代谢以增加风味并促进干酪的成熟。近几年来，干酪乳杆菌越来越多 地用于乳制品中，但是其是否真正添加以及是否能够存活于乳制品中则需要乳品检测机构 进行快速鉴定。传统的检测方法费时费力，通常需要3?5天才能确定。此外，传统的检测 方法按照国标GB4789. 35-2010的要求，所需的样品量至少为25g或25mL，因此检测的灵敏 度通常> 4CFU/g或> 4CFU/mL，由上可知，传统的乳制品中干酪乳杆菌的检测方法其检测 效率较低，检测成本较高。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题在于克服现有传统技术检测时间长、费时费力、成本高 的缺陷，提供一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物。采用所述的方法检测干 酪乳杆菌，检测速度快，成本低，灵敏度高，检测结果特异性好，判定简单易行，并且检测食 品中的干酪乳杆菌菌株也结果准确可靠。
[0006] 本发明的目的是通过下列技术方案来实现的。
[0007] 本发明采用的技术方案之一是：一种特异性扩增干酪乳杆菌的引物对，其核苷酸 序列分别如序列表中SEQ ID NO. 1所示和如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 其中，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示的引物称为SEN2-L;核苷酸序列 如序列表中SEQ ID NO. 2所示的引物称为SEN2-R。所述引物SEN2-L和引物SEN2-R所扩增 的序列为干酪乳杆菌组氨酸激酶基因序列中的保守序列。
[0009] 本发明采用的技术方案之二是：一种用于特异性扩增干酪乳杆菌的试剂盒，其包 括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示和如序列表中SEQ ID NO. 2所示的引物对。
[0010] 较佳地，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+、Taq DNA聚合酶和CldH2O 中的一种或多种；更佳地，所述的试剂盒还包括基因组DNA抽提试剂。
[0011] 本发明采用的技术方案之三是：一种检测干酪乳杆菌菌株的方法，其包括以下步 骤：
[0012] (1)提取待检样品的基因组DNA作为模板，核苷酸序列分别为如序列表中SEQ ID NO. 1所示和如序列表中SEQ ID NO. 2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增；
[0013] (2)检测步骤（I)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。
[0014] 步骤⑴为提取待检样品的基因组DNA作为模板，核苷酸序列分别为如序列表中 SEQ ID NO. 1所示和如序列表中SEQ ID NO. 2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增。其 中，所述基因组DNA的提取方法为本领域常规的提取方法；较佳地为CTAB法；更佳地，所述 CTAB法提取基因组DNA包括以下的步骤：在待检样品中加入EDTA(500mM，pH8. 0) ;4°C下 6500g离心30分钟后，-20°C静置10分钟；室温下溶解后再加入去离子水，12000r/min离 心5min，弃上清；加入TE缓冲液，37°C水浴l_2h ;加入10% SDS，68°C烘干15min ;加入5M NaCl，1% CTAB，68°C烘干 15min ;加入苯酚，氯仿-异戊醇（24: l，v/v)，静置，12000r/min 离 心IOmin ;取上清加入等体积氯仿-异戊醇（24:1，v/v)，12000r/min离心5min，取上清，力口 入冰无水乙醇，_20°C放置2h ;10000r/min离心2min，弃上清，加入70%乙醇清洗，12000r/ min离心2min，弃上清后室温下风干，即可。
[0015] 所述PCR扩增的反应体系为本领域常规的反应体系；较佳地为IXPCR反应缓 冲液，10-15臟〇1/1]\%2+，0.2-0.3臟〇1/1(1阶13,0.1-0.311]\1所述引物，1&9酶0.01-0.川/ U L，所述模板 10-100ng/ii L ;更佳地为 IXPCR 反应缓冲液，12. 5mmol/L Mg2+，0. 25mmol/L dNTP，0. 2 ii M所述引物，Taq酶0. 04U/ ii L，所述模板40ng/ ii L。所述PCR扩增的反应程序 为本领域常规的反应程序，较佳地为92-95°C预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环 的程序为：92-95°C变性 20-40s，58-63°C退火 20-40s，68-74°C延伸 20-40s，循环共 30-35 个，循环结束后，70_74°C延伸8-12min，降温至4-15°C，结束；更佳地为4°C变性30s，60°C退 火30s，72°C延伸30s ;循环共30个；循环结束后，72°C延伸10min，降温至12°C，结束。
[0016] 步骤（2)为检测步骤（I)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。 其中，所述的检测为本领域常规的检测，可以观察所述扩增产物即可。较佳地为凝胶电泳检 测；更佳地为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；最佳地为1. 5%琼脂糖凝 胶电泳检测。较佳地，所述的检测的判断方法如下：如果存在461bp位置的单一扩增产物， 则说明待检样品中含有干酪乳杆菌菌株；如果不存在461bp位置的单一扩增产物，则待检 样品中不含有干酪乳杆菌菌株。
[0017] 本发明所述的室温为10?30°C。
[0018] 本发明所述干酪乳杆菌为Lactobacillus casei，包括干酪乳杆菌和干酪乳杆菌 亚种（又称副干酪乳杆菌）。
[0019] 本发明所述的待检样品为本领域常规的待检样品，较佳地为奶酪或酸奶。
[0020] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0021] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0022] 本发明的积极进步效果在于：本发明所述的检测方法检测干酪乳杆菌菌株，检测 时间最快仅需24小时，提高了检测效率；简单易行，检测成本低；检测结果可靠，结果判定 简单，可以特异性地判断是否为干酪乳杆菌。本发明为乳品检测【技术领域】提供了一种简单 快速灵敏的检测干酪乳杆菌细菌的方法，对判别乳品中是否添加有干酪乳杆菌具有较大意 义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为实施例2中PCR产物经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳实验结果。泳道1?17依 次为：干酪乳杆菌ATCC334,干酪乳杆菌LC2W，干酪乳杆菌BD-II，干酪乳杆菌str-zhang， 干酪乳杆菌BD0059,干酪乳杆菌BD0090,干酪乳杆菌BD1649,干酪乳杆菌BD1803,干酪乳 杆菌BD3552,干酪乳杆菌BD3553,干酪乳杆菌BD3554,干酪乳杆菌BD3555,干酪乳杆菌 BDlb-01，干酪乳杆菌BDlb-02,副干酪乳杆菌BDlb-03,阴性对照（无菌去离子水），IOObp DNA Marker0
[0024] 图2为实施例2中PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳实验结果。泳道18?21依 次为：副干酪乳杆菌BD00095,副干酪乳杆菌BDOO116,副干酪乳杆菌BDO1950,副干酪乳杆 菌BD02004，M 为 IOObp DNA Marker。
[0025] 图3为实施例2中PCR产物经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1?17依次为： 干酪乳杆菌ATCC334,罗伊氏乳杆菌JCMl 12,鼠李糖乳杆菌LGG，植物乳杆菌ATCC14917,植 物乳杆菌ST-III，嗜热链球菌BDSTOO1，瑞士乳杆菌BDLHOO1，德氏乳杆菌BDLD6240，嗜酸乳 杆菌BDLA6075,植物乳杆菌BDLP6102,保加利亚乳杆菌L99,类芽孢杆菌BD3526,肠系膜明 串珠菌BD1710,长双歧杆菌BDBL001，两歧双歧杆菌BDBB001，阴性对照（无菌去离子水）， IOObp DNA Marker0
[0026] 图4为实施例3中PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳验证引物灵敏度实验图谱。泳 道 1 ?10 依次为：100bp DNA Marker，105. 3ng/PCR，10. 5ng/PCR，I. 05ng/PCR，105pg/PCR， 10.5pg/PCR，10. 5pg/PCR，105fg/PCR，ddH20。
[0027] 图5为实施例4中实际样品经PCR检测后，PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳图 谱。泳道1?11依次为：干酪乳杆菌ATCC334,干酪样品1，干酪样品2,酸乳样品1，酸乳样 品2,干酪样品3,干酪样品4,干酪样品5.酸乳样品3,酸乳样品4, ddH20, M为IOObp DNA Marker0
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0029] 所述的室温指10?30°C。
[0030] 实施例1检测干酪乳杆菌菌株的引物合成和PCR检测
[0031] ( -）引物合成
[0032] 合成能够PCR扩增干酪乳杆菌组氨酸激酶基因序列中的保守序列的引物（由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成），引物序列如下：
[0033] SEN2-L :5' ATTAAAACCCCGCTGACCGT' 3(其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO. 1 所 示）；
[0034] SEN2-R :5' TCAACGAGCTGGTCAGCAIT 3(其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO. 2 所 示）。
[0035] (二）PCR 检测
[0036] 采用上述引物，以干酪乳杆菌标准菌株ATCC334的基因组DNA为模板，进行PCR反 应体系和反应程序的建立和优化，发现以下反应体系和反应程序能得到单一的461bp左右 的扩增产物。
[0037] 其中，干酪乳杆菌标准菌株ATCC334的基因组DNA的获得包括手机菌体和CTAB法 提取基因组DNA的步骤，具体包括如下的步骤：
[0038] 1)、收集菌体：将干酪乳杆菌标准菌株ATCC334接种至5mL的MRS液体培养基中， 37°C增菌2h后，取ImL菌液，放入I. 5mL离心管中；然后3000r/min离心IOmin,取上清液， 再12000r/min离心5min，收集菌体。用无菌双蒸水悬浮菌体，离心洗漆后加入400iiL TE, 得菌体悬浮液；
[0039] 2)、利用CTAB法提取基因组DNA :
[0040] (1)取25mL步骤1)所得的菌体悬浮液中加入5mL EDTA(500mM，pH8. 0);
[0041] (2)4°C下6500g离心30分钟后，-20°C静置10分钟；
[0042] (3)室温下溶解后再用无菌去离子水重悬清洗菌体，12000r/min离心5min，弃上 清；
[0043] (4)加入 456iiL TE 缓冲液和 24iiL 溶菌酶，37°C水浴 l_2h ;加入 53iiL10% SDS， 68°C烘干 15min ;加入 87iiL 5M NaCl，69iiL 1% CTAB，68°C烘干 15min ;
[0044] (5)加入苯酚 250iiL，氯仿-异戊醇（24:1，v/v)250iiL，静置，12,000r/min 离心 IOmin ；
[0045] (6)取上清 400 u L，加入等体积（400 u L)氯仿-异戊醇（24:1，v/v)，12, 000r/min 离心5min，取上清300 u L，加入600 u L冰无水乙醇，-20°C放置2h ;
[0046] (7) 10000r/min 离心 2min，弃上清，加入 70% 乙醇清洗，12000r/min 离心 2min，弃 上清后室温下风干。加入50?IOOii L无菌去离子水或TE溶解DNA,-20°C保存待用，可以 作为后续PCR反应体系的模板。
[0047] PCR 反应体系为：1XPCR 反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，0. 2-0. 3mmol/L dNTP， 0? 1-0. 3iiM 弓 I 物 SEN2-L，0. 1-0. 3iiM 弓 I 物 SEN2-R，Taq 酶 0? 01-0. lU/ii L，DNA 模板 IO-IOOng/u L〇
[0048] PCR扩增程序为：92-95°C预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95°C变性 20-40s，58-63°C退火 20-40s，68-74°C延伸 20-40s ;共 30-35 个循环；循环结 束后，70-74°C延伸8-12min，降温至4-15°C，结束。
[0049] 发明人经实验还发现，461bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显清晰时 的？0?反应体系为：1父？0?反应缓冲液，12.5111111〇1/1]\%2+，0.25111111〇1/1(1阶1 3,0.211]\1引物 SEN2-L，0? 2 ii M 引物 SEN2-R，Taq 酶 0? 04U/ ii L，DNA 模板 40ng/ ii L。
[0050] 461bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显清晰时的PCR扩增程序为： 94°C预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s ;循环共30个；循环结束后，72°C延伸lOmin，降温至12°C，结束。
[0051] 实施例2检测干酪乳杆菌菌株的特异性评价
[0052] 1 )、菌株基因组DNA模板的获取
[0053] 取干酪乳杆菌标准菌株1株（ATCC334)、干酪乳杆菌分离菌株18株和其他品种的 菌株14株（如表1所示），按照如实施例1所述的步骤分别收集菌体并按CTAB法提取基因 组DNA，作为检测干酪乳杆菌的PCR反应模板。
[0054] 2)、PCR检测是否为干酪乳杆菌菌株
[0055] 取2 ii L步骤1)所得的每株菌株的DNA溶液（DNA浓度30ng/ ii L)作为PCR反应 模板添加到PCR反应体系中进行扩增反应。
[0056] PCR反应体系为：16. Iii L无菌水，依次加入IOXPCR反应缓冲液2.5 iiL，25mmol/L Mg2+2. O ii L，2. 5mmol/L dNTP I. O ii L，5 ii M 引物 SEN2-L I. O ii L，5 ii M 引物 SEN2-R I. O ii L， 2. 5U/ ii L Taq酶0. 4 ii L，最后加模板溶液2 ii L，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。
[0057] PCR反应程序为：4°C预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94°C变 性30s，退火温度60°C，退火时间为30s，72°C延伸30s，共35个循环，循环结束后72°C延伸 IOmin,降温至12°C，结束。
[0058] 采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，判断在461bp位置是否存在单一扩增条 带，若在461bp位置存在单一扩增的条带，则标记为" + "，即判断为所述干酪乳杆菌；否则标 记为结果见表1，电泳结果见图1?3。
[0059] 表1.特异性评价所用菌株及试验结果
[0060]
【权利要求】
1. 一种特异性扩增干酪乳杆菌（Lactobacillus casei)的引物对，其特征在于，其核 苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO. 1所示和如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
2. -种用于特异性扩增干酪乳杆菌的试剂盒，其特征在于，其包括核苷酸序列分别如 序列表中SEQ ID NO. 1所示和如序列表中SEQ ID NO. 2所示的引物对。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR缓冲液、 Mg2+、Taq DNA聚合酶和ddH20中的一种或多种；较佳地，还包括基因组DNA抽提试剂。
4. 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法，其特征在于，其包括以下步骤： (1) 提取待检样品的基因组DNA作为模板，核苷酸序列分别为如序列表中SEQ ID NO. 1 所示和如序列表中SEQ ID NO. 2所示的引物对作为引物，进行PCR扩增； (2) 检测步骤（l)PCR扩增产物中是否在461bp位置存在单一扩增产物。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，所述基因组DNA的提取方法为 CTAB 法。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，所述PCR扩增的反应体系为 1XPCR 反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，0.2-0. 3mmol/L dNTP，0.1-0. 3 iiM 所述引物，Taq 酶0. 01-0. 1U/ ii L，所述模板10-100ng/ ii L ;和/或，所述PCR扩增的反应程序为92-95°C 预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95°C变性20-40s，58-63°C退火 20-40s，68-74°C延伸20-40s，循环共30-35个，循环结束后，70-74°C延伸8-12min，降温至 4-15°C，结束。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，所述PCR扩增的反应体系为 1XPCR 反应缓冲液，12.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.2iiM 所述引物，Taq 酶 0.04U/ U L，所述模板40ng/ii L ;和/或，所述PCR扩增的反应程序为4°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s ;循环共30个；循环结束后，72°C延伸10min，降温至12°C，结束。
8. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的检测为凝胶电泳检测； 较佳地为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；更佳地为1. 5%琼脂糖凝胶电 泳检测。
9. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的检测的判断方法如下： 如果存在461bp位置的单一扩增产物，则说明待检样品中含有干酪乳杆菌菌株；如果不存 在461bp位置的单一扩增产物，则待检样品中不含有干酪乳杆菌菌株。
10. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检样品为奶酪或酸奶。
【文档编号】C12Q1/04GK104450941SQ201410837348
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】陈万义, 任婧, 郭本恒, 刘振民 申请人:光明乳业股份有限公司