Kras基因突变检测方法及试剂盒的制作方法

Kras基因突变检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程及分子生物学领域，提供了一种KRAS基因突变检测方法及试剂盒。所述方法包括：A、利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；B、将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在扩增产物两端分别接上接头一和接头二，得文库分子；C、单分子扩增含接头一和接头二的文库分子，得单分子扩增产物；D、对单分子扩增产物进行高通量测序，得目标区域的序列信息。本发明的方法和试剂盒能够简化实验步骤，提高检测效率。
【专利说明】KRAS基因突变检测方法及试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种KRAS基因突变检 测方法及试剂盒。

【背景技术】
[0002] ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种--HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在 11、12和1号染色体上。KRAS因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS 对人类癌症影响最大，它是一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异 常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS基因 突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失 控而癌变。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因、了解各种癌症的发展预后、化疗疗效的 重要指标。KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、13、61密码子)上，占 所有突变的90%以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种突变在胰腺癌、大肠癌、 肺癌中的发生率较高。在胰腺癌中。KRAS基因点突变发生率高达90%以上。
[0003] 在现阶段，为了实现对KRAS基因突变的检测，可采用多种方案。其中，利用高通量 测序技术实现对KRAS基因突变的检测一般包括以下步骤：一）通过PCR扩增获得含待测定 目标区域的核酸分子；二）在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分 子，获得测序文库；三）单分子扩增所得测序文库；4)利用高通量测序技术对单分子扩增产 物进行测序，得到目标区域的序列信息。但是，在步骤二)中，为了实现这两种接头分子与含 待测定目标区域的核酸分子的定向连接，需要依次进行切割、连接，或连接、切割、连接的反 应，且为了保证获得文库分子的纯度，减少非目标产物(两种接头自身或相互之间连接的产 物、接头连接位置错误的产物）的生成，在上述2步或3步反应中需要进行1至2次的分离 纯化步骤，建库步骤繁杂，效率低。
[0004] 在上述方法基础上进行的KRAS基因突变检测方法步骤繁杂，检测效率低。同样， 用于上述方法的KRAS基因突变检测试剂盒同样在测序过程中存在步骤繁杂，检测效率低 的问题。
[0005] 因此，需要一种新的KRAS基因突变检测方法及试剂盒，简化实验步骤，提高实验 效率。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种KRAS基因突变检测方法及试剂盒，旨在解决现有技 术中步骤繁杂，检测效率低的问题。
[0007] 为了实现发明目的，发明人提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括KRAS特异 性引物，所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每 个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
[0008] 其中，所述试剂盒还包括断裂剂、接头一、接头二、连接酶和连接酶缓冲液；所述断 裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端。
[0009] 其中，所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；所述接头 二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3'端。
[0010] 其中，所述接头一为双链核酸分子，所述第二粘性末端所在链的5'末端含生物素 标记；或所述接头二为双链核酸分子，所述单碱基突出末端所在链的5'末端含生物素标 记。
[0011] 其中，所述KRAS特异性引物包括SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID N0:3-4中的至少一对。
[0012] 其中，其特征在于，所述接头一由SEQ ID N0:9-10组成，接头二由SEQ ID NO: 11-12 组成。
[0013] 为了更好地实现发明目的，本发明还提供了一种KRAS基因突变检测方法，包括以 下步骤： A、 利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩 增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序 列； B、 将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在扩增产物两端分别 接上接头一和接头-，得文库分子； 所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、接头一、接头二和连接缓冲液；所述 断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末 端； C、 单分子扩增含接头一和接头二的文库分子，得单分子扩增产物； D、 对单分子扩增产物进行高通量测序，得目标区域的序列信息。
[0014] 所述可断裂位点或可切除序列为核糖核苷酸、RNA序列或限制性内切酶识别序列。
[0015] 其中，所述可断裂位点或可切除序列为核糖核苷酸、RNA序列或限制性内切酶识别 序列。
[0016] 其中，所述断裂剂为USER酶、RNase H或限制性内切酶。
[0017] 其中，所述断裂剂为RNase H、USER酶或限制性内切酶。
[0018] 其中，每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有两种PCR引物上含有可断裂位点 或可切除序列，且由这些可断裂位点或可切除序列所形成的第一粘性末端之间不能互补配 对。
[0019] 其中，所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
[0020] 进一步的，步骤A中PCR扩增使用的聚合酶为Taq酶；所述接头二的一端为单碱基 突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3'端。
[0021] 其中，所述待测序样本有多个，根据待测序样本的不同分别进行步骤A、B和C ;所 述接头一和/或接头二上含有标签序列；所述标签序列，用于区分待测序样本。
[0022] 其中，所述目标区域为KRAS基因的Exon2和Exon3 ;所述KRAS特异性引物为SEQ ID NO:1-2 和 SEQ ID NO:3-4。
[0023] 其中，所述接头一由SEQ ID N0:9-10组成，接头二由SEQ ID NO: 11-12组成。
[0024] 由上可知，本发明的试剂盒和方法通过对PCR引物的特殊设计，结合能让断裂剂 和连接酶同时发挥作用的切割-连接反应体系，使得在检测KRAS基因突变过程中，PCR扩 增后的切割和连接反应能在同一反应体系中进行，简化了实验步骤，提高了实验效率。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 图1是本发明一个实施例中分叉型接头的结构示意图。
[0026] 图2是本发明一个实施例中带茎环结构的接头的结构示意图。
[0027] 图3是本发明的可断裂位点或可切除序列在PCR引物中所处位置与PCR引物和待 测序样本互补配对区域之间的位置关系示意图。
[0028] 图4是本发明一个实施例中接头二的结构示意图。
[0029] 图5是本发明一个实施例中的步骤A、B的原理示意图。

【具体实施方式】
[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。
[0031] 本发明提出第一实施例，本发明还提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括 KRAS特异性引物，所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用 于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切 除序列。
[0032] 需要说明的是，本发明的试剂盒中的KRAS特异性引物在对KRAS基因中的目标 区域进行扩增后，将可断裂位点或可切除序列带入扩增产物中，使得扩增产物在后续的切 割和连接能够在同一个反应体系中进行，简化了 KRAS基因突变检测的步骤，提高了检测效 率。
[0033] 其中，所述试剂盒还包括断裂剂，所述断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或 可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端。
[0034] 其中，所述试剂盒还包括接头一和接头二，用于分别与KRAS特异性引物扩增而得 的扩增产物的两端连接。
[0035] 根据用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中含有可断裂位点或可切除序列 的引物种类数量的不同，以下将分别进行阐述。
[0036] 在第一实施例中，用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中均只有一种PCR引 物上含有可断裂位点或可切除序列时。KRAS特异性引物扩增而得的扩增产物经断裂剂切割 后，仅在一端含有第一粘性末端。此时，所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第 二粘性末端，用于与第一粘性末端连接；所述接头二，用于与第一粘性末端所在端的相对端 连接。
[0037] 进一步的，所述接头二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位 于所在链的3'端。本方案的接头二，能与经taq酶扩增的产物中的A尾特异性连接，从而 实现接头一和接头二与扩增产物两端的同时定向连接，提高反应效率。
[0038] 针对接头一，需要进一步说明的是，接头一可为单链核酸分子，也可为双链核酸分 子。优选的，所述接头一的第二粘性末端不是反向互补序列，本方案能够避免第二粘性末端 之间的互补配对进而发生接头一的自连。
[0039] 当接头一为单链核酸分子时，该单链核酸分子含有反向互补序列，且形成一端为 茎环结构，另一端为与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
[0040] 优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中含有限制性内切酶酶切识别序列。该 限制性内切酶酶切识别序列可在接头一与扩增产物完成连接反应后或发生连接反应时，被 相应的限制性内切酶酶切，最终获得双链结构的文库分子。
[0041] 更优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中的限制性内切酶酶切识别序列与 KRAS特异性引物中的可切除序列相同。本方案中，接头一的酶切可以与扩增产物的切割、连 接同时发生，简化了实验步骤，提高了实验效率，同时减少了试剂种类，降低了反应成本和 具体实验方案的设计难度。
[0042] 当接头一为双链核酸分子时，针对接头一的结构，需要说明的是，接头一可为单突 出末端接头或双突出末端接头。当接头一为单突出末端接头时，该单突出末端位于其所在 核酸链的3'端。当接头一为双突出末端接头时，第二粘性末端与另一端的突出末端可位于 同一核酸链上，也可位于不同的核酸链上。
[0043] 针对接头一为双链核酸分子的方案，为了避免接头一在步骤B中发生自连，干扰 实验，针对接头一结构的不同，可分别采用以下策略。
[0044] 当接头一为单突出末端接头时，第二粘性末端所在核酸链的5'端无磷酸基团，这 样可以避免接头一平末端部分之间的相互连接。
[0045] 当接头一为双突出末端接头时，接头一的两个突出末端相互之间不能互补配对， 这样可以避免存在多个接头一分子时，其自身的两个突出末端相互之间互补配对连接。或 者采取第二粘性末端所在核酸链的5'端无磷酸基团，同样能够避免存在多个接头一分子 时，其自身的两个突出末端相互之间互补配对连接。当然，同时采用以上两个方案最优。
[0046] 针对接头一为双链核酸分子的方案，进一步优选在所述第二粘性末端所在链的另 一端（5'端)，含有生物素标记。本方案中，利用该生物素标记，可以在步骤B中的切割、连 接反应后，很方便的将文库分子纯化出来，并进而进行后续的应用，提高了反应效率。
[0047] 更优选的，所述接头一通过其上的生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和 素的固相载体表面上。
[0048] 针对接头二，需要进一步说明的是，接头二可为平末端接头、突出末端接头、分叉 接头或含茎环结构的接头。
[0049] 所述平末端接头是指双链之间完全互补配对的双链核酸接头。优选的，所述平末 端接头的两条链的5'末端均不含磷酸基团，其可避免连接过程中接头自连现象的出现，减 少对后续实验的干扰。
[0050] 所述突出末端接头，是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列，而其 余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端，也可以是含有两个 突出末端的双突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所 述关出末％5接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。
[0051] 当接头二为单突出末端接头时，该突出末端为其所在链的3'末端，碱基为T ;该接 头能够与通过taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。为了进一步避 免步骤B中多个接头二的平末端之间相互发生连接，平末端中的5'端核酸链无磷酸基团。
[0052] 当接头-为双关出末纟而接头时，其中Iv关出末纟而为单T喊基关出末纟而，且该关 出末端为其所在链的3'末端。该接头同样能够与步骤A中通过taq酶扩增的含A尾的PCR 扩增产物直接连接，提高连接效率。优选的，接头二中单T碱基突出末端的相对突出末端为 非单A碱基的突出末端，这样能够避免连接过程中多个接头二分子之间发生的互补配对连 接。当然，采用接头二中单T碱基突出末端所在核酸链的5'端无磷酸基团的方案，能够达 到同样的技术效果。同时采用上述两种方案最佳。
[0053] 所述分叉型接头包括互补区和分叉区，其基本结构如图1所示，互补区双链的核 苷酸互补配对，配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型 接头能够在结构上就避免连接过程中接头二自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。在 本实施例的【具体实施方式】中，所述接头优选为互补区的3'末端为突出末端，且突出末端最 后一个碱基为T的T末端分叉接头；该接头能够与通过taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产 物直接连接，提高连接效率。
[0054] 所述带茎环结构的接头，如图2所示。该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子包 括第一互补配对区1、茎环区2和第二互补配对区3 (图2a)，第一互补配对区1能够与第二 互补配对区3互补配对。如图3b所示，带茎环结构的接头还可带有突出末端4,该突出末端 可位于单链核酸分子的3'端。突出末端4的存在能够防止接头自连现象的发生，减少对后 续实验的干扰。该突出末端优选为T ;该接头能够与通过taq酶扩增的含A尾的PCR扩增 产物直接连接，提高连接效率。
[0055] 优选的，所述第一互补配对区和第二互补配对区中含有限制性内切酶酶切识别序 列。该限制性内切酶酶切识别序列可在接头二与扩增产物完成连接反应后或发生连接反应 时，被相应的限制性内切酶酶切，最终获得双链结构的文库分子。
[0056] 更优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中的限制性内切酶酶切识别序列与 KRAS特异性引物中的可切除序列相同。本方案中，接头二的酶切可以与扩增产物的切割、连 接同时发生，简化了实验步骤，提高了实验效率，同时减少了试剂种类，降低了反应成本和 具体实验方案的设计难度。
[0057] 在第二实施例中，用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中均有两种PCR引物 上含有可断裂位点或可切除序列，且该两种引物分别与目标区域的两端互补配对时。KRAS 特异性引物扩增而得的扩增产物经断裂剂切割后，在两端均形成第一粘性末端。优选的，该 两端的第一粘性末端之间不互补配对，以避免扩增产物在被切割后的相互连接，且接头一 和接头二能够分别与这两种第一粘性末端同时连接，提高了反应效率。本方案与第一实施 例相比，适用性更广，无论KRAS特异性引物在扩增过程中所使用的聚合酶是taq酶还是非 taq酶，均能适用。
[0058] 本实施例中，接头-可为关出末〗而接头、分叉接头或含3;环结构的接头。
[0059] 所述突出末端接头，是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列，而其 余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端，也可以是含有两个 突出末端的双突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所 述关出末％5接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。
[0060] 当接头二为单突出末端接头时，该突出末端为其所在链的3'末端，所述接头二与 接头一分别与扩增产物在被切割后获得的两个不同的第一粘性末端连接。
[0061] 当接头二为双突出末端接头时，其中一个突出末端为其所在链的3'末端，用于与 扩增产物在被切割后获得的其中一个第一粘性末端互补配对连接；另一突出末端则既可为 其所在链的3'末端，也可为其所在链的5'末端。优选的，这两个突出末端相互之间不能互 补配对，以避免连接过程中多个接头二相互之间发生连接。当然，使上述"用于与扩增产物 在被切割后获得的其中一个第一粘性末端互补配对连接"的末端所在链的5'端无磷酸基 团，能够达到同样的技术效果。同时采用上述两种方案最佳。
[0062] 所述分叉型接头包括互补区和分叉区，其基本结构如图1所示，互补区双链的核 苷酸互补配对，配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型 接头能够在结构上就避免连接过程中接头二自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。在 本实施例的【具体实施方式】中，所述接头优选为互补区的3'末端为突出末端，该突出末端用 于与扩增产物在连接过程中被切割后获得的其中一个第一粘性末端互补配对连接，提高连 接效率。
[0063] 所述带茎环结构的接头，如图2b所示。该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子 包括第一互补配对区1、茎环区2和第二互补配对区3,第一互补配对区1能够与第二互补 配对区3互补配对，所述带茎环结构的接头还带有突出末端4,该突出末端4位于单链核酸 分子的3'端。突出末端4用于与扩增产物在步骤B中被切割后获得的其中一个第一粘性 末端互补配对连接。
[0064] 优选的，所述第一互补配对区和第二互补配对区中含有限制性内切酶酶切识别序 列。该限制性内切酶酶切识别序列可在接头二与扩增产物完成连接反应后或发生连接反应 时，被相应的限制性内切酶酶切，最终获得双链结构的文库分子。
[0065] 更优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中的限制性内切酶酶切识别序列与 KRAS特异性引物中的可切除序列相同。本方案中，接头二的酶切可以与扩增产物的切割、连 接同时发生，简化了实验步骤，提高了实验效率，同时减少了试剂种类，降低了反应成本和 具体实验方案的设计难度。
[0066] 针对，接头二为双链核酸分子的方案，进一步优选"用于与扩增产物在被切割后获 得的其中一个第一粘性末端互补配对连接"的末端所在链的5'端含有生物素标记。本方案 中，利用该生物素标记，可以在扩增产物的切割、连接反应后，很方便的将文库分子纯化出 来，并进而进行后续的应用，提高了反应效率。
[0067] 更优选的，所述接头二通过其上的生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和 素的固相载体上。
[0068] 优选的，所述可断裂位点或可切除序列为核糖核苷酸、RNA序列或限制性内切酶识 别序列。其中，可断裂位点可为单个的核糖核苷酸；可切除序列可为RNA序列或限制性内切 酶识别序列，且该限制性内切酶识别序列中含有限制性内切酶切割位点。
[0069] 本方案中，所述断裂剂能够与连接酶在同一反应体系中均具有较好的活性，提高 切割-连接步骤的反应效率。
[0070] 与上述的可断裂位点、可切除序列相对应，所述断裂剂可分别为RNase H、USER酶 或限制性内切酶。
[0071] 更优选的，所述可断裂位点或可切除序列为U或RNA序列，此时，相应的断裂剂为 USER 酶或 RNase H。
[0072] 本方案中，所述断裂剂--USER酶或RNase H，在切割-连接反应体系中能够与连 接酶完美的配合，并在连接缓冲液中充分发挥它们自身的活性，达到特异性切割的目的。
[0073] 此外，需要特别说明的是，如图3所示，所述可断裂位点或可切除序列在PCR引物 中所处位置可在PCR引物与待测序样本互补配对区域中；也可在PCR引物与待测序样本互 补配对区域的5'端，与待测序样本不互补配对。优选在PCR引物与待测序样本互补配对区 域的5'端，与待测序样本不互补配对；本方案尤其适用于对多个待测序样本进行测序，可 统一多个待测序样本建库过程中所使用的接头一，减少试剂种类，降低建库成本。
[0074] 其中，所述试剂盒还包括连接酶和连接酶缓冲液。
[0075] 所述连接酶无特殊限制，能够实现DNA片段连接即可，例如：E. coli DNA连接酶、 T4 DNA连接酶、热稳定DNA连接酶、Tth DNA连接酶。优选为T4 DNA连接酶，适用性广，且 既可连接粘性末端，又能连接平末端。
[0076] 其中，所述第一粘性末端的长度不限，优选在l_6bp之间，此时，第一粘性末端与 互补配对的接头的连接反应效率较高，更优选为4或5bp，此时连接反应的效率最高。
[0077] 其中，所述KRAS特异性引物包括SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID N0:3-4中的至少一对。
[0078] 进一步的，所述KRAS特异性引物还包括SEQ ID NO: 5-6和SEQ ID NO: 7-8。当试 剂盒中同时含有 SEQ ID NO: 1-8 时，SEQ ID NO: 5-6 和 SEQ ID NO: 7-8 分别为 Exon2、Exon3 的外引物对，SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID NO:3-4分别为Exon2、Exon3的内引物对。它们配 合使用能够减少扩增所需的待测序样本量，并提高扩增的特异性。
[0079] 其中，所述接头一由SEQ ID NO:9-10组成。
[0080] 进一步的，如图4所示，接头二由SEQ ID NO: 11-12组成。本方案中，接头二含有 标签序列,可最多同时区分256种待测序样本，提高了检测通量。
[0081] 更进一步的，SEQ ID NO: 11的5'末端含有生物素标记。本方案，极大了便利了利 用本发明的试剂盒构建的文库分子的纯化和分离，提高了实验效率。
[0082] 其中，所述连接酶和断裂剂的最佳活性温度可相同或不同，只要断裂剂的活性温 度范围覆盖或部分覆盖连接酶的活性温度范围即可。
[0083] 更优选的，所述连接酶和断裂剂的最佳活性温度相同，此时，采用最佳活性温度进 行切割反应和连接反应，能进一步提商反应效率。
[0084] 为了更好的实现本发明的目的，本发明提出一种KRAS基因突变检测方法，包括以 下步骤： A、 利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩 增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序 列； B、 将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在扩增产物两端分别 接上接头一和接头-，得文库分子； 所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、接头一、接头二和连接缓冲液；所述 断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末 端； C、 单分子扩增含接头一和接头二的文库分子，得单分子扩增产物； D、 对单分子扩增产物进行高通量测序，得目标区域的序列信息。
[0085] 需要说明的是： 所述待测序样本为含核酸的任意形式的样品，包括但不限于经纯化后的DNA、cDNA或 RNA(包括但不限于mRNA和rRNA)，或是含有核酸的石蜡包埋组织、全血、血清、血浆或细胞。 [0086] 所述切割-连接反应体系为使连接酶和断裂剂同时具有活性的反应体系。
[0087] 如图5所示，本发明通过上述对PCR扩增引物和切割-连接反应体系的特殊设 计，使得在步骤B中，扩增产物的切割和连接反应能在同一反应体系中进行；一旦断裂剂完 成对可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，接头一和接头二即可在连接酶的作用下， 与被切割后的扩增产物连接，省去了切割反应和连接反应中的纯化步骤；即，减少了实验步 骤，提高了检测效率。此外，本发明通过高通量测序技术对目标区域进行检测，不但能够获 得目标区域的序列信息，还能获得待测序样本的目标区域中的含突变的DNA占待测序样本 中所有DNA分子的比例。
[0088] 其中，连接酶和断裂剂的最佳活性温度可相同或不同，只要断裂剂的活性温度范 围覆盖或部分覆盖连接酶的活性温度范围即可。
[0089] 优选的，所述切割-连接反应在反应过程中温度恒定不变，这样可简化实验条件， 降低对实验仪器的要求，例如，采用普通水浴锅即可完成反应。
[0090] 更优选的，所述连接酶和断裂剂的最佳活性温度相同，此时，采用最佳活性温度进 行切割反应和连接反应，能进一步提商反应效率。
[0091] 当然，所述切割-连接反应在反应过程中温度也可以根据需要进行调节，尤其是 断裂剂的最佳活性温度和连接酶的最佳活性温度不同的时候，可先在断裂剂的最佳活性温 度进行切割反应，待切割反应完成后再将反应温度调节至连接酶的最佳活性温度进行连接 反应，从而进一步提1?反应效率。
[0092] 其中，所述可断裂位点或可切除序列为PCR引物上能够被断裂剂特异性切割的位 点或序列。
[0093] 优选的，所述可断裂位点或可切除序列为核糖核苷酸、RNA序列或限制性内切酶识 别序列。其中，可断裂位点可为单个的核糖核苷酸；可切除序列可为RNA序列或限制性内切 酶识别序列，且该限制性内切酶识别序列中含有限制性内切酶切割位点。
[0094] 本方案中，所述断裂剂能够与连接酶在同一反应体系中均具有较好的活性，提高 切割-连接步骤的反应效率。
[0095] 与上述的可断裂位点、可切除序列相对应，所述断裂剂可分别为RNase H、USER酶 或限制性内切酶。
[0096] 更优选的，所述可断裂位点或可切除序列为U或RNA序列，此时，相应的断裂剂为 USER 酶或 RNase H。
[0097] 本方案中，所述断裂剂--USER酶或RNase H，在切割-连接反应体系中能够与连 接酶完美的配合，并在连接缓冲液中充分发挥它们自身的活性，达到特异性切割的目的。
[0098] 此外，需要特别说明的是，如图2所示，所述可断裂位点或可切除序列在PCR引物 中所处位置可在PCR引物与目标区域的互补配对区域中；也可在PCR引物与目标区域的互 补配对区域的5'端，与目标区域不互补配对。
[0099] 优选的，所述可断裂位点或可切除序列在PCR引物对中所处位置在与待测序样本 互补配对区域的5'端，与待测序样本不互补配对。本方案尤其适用于对多个待测序样本进 行检测，因为在对多个待测序样本的EGFR基因突变进行检测时，本方案中每个待测序样本 所需的接头一和接头二可完全相同，能够减少试剂种类，降低检测成本。
[0100] 其中，所述第一粘性末端的长度不限，优选在l-6bp之间，此时，第一粘性末端与 互补配对的接头的连接反应效率较高，更优选为4或5bp，此时连接反应的效率最高。
[0101] 为了实现接头一和接头二与扩增产物的定向连接，本发明可采用多种方案。以下 将分别进行阐述。
[0102] 在第三实施例中，用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中只有一种PCR引物 上含有可断裂位点或可切除序列。此时，所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的 第二粘性末端；所述接头二，用于与第一粘性末端所在末端的相对端连接。
[0103] 针对接头一，需要进一步说明的是，接头一可为单链核酸分子，也可为双链核酸分 子。优选的，所述接头一的第二粘性末端不是反向互补序列，本方案能够避免第二粘性末端 之间的互补配对进而发生接头一的自连。
[0104] 当接头一为单链核酸分子时，该单链核酸分子含有反向互补序列，且形成一端为 茎环结构，另一端为与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
[0105] 优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中含有限制性内切酶酶切识别序列。该 限制性内切酶酶切识别序列可在接头一与扩增产物完成连接反应后或发生连接反应时，被 相应的限制性内切酶酶切，最终获得双链结构的文库分子。
[0106] 更优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中的限制性内切酶酶切识别序列与用 于PCR扩增的PCR引物对中的可切除序列相同。本方案中，接头一的酶切可以与步骤B中 的切割、连接同时发生，简化了实验步骤，提高了实验效率，同时减少了试剂种类，降低了反 应成本和具体实验方案的设计难度。
[0107] 当接头一为双链核酸分子时，针对接头一的结构，需要说明的是，接头一可为单突 出末端接头或双突出末端接头。当接头一为单突出末端接头时，该单突出末端位于其所在 核酸链的3'端。当接头一为双突出末端接头时，第二粘性末端与另一端的突出末端可位于 同一核酸链上，也可位于不同的核酸链上。
[0108] 针对接头一为双链核酸分子的方案，为了避免接头一在步骤B中发生自连，干扰 实验，针对接头一结构的不同，可分别采用以下策略。
[0109] 当接头一为单突出末端接头时，第二粘性末端所在核酸链的5'端无磷酸基团，这 样可以避免接头一平末端部分之间的相互连接。
[0110] 当接头一为双突出末端接头时，接头一的两个突出末端相互之间不能互补配对， 这样可以避免存在多个接头一分子时，其自身的两个突出末端相互之间互补配对连接。或 者采取第二粘性末端所在核酸链的5'端无磷酸基团，同样能够避免存在多个接头一分子 时，其自身的两个突出末端相互之间互补配对连接。当然，同时采用以上两个方案最优。
[0111] 针对接头一为双链核酸分子的方案，进一步优选在所述第二粘性末端所在链的另 一端（5'端)，含有生物素标记。本方案中，利用该生物素标记，可以在步骤B中的切割、连 接反应后，很方便的将文库分子纯化出来，并进而进行后续的应用，提高了反应效率。
[0112] 更优选的，所述接头一通过其上的生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和 素的固相载体表面上，且步骤B是在周期性震动中进行的。本方案中接头一被预先固定在 固相载体上，当固相载体的密度与步骤B中的反应体系的密度不一致时，固相载体会发生 沉降或上浮，若步骤B在静置状态下反应，会导致固定在固相载体上的接头一与步骤B中被 切割后的扩增产物的第一粘性末端接触不充分，连接效率低。本方案能够让接头一与步骤 B中被切割后的扩增产物的第一粘性末端充分接触，提高连接效率。
[0113] 需要说明的是，所述周期性震动的实现方式有多种，包括但不限于：在旋转仪上进 行反应，或按一定的时间间隔，吹打或震荡反应体系。
[0114] 针对接头二，需要进一步说明的是，接头二可为平末端接头、突出末端接头、分叉 接头或含茎环结构的接头。
[0115] 所述平末端接头是指双链之间完全互补配对的双链核酸接头。优选的，所述平末 端接头的两条链的5'末端均不含磷酸基团，其可避免连接过程中接头自连现象的出现，减 少对后续实验的干扰。
[0116] 所述突出末端接头，是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列，而其 余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端，也可以是含有两个 突出末端的双突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所 述关出末％5接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。
[0117] 当接头二为单突出末端接头时，该突出末端为其所在链的3'末端，碱基为T ;该接 头能够与步骤A中通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。为 了进一步避免步骤B中多个接头二的平末端之间相互发生连接，平末端中的5'端核酸链无 憐酸基团。
[0118] 当接头-为双关出末纟而接头时，其中Iv关出末纟而为单T喊基关出末纟而，且该关 出末端为其所在链的3'末端。该接头同样能够与步骤A中通过Taq酶扩增的含A尾的PCR 扩增产物直接连接，提高连接效率。优选的，接头二中单T碱基突出末端的相对突出末端为 非单A碱基的突出末端，这样能够避免步骤B中多个接头二分子之间发生的互补配对连接。 当然，采用接头二中单T碱基突出末端所在核酸链的5'端无磷酸基团的方案，能够达到同 样的技术效果。同时采用上述两种方案最佳。
[0119] 所述分叉型接头包括互补区和分叉区，其基本结构如图2所示，互补区双链的核 苷酸互补配对，配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型 接头能够在结构上就避免步骤B中接头_自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。在本 实施例的【具体实施方式】中，所述接头优选为互补区的3'末端为突出末端，且突出末端最后 一个碱基为T的T末端分叉接头；该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物 直接连接，提高连接效率。
[0120] 所述带茎环结构的接头，如图3所示。该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子包 括第一互补配对区1、茎环区2和第二互补配对区3 (图3a)，第一互补配对区1能够与第二 互补配对区3互补配对。如图3b所示，带茎环结构的接头还可带有突出末端4,该突出末端 可位于单链核酸分子的3'端。突出末端4的存在能够防止接头自连现象的发生，减少对后 续实验的干扰。该突出末端优选为T ;该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增 产物直接连接，提高连接效率。
[0121] 优选的，所述第一互补配对区和第二互补配对区中含有限制性内切酶酶切识别序 列。该限制性内切酶酶切识别序列可在接头二与扩增产物完成连接反应后或发生连接反应 时，被相应的限制性内切酶酶切，最终获得双链结构的文库分子。
[0122] 更优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中的限制性内切酶酶切识别序列与用 于PCR扩增的PCR引物对中的可切除序列相同。本方案中，接头二的酶切可以与步骤B中 的切割、连接同时发生，简化了实验步骤，提高了实验效率，同时减少了试剂种类，降低了反 应成本和具体实验方案的设计难度。
[0123] 在本发明的第四实施例中，用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中均有两 种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列，且该两种引物分别与目标区域的两端互补配 对时。KRAS特异性引物扩增而得的扩增产物经断裂剂切割后，在两端均形成第一粘性末端。 优选的，该两端的第一粘性末端之间不互补配对，以避免扩增产物在被切割后的相互连接， 且接头一和接头二能够分别与这两种第一粘性末端同时连接，提高了反应效率。本方案与 第一实施例相比，适用性更广，无论KRAS特异性引物在扩增过程中所使用的聚合酶是taq 酶还是非taq酶，均能适用。
[0124] 本实施例中，通过对PCR引物对的特殊设计，使得步骤A所得的扩增产物在步骤B 中，可被切割成两端为不同第一粘性末端的核酸片段，进而再分别与接头一、接头二分别连 接，形成文库分子；既提高了接头与扩增产物的连接效率，又避免了接头自连等非目标产物 的产生。
[0125] 需要进一步说明的是，本实施例中，接头一可采用的方案与上一实施例相同，以下 将对接头二可采用的方案进行进一步的阐述。
[0126] 本实施例中，接头-可为关出末〗而接头、分叉接头或含3;环结构的接头。
[0127] 所述突出末端接头，是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列，而其 余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端，也可以是含有两个 突出末端的双突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所 述关出末％5接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。
[0128] 当接头二为单突出末端接头时，该突出末端为其所在链的3'末端，所述接头二与 接头一分别与扩增产物在步骤B中被切割后获得的两个不同的第一粘性末端连接。
[0129] 当接头二为双突出末端接头时，其中一个突出末端为其所在链的3'末端，用于与 扩增产物在步骤B中被切割后获得的其中一个第一粘性末端互补配对连接；另一突出末端 则既可为其所在链的3'末端，也可为其所在链的5'末端。优选的，这两个突出末端相互之 间不能互补配对，以避免步骤B中多个接头二相互之间发生连接。当然，使上述"用于与扩 增产物在步骤B中被切割后获得的其中一个第一粘性末端互补配对连接"的末端所在链的 5'端无磷酸基团，能够达到同样的技术效果。同时采用上述两种方案最佳。
[0130] 所述分叉型接头包括互补区和分叉区，其基本结构如图2所示，互补区双链的核 苷酸互补配对，配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型 接头能够在结构上就避免步骤B中接头_自连现象的出现，减少对后续实验的干扰。在本 实施例的【具体实施方式】中，所述接头优选为互补区的3'末端为突出末端，该突出末端用于 与扩增产物在步骤B中被切割后获得的其中一个第一粘性末端互补配对连接，提高连接效 率。
[0131] 所述带茎环结构的接头，如图3b所示。该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子 包括第一互补配对区1、茎环区2和第二互补配对区3,第一互补配对区1能够与第二互补 配对区3互补配对，所述带茎环结构的接头还带有突出末端4,该突出末端4位于单链核酸 分子的3'端。突出末端4用于与扩增产物在步骤B中被切割后获得的其中一个第一粘性 末端互补配对连接。
[0132] 优选的，所述第一互补配对区和第二互补配对区中含有限制性内切酶酶切识别序 列。该限制性内切酶酶切识别序列可在接头二与扩增产物完成连接反应后或发生连接反应 时，被相应的限制性内切酶酶切，最终获得双链结构的文库分子。
[0133] 更优选的，该单链核酸分子的反向互补序列中的限制性内切酶酶切识别序列与用 于PCR扩增的PCR引物对中的可切除序列相同。本方案中，接头二的酶切可以与步骤B中 的切割、连接同时发生，简化了实验步骤，提高了实验效率，同时减少了试剂种类，降低了反 应成本和具体实验方案的设计难度。
[0134] 针对，接头二为双链核酸分子的方案，进一步优选"用于与扩增产物在步骤B中被 切割后获得的其中一个第一粘性末端互补配对连接"的末端所在链的5'端含有生物素标 记。本方案中，利用该生物素标记，可以在步骤B中的切割、连接反应后，很方便的将文库分 子纯化出来，并进而进行后续的应用，提高了反应效率。
[0135] 更优选的，所述接头二通过其上的生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和 素的固相载体上，且步骤B是在周期性震动中进行的。本方案中接头二被预先固定在固相 载体上，当固相载体的密度与步骤B中的反应体系的密度不一致时，固相载体会发生沉降 或上浮，若步骤B在静置状态下反应，会导致固定在固相载体上的接头二与步骤B中被切割 后的扩增产物的第一粘性末端接触不充分，连接效率低。本方案能够让接头二与步骤B中 被切割后的扩增产物的第一粘性末端充分接触，提高连接效率。
[0136] 需要说明的是，所述周期性震动的实现方式有多种，包括但不限于：在旋转仪上进 行反应，或按一定的时间间隔，吹打或震荡反应体系。
[0137] 进一步的，每一个目标区域对应的KRAS特异性引物有两种，均含有可断裂位点， 它们可相同或不同。优选相同，这样可减少步骤B中反应体系的复杂度，降低实验设计难 度，减少试剂种类，降低成本。
[0138] 进一步的，每一个目标区域对应的KRAS特异性引物有两种，均为可切除序列。优 选均为RNA序列，该方案与采用两种不同的限制性内切酶识别序列相比，在步骤B中，可仅 用RNase H就实现对可切除序列的特异性切割，降低了实验成本和实验方案的设计难度。
[0139] 上述任一方案中，步骤A中PCR扩增使用的聚合酶无特殊限制，可使用高保真的 Pfu酶，也可以用Taq酶。优选为Taq酶，本方案获得扩增产物的3'端为单碱基(A)突出末 端，可以避免扩增产物在连接过程中发生自连。
[0140] 上述任一方案中，所述连接酶无特殊限制，能够实现DNA片段连接即可，例如：E. coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶、热稳定DNA连接酶、Tth DNA连接酶。优选为T4 DNA 连接酶，适用性广，且既可连接粘性末端，又能连接平末端。
[0141] 进一步的，每一个目标区域对应的KRAS特异性引物中只有一种PCR引物上含有可 断裂位点或可切除序列，且另有一种PCR引物的5'端含有标签序列，所述标签序列用于识 别不同的待测序样本和/或同一待测序样本中的不同扩增区域。
[0142] 本方案尤其适用于对多个待测序样本和/或多个待测序区域的测序，通过分别进 行上述步骤A、B和C，然后将所得的单分子扩增产物进行高通量测序，即可获得多个待测序 样本和/或多个待测序区域的序列信息，提高测序通量。
[0143] 此外，当所述待测序样本有多个时，可根据待测序样本的不同分别进行步骤A、B 和C ;所述接头一和/或接头二上含有标签序列；所述标签序列，用于区分待测序样本。本 方案同样能够提高测序通量。
[0144] 针对步骤A中的PCR扩增，需要说明的是，其为非单分子扩增。所述非单分子扩增 是指在进行扩增时，各模板分子在同一个反应体系中进行扩增，且相互之间并未发生空间 上的隔离，包括但不限于：普通PCR扩增、RT-PCR、不对称PCR、固相PCR、原位PCR、反转录 PCR、巢式PCR、兼并引物PCR、免疫PCR、反向PCR和递减PCR等。
[0145] 优选的，所述非单分子扩增为普通PCR扩增、不对称PCR和巢式PCR。
[0146] 当非单分子扩增为巢式PCR时，对应每个SNP位点，用于PCR扩增的PCR引物对均 有两对，可断裂位点或可切除序列位于内引物对中的一种或两种引物上。
[0147] 当非单分子扩增为不对称PCR时，对应每个SNP位点，可断裂位点或可切除序列位 于用于大量单链扩增的引物上。
[0148] 其中，普通PCR扩增设计最为简单，扩增条件宽松，只需要通过简单的设计即可实 现本发明；不对称PCR能够实现待测SNP位点靶链的大量单链扩增；巢式PCR能够显著提高 扩增的特异性，得到高质量的扩增产物，保证后续待测SNP位点检测的正确性。
[0149] 其中，步骤C所述单分子扩增过程中所使用的单分子扩增引物优选分别为接头一 和接头二上的核酸序列，或为分别与接头一和接头二上的核酸序列互补的核酸序列。
[0150] 其中，步骤C所述单分子扩增优选为乳液PCR、桥式PCR或乳液桥式PCR。
[0151] 本发明所述步骤D中的测序方法可为第二代高通量基因测序技术，包括但不限于 连接测序法或合成测序法。
[0152] 所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性 来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物(又称测序引物，其与待测序核酸片段所在 链互补）和寡核苷酸探针(该探针的特定位置上带有荧光标记）进行连接反应，通过检测连 接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信 息。目前，市场上常见的连接测序法有多种，包括但不限于：深圳华因康基因科技有限公司 的Pstar连接测序法、ABI公司的连接测序法、Complete Genomics公司的连接测序法。
[0153] 所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的，以待测 序核酸片段为模板，锚定引物(又称测序引物，其与待测序核酸片段所在链互补）互补结 合至待测序核酸片段上，通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相 应位置的序列信息。目前，市场上常见的合成测序法有多种，包括但不限于=Illumina公 司的Solexa合成测序法、Roche公司的454合成测序法、Life Technologies公司的Ion torrent、Ion Proton 合成测序法。
[0154] 上述常见的测序方法的通量均在GB以上，能够同时对成百上千甚至上万个样本 的成百上千甚至上万个SNP位点进行检测，且准确度均在99. 9%以上。
[0155] 在上述实施例中，进行测序反应时，对应的锚定引物一般可设计为： a、 接头中的一段序列；或 b、 特异性引物中的一段序列；或 c、 特异性引物中的一段序列的互补序列；或 d、 接头的3'端的部分序列与特异性引物中与之相连的5'端的部分序列；或 e、 接头的3'端的部分序列与特异性引物中与之相连的5'端的部分序列所组成的核酸 链的互补序列；或 f、 目标区域所在位置的3'端的互补序列；或 g、 目标区域所在位置的5'端的互补序列。
[0156] 以下将通过具体实施例来进一步说明本发明所记载技术方案的技术效果及优越 性。
[0157] 在一具体实施例中，以正常人的血液基因组DNA为模板，针对KRAS基因的Exon2、、 Exon3中的目标区域进行测序。其中，用于扩增上述4个目标区域的上下游引物分别是：SEQ ID NO:1-2, SEQ ID NO:3-4。
[0158] 其中，SEQ ID N0:2、4中的U为可断裂位点，在扩增完成后，5'端的CGGU会形成一 个可切除序列。
[0159] -、扩增产物的获得。
[0160] 按下述配比配置PCR反应体系：F引物（10 ii M)，0. 5 ii L ;R引物（10 ii M)，0. 5 ii L ; (1阶？（各2.51111)，2111;血液基因组0嫩，20叩出叉丁&9(5。/111)，0.15111 ;10\￡叉丁&9 Buffer，2 u L ;ddH20 加至 20 u L。
[0161] PCR 反应条件如下：95°C 3min ;94°C 15s，56°C 20s，72°C 30s ;重复 20 个循环； 72°C 3min。PCR反应完成后，即得上述4个KRAS基因目标区域对应的扩增产物。
[0162] 二、文库分子的构建。
[0163] 按下述反应体系配置溶液：步骤一所得扩增产物20iiL;USER酶（lU/iiL，NEB， Cat#M5505S)，10 ii L ;10XT4 连接酶缓冲液，L ;T4 DNA 连接酶，2 ii L ;接头一，IOOng ;接 头二，IOOng ;加 CldH2O 至 40 ii L。
[0164] 接头一由 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID N0:10 组成，其中，SEQ ID N0:9-10 链上的 5'末 端无磷酸基团。
[0165] 接头二由 SEQ ID N0:11 和 SEQ ID N0:12 组成，其中，SEQ ID N0:ll-12 链上的 5' 末端无磷酸基团，SEQ ID NO :11的5'末端含生物素标记。
[0166] 25 °C反应20分钟，得连接产物。
[0167] 反应完成后，在连接产物中加入10 y L带链霉亲和素标记的磁珠（invitrogen， Dynabeads* MyOneTM Streptavidin Cl)吸附连接产物，18 至 25°C孵育大约 1 小时，每 10 至15min轻弹管壁或短暂涡旋混匀磁珠，使带生物素的连接产物充分结合到磁珠上。反应 完成后，用磁铁吸附磁珠，移除上清液；用100 UL IXNEBufTer 4冲洗磁珠，然后再用磁 铁吸附磁珠，重复3次，移除上清，得文库分子。
[0168] 各KRAS基因目标区域扩增产物分别进行上述步骤，并获得相应的文库分子。
[0169] 三、单分子扩增。
[0170] 在高温变性条件下，分别将步骤二所得文库分子(双链）变性，然后用磁铁吸附磁 珠，取上清作为单分子扩增的模板。
[0171] 以SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14为单分子扩增引物，分别对各KRAS基因目标区 域对应的单分子扩增模版进行乳液PCR扩增，得单分子扩增产物。其中，SEQ ID NO: 13的 5'末端含有生物素标记，且被预先固定在磁珠上。
[0172] 四、测序。
[0173] 将步骤三所得单分子扩增产物混合，并点样至异硫氰基修饰的载样片（玻片)，于 37°C固定lh，即完成文库分子的可寻址固定。进而采用深圳华因康基因科技有限公司的高 通量基因测序仪Pstar IIA测序仪，以连接测序法进行测序，进而获得上述4个KRAS基因 目标区域的序列信息，经与KRAS基因的野生型序列比对，确定本具体实施例中样本来源人 的上述4个KRAS基因目标区域中均不存在基因突变。
[0174] 本具体实施例实现了对KRAS基因突变的快速检测，提高了检测效率。
[0175] 参照本具体实施例，结合本发明在说明书中的阐述，本发明的方法可对任意的待 测序样本中的KRAS基因的目标区域完成快速测序，且能进一步实现对多个样本的多个目 标区域实现快速测定。
[0176] 以本具体实施例为基础，如果需要同时实现对多个不同来源人的上述4个目标区 域序列的测定，仅需根据来源人的不同，利用相同的扩增引物，在不同反应体系中进行步骤 一，并根据来源人的不同，连接含有不同标签序列的接头二，具体可表现为令上述接头二分 子中的SEQ ID NO: 11中从5'端数起第23-26位（ACGT)为标签序列位（SEQ ID N0:6的相 应位置进行适应性改变，参见图4)，这四个位置共有256种组合，即可区分256种不同来源 人的样本，进而在后续的步骤三中分别进行单分子扩增，并在步骤四中将单分子扩增产物 混合、可寻址固定，进而进行测序，从而确定不同来源人的上述4个目标区域的序列信息， 并得到相应的KRAS基因突变结果。
[0177] 此外，需要进一步说明的是，本具体实施例中的PCR扩增方法为普通PCR扩增，还 可采用巢式PCR或不对称PCR等扩增方法。
[0178] 以对上述具体实施例中的对KRAS基因中的2个目标区域进行突变检测为例。针对 该2个目标区域的扩增(步骤一)，可分别多设计一对外引物，它们分别位于SEQ ID N0:l-2、 SEQ ID N0:3-4的上游和下游，对应的序列可为SEQ ID N0:5-6、SEQ ID N0:7-8、。然后在 配置PCR反应体系时，改外引物对的量可与内引物的量相同或少一些，优选为内引物的量 的十分之一。PCR反应条件修改成：95°C 3min;94°C 15s，52°C 20s，72°C 30s;重复7个循 环；94°C 15s，56°C 20s，72°C 30s;重复13个循环；72°C 3min。即，整个PCR反应过程中 增加了一个退火温度较低的阶段。本方案可以在待测序样本较少的情况下，快速实现对目 标区域的扩增，并提高扩增的特异性。
[0179] 另外，上述对KRAS基因中的2个目标区域扩增引物仅是本发明的较佳实施例，并 不用于限制本发明，其它能够对上述KRAS基因中的2个目标区域实现特异性扩增的引物均 适用于本发明，例如，可用上述的内外引物之间进行组合或在组合的基础上进行适应性调 整。
[0180] 还有，本具体实施例中可断裂位点在PCR引物中所处的位置在与PCR引物和待测 序样本互补配对区域的5'端，与待测序样本不互补配对，且仅有一个；该可断裂位点的设 计仅是对应上述具体实施例的较佳实施例，并不用于限制本发明。本具体实施例中的可断 裂位点（SEQ ID NO:2、4的5'端数起第4位为U)的设计，还可用使SEQ ID NO:2、4的5'端 的第1-4的碱基均用相应的核苷酸代替的方案来替代，并实现相同的效果；此外，断裂剂可 为USER酶，更优选为RNase H。
[0181] 本发明的可断裂位点可有多个；优选相同，本方案可确保在切割-连接反应过程 中，第一粘性末端的快速有效生成；同样，本发明的可断裂位点或可切除序列在断裂或切除 后形成的第一粘性末端的长度不限，对应的序列也没有特殊的要求，适用性好。
[0182] 同样的，上述具体实施例中的接头一、接头二仅是对应上述具体实施例的较佳实 施例，并不用于限制本发明，它们均可参考本发明说明书的记载进行相应的变换。
[0183] 本发明的发明人还分别以下表所示8种突变所在的外显子为单位，构建了 8种突 变载体，然后参照上述具体实施例，对这8种突变载体同时进行检测，其中，以上述接头二 中的标签序列位区分这8种突变载体，检测结果与预期结果完全相同。这进一步说明本发 明的方法能够对任意的待测序样本中的KRAS基因的目标区域完成快速测序，且能进一步 实现对多个样本的多个目标区域实现快速测定。

【权利要求】
1. 一种KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括KRAS特异性引物，所述KRAS特异 性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每个目标区域的KRAS特异 性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
2. 根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，还包括断裂剂、接头 一、接头二、连接酶和连接酶缓冲液；所述断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切 除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端。
3. 根据权利要求2所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头一含有与 第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；所述接头二的一端为单碱基突出末端；所述 单碱基突出末端为T，其位于所在链的3'端。
4. 根据权利要求3所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头一为双链 核酸分子，所述第二粘性末端所在链的5'末端含生物素标记；或所述接头二为双链核酸分 子，所述单碱基突出末端所在链的5'末端含生物素标记。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述 KRAS特异性引物包括SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID NO: 3-4中的至少一对。
6. 根据权利要求2至4中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述 接头一由SEQ ID N0:9-10组成，接头二由SEQ ID N0:ll-12组成。
7. -种用于非疾病诊断治疗目的的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步 骤： A、 利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩 增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序 列； B、 将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在扩增产物两端分别 接上接头一和接头-，得文库分子； 所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、接头一、接头二和连接缓冲液；所述 断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末 端； C、 单分子扩增含接头一和接头二的文库分子，得单分子扩增产物； D、 对单分子扩增产物进行高通量测序，得目标区域的序列信息。
8. 根据权利要求7所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述断裂剂为RNase H、USER酶或限制性内切酶。
9. 根据权利要求7或8所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，每个目标区域的 KRAS特异性引物中至少有两种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列，且由这些可断裂 位点或可切除序列所形成的第一粘性末端之间不能互补配对。
10. 根据权利要求7所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，步骤A中PCR扩增使 用的聚合酶为Taq酶；所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；所 述接头二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3'端。
11. 根据权利要求7所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述待测序样本有多 个，根据待测序样本的不同分别进行步骤A、B和C ;所述接头一和/或接头二上含有标签序 列；所述标签序列，用于区分待测序样本。
12. 根据权利要求7所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述目标区域为 KRAS 基因的 Exon2 和 Exon3 ;所述 KRAS 特异性引物为 SEQ ID NO: 1-2 和 SEQ ID N0:3-4。
13. 根据权利要求11所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述接头一由SEQ ID N0:9-10 组成，接头二由 SEQ ID NO: 11-12 组成。
【文档编号】C12Q1/68GK104450943SQ201410837594
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】盛司潼, 钟茂春 申请人:深圳华因康基因科技有限公司