一种多糖和蛋白肽的联合制备方法
【专利摘要】一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，通过将鲍内脏湿物料绞碎后与水混合蒸煮，用碱性蛋白酶进行第一次酶解，所得酶解液进行膜分离，得到的截留液用风味蛋白酶进行第二次酶解就，再进行膜分离，所得截留液通过冷冻干燥、喷雾干燥或醇沉、真空干燥处理得到鲍内脏多糖，截留液与第一次酶解所得透过液合并，通过反渗透或真空浓缩处理后，冷冻干燥或喷雾干燥得鲍内脏蛋白肽。本发明方法操作简单、实用，可以同时制备多糖和蛋白肽，生产效率高。
【专利说明】一种多糖和蛋白肽的联合制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于多糖、蛋白的分离提取【技术领域】，具体涉及一种多糖和蛋白肽的联合制备方法。
【背景技术】
[0002]福建是鲍养殖大省，鲍年产量近10万吨，占国内总产量80%以上，随着市场需求的快速增长，干鲍、冻鲍加工发展迅速，但在加工过程中会产生约占鲍重1/4的内脏等副产物，目前国内外对这些加工副产物的处理主要用来生产饲料等低附加值产品，大部分鲍鱼内脏没有得到充分的利用，不仅浪费资源，也会给环境造成污染。鲍内脏中多糖、蛋白质分别占其干物质约20%、50%，是极好的加工生物多糖和小分子蛋白活性肽的资源。鲍内脏多糖、蛋白肽与人体细胞有良好的生物兼容性，无细胞毒性且可被生物体分解，具有增强免疫、抗疲劳、抗氧化及抗肿瘤等生物学活性，在保健食品、护肤日用品、生物制药等领域有广泛的应用前景。
[0003]目前，利用鲍内脏制备多糖、蛋白肽的工艺主要是针对多糖或蛋白肽进行单独提取、制备，缺乏联合制备工艺，原料利用率低。同时，由于鲍内脏中多糖与蛋白质主要以糖蛋白的结合形式存在，无论是采用热水/碱浸提、单一的酶解或膜分离技术制备获得的鲍多糖，均含有较多的蛋白质成分，导致鲍多糖纯度低，而后期无论采用Sevag法或三氯乙酸法脱蛋白，还是采用过氧化氢或活性炭脱色，都会导致产物的得率明显降低。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术存在的缺陷，使用分步酶解和膜分离技术组合工艺，旨在提供一种鲍内脏多糖和蛋白肽的联合制备方法。
[0005]本发明具体通过以下技术方案实现:
[0006]一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，包括以下步骤:
[0007]I)原料预处理:将鲍内脏湿物料绞碎，加水混合在100?105°C条件下蒸煮10?20min，降温至 50 0C ；
[0008]2)第一次酶解:添加碱性蛋白酶，酶解完成后，料液煮沸10?15min，冷却至40°C以下，离心分离得沉淀和酶解液；
[0009]3)第一次膜分离:将酶解液进行膜分离，得到透过液和截留液；
[0010]4)第二次酶解:截留液加水稀释，加入步骤⑵中沉淀物，添加风味蛋白酶进行二次酶解，酶解完成后加入料液重量I?2%的活性炭粉末，煮沸10?15min，冷却至40°C以下，离心去除沉淀，得酶解液；
[0011]5)第二次膜分离:所得酶解液除去悬浮微粒及杂质，滤液进行膜分离，得到透过液和截留液；
[0012]6)干燥制备:步骤(5)所得截留液通过冷冻干燥、喷雾干燥或醇沉、真空干燥处理得到鲍内脏多糖；步骤(3)和(5)所得透过液合并，通过反渗透或真空浓缩处理后，冷冻干燥或喷雾干燥得鲍内脏蛋白肽。
[0013]进一步，
[0014]步骤(I)中所述的加水量为鲍内脏湿物料重量的5?8倍。
[0015]步骤⑵中酶的添加量为200?600U/g鲍内脏原料，酶解反应时间为8?16h。
[0016]步骤(3)中酶解液用截留分子量5000?1000Da的膜进行膜分离，所述的截留液的体积为酶解液的1/6?1/4。
[0017]步骤(4)中截留液加I?2倍体积的水稀释，所述的风味蛋白酶的添加量为50?200U/g鲍内脏原料，酶解时间为6?10h。
[0018]步骤(5)中酶解液用过滤精度为1.0?5.0微米的微孔过滤机过滤除去悬浮微粒及杂质，滤液用截留分子量5000?1000Da的膜进行膜分离，得到截留液的体积为酶解液的 1/6 ?1/4。
[0019]本发明的有益效果为:
[0020]I)采用不同的蛋白酶对鲍内脏进行分步酶解，达到了充分分解的目的；
[0021]2)采用多次酶解和膜分离联合制备工艺有利于获得低蛋白含量的高纯度鲍内脏多糖；
[0022]3)选用碱性蛋白酶为第一次酶解用酶，酶解的碱性pH环境可以促进多糖类物质从原料中释放、溶出；选用同时含有端肽酶和内切酶活性的风味蛋白酶为第二次酶解用酶，有利于将第一次酶解获得的粗多糖中的蛋白质进一步水解；
[0023]4)鲍内脏含有大量的色素类物质，鲍内脏多糖、蛋白肽的制备过程中要进行脱色处理。本发明第一次膜分离时，色素随多糖类物质被截留，蛋白肽透过液无需进行脱色处理，截留物进行二次酶解后，灭酶前加入活性碳，同时完成灭酶和脱色处理，活性碳还能吸附物料中的悬浮颗粒，有利于后续的膜分离操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是鲍内脏多糖GlOO凝胶柱色谱图；
[0025]图2是多肽分子量测定标样凝胶色谱HPLC图；
[0026]图3是鲍内脏蛋白肽分子量分布凝胶色谱HPLC图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0028]实施例1
[0029]一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，包括以下步骤:
[0030](I)原料预处理:取冻藏鲍内脏1.5kg，经Imm孔径绞肉机绞碎后作为原料送入酶解罐，加7.5kg水充分混合制成料液，料液升温至105°C加热15min，降温至50°C。
[0031](2)第一次酶解:调整料液ρΗΙΟ.Ο、温度52°C，添加600U/g原料的中性蛋白酶，恒温酶解8hr，煮沸15min，冷却至30°C，酶解液在5000rpm转速条件下离心，得沉淀和酶解液；
[0032](3)第一次膜分离:酶解液用截留分子量1000Da的超滤膜进行膜分离，截留液体积约2000ml时停止超滤。
[0033](4)第二次酶解:将第一次酶解所得沉淀物和第一次膜分离所得截留液加入酶解罐，加入4000ml的水混匀，调整料液pH7.0、温度50°C，添加200U/g原料的风味蛋白酶，恒温酶解1hr，加入60g活性碳粉末，煮沸15min，冷却至30°C，酶解液在4500rpm转速条件下离心脱除沉淀，酶解液用过滤精度为5.0微米的微孔过滤机过滤除去悬浮微粒及杂质。
[0034](5)第二次膜分离:第二次酶解的酶解液用截留分子量5000Da的超滤膜进行膜分离，截留液体积约1500ml时停止超滤。
[0035](6)干燥制备:第二次膜分离的截留液经真空浓缩、冷冻干燥后得鲍内脏多糖76g，两次膜分离所得透过液合并经反渗透浓缩、冷冻干燥后得鲍内脏蛋白肽145g。
[0036]实施例2
[0037]一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，包括以下步骤:
[0038](I)原料预处理:取新鲜鲍内脏1kg，经2mm孔径绞肉机绞碎后作为原料送入酶解罐，加8kg水充分混合制成料液，料液升温至100°C加热lOmin，降温至50°C。
[0039](2)第一次酶解:调整料液ρΗΙΟ.0、温度52°C，添加200U/g原料的中性蛋白酶，恒温酶解16hr，煮沸lOmin，冷却至30°C，酶解液在5000rpm转速条件下离心，得沉淀和酶解液；
[0040](3)第一次膜分离:酶解液用截留分子量5000Da的超滤膜进行膜分离，截留液体积约1500ml时停止超滤。
[0041](4)第二次酶解:将第一次酶解所得沉淀物和第一次膜分离所得截留液加入酶解罐，加入1500ml的水混匀，调整料液pH7.0、温度50°C，添加50U/g原料的风味蛋白酶，恒温酶解6hr，加入60g活性碳粉末，煮沸lOmin，冷却至30°C，酶解液在4500rpm转速条件下离心脱除沉淀，酶解液用过滤精度为1.0微米的微孔过滤机过滤除去悬浮微粒及杂质。
[0042](5)第二次膜分离:第二次酶解的酶解液用截留分子量1000Da的超滤膜进行膜分离，截留液体积约500ml时停止超滤。
[0043](6)干燥制备:第二次膜分离的截留液经真空浓缩、冷冻干燥后得鲍内脏多糖46g，两次膜分离所得透过液合并经反渗透浓缩、冷冻干燥后得鲍内脏蛋白肽85g ;鲍内脏多糖含糖量63%，蛋白含量20%，鲍内脏多糖样品上葡聚糖凝胶GlOO柱层析分离得两个多糖组分，凝胶色谱图见图1 ;鲍内脏蛋白肽总氮含量为13.8%，如图2所示，图中从左至右波峰依次为细胞色素C(12384 Da)、抑肽酶(6512Da)、生长激素抑制素(1636.7 Da)、氧化性谷胱甘肽(613 Da)、谷胱甘肽(307 Da)，结合图3可知，鲍内脏蛋白肽中小分子肽的分子量主要分布在300?700Da，相对分子量小于100Da的小分子肽占蛋白水解物的比例大于90%。
[0044]后经实验证明，本发明也可用于以海参、蚕蛹等富含多糖、蛋白质的其它生物材料为原料制备多糖和蛋白肽，故不能以此限定本发明实施的范围，即依本发明申请专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。
【权利要求】
1.一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)原料预处理:将鲍内脏湿物料绞碎，加水混合在100?105°C条件下蒸煮10?20min，降温至 50 0C ； 2)第一次酶解:添加碱性蛋白酶，酶解完成后，料液煮沸10?15min，冷却至40°C以下，离心分离得沉淀和酶解液； 3)第一次膜分离:将酶解液进行膜分离，得到透过液和截留液； 4)第二次酶解:截留液加水稀释，加入步骤(2)中沉淀物，添加风味蛋白酶进行二次酶解，酶解完成后加入料液重量I?2 %的活性炭粉末，煮沸10?15min，冷却至40°C以下，离心去除沉淀，得酶解液； 5)第二次膜分离:所得酶解液除去悬浮微粒及杂质，滤液进行膜分离，得到透过液和截留液； 6)干燥制备:步骤(5)所得截留液通过冷冻干燥、喷雾干燥或醇沉、真空干燥处理得到鲍内脏多糖；步骤(3)和(5)所得透过液合并，通过反渗透或真空浓缩处理后，冷冻干燥或喷雾干燥得鲍内脏蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述的加水量为鲍内脏湿物料重量的5?8倍。
3.根据权利要求1所述的一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，其特征在于:步骤(2)中酶的添加量为200?600U/g鲍内脏原料，酶解反应时间为8?16h。
4.根据权利要求1所述的一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，其特征在于:步骤(3)中酶解液用截留分子量5000?1000Da的膜进行膜分离，所述的截留液的体积为酶解液的1/6 ?1/4。
5.根据权利要求1所述的一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，其特征在于:步骤(4)中截留液加I?2倍体积的水稀释，所述的风味蛋白酶的添加量为50?200U/g鲍内脏原料，酶解时间为6?10h。
6.根据权利要求1所述的一种多糖和蛋白肽的联合制备方法，其特征在于:步骤(5)中酶解液用过滤精度为1.0?5.0微米的微孔过滤机过滤除去悬浮微粒及杂质，滤液用截留分子量5000?1000Da的膜进行膜分离，得到截留液的体积为酶解液的1/6?1/4。
【文档编号】C12P21/06GK104513843SQ201410837532
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】熊何健, 马英, 刘智禹, 何传波, 魏好程, 吴国宏, 王娇 申请人:集美大学