本发明属于食品或保健品领域，具体涉及一种组合物及其制备方法与用途，特别涉及一种具有降血糖、降血脂、增强免疫力功能的组合物及其制备方法和用途。
背景技术：
目前随着现代生活节奏的加快，人们饮食结构发生改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已经成为世界头号健康杀手，每年心血管疾病死亡人数约1700万，占全球总死亡人数的30％。心脑血管疾病的危险因素有高血压、高脂血症、糖尿病、肥胖和吸烟。
糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。血糖是诊断糖尿病的惟一标准。但目前尚无根治糖尿病的方法，只能通过多种治疗手段可控制好糖尿病。西药控制血糖作用尚可，但长期服用会产生副作用；因此研究一种中药或具有中药疗效的食品或保健品更让患者值得期待。
高脂血症是体内脂质代谢紊乱，导致血脂水平增高的一种病症，主要指血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平过高或高密度脂蛋白水平过低。高血脂症早期没有明显的临床症状，它对身体的损害是隐匿性、渐行性的，而且是全身性的。因为高血脂可加速动脉粥样硬化，一旦动脉堵塞，就会引起很多疾病，如心脑血管疾病、肾脏病、肝脏疾病等。然而对于治疗高血脂症的情况并不理想，因此亟待开发降血脂的药物或者具有辅助降血脂的食品原料。
随着社会经济发展水平的提高和人民健康意识的增强，人们越来越多地认识到增强免疫力的重要性，具有该功能的产品也越来越多地受到了人们的关注。人类对于健康的重新认识，使得“防病胜于治病”的理念深入人心，保健食品以其可以长期安全服用的优点，深得人们的认同。因而，开发具有增强免疫力功能的产品具有广阔的市场前景。
技术实现要素：
针对上述不足，本发明提供了一种简单易得，疗效显著的并同时具有降血糖、降血脂、增强免疫力功能的组合物。
本发明的另一个目的是提供上述组合物的制备方法。
本发明的又一个目的是提供上述组合物的用途。
本发明所提供的具有降血糖、降血脂、增强免疫力功能的组合物，由以下重量份配比的原料药组成：
人参0.1-3份，优选0.3-2.5份，更优选0.7-1.5份；
黑苦荞1-20份，优选3-15份，更优选5-12份。
上述组合物的原料药来源如下：
人参：panaxginsengc.a.mey，为多年生草本植物，味甘、微苦，性微温，归脾、肺、心、肾经，气雄体润，升多于降；具有补气固脱，健脾益肺，宁心益智，养血生津的功效。主治体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，内热消渴，久病虚羸，惊悸失眠，阳痿宫冷；心力衰竭，心原性休克。用于气短喘促，心悸健忘，口渴多汗，食少无力，一切急慢性疾病及失血后引起的休克、虚脱。大补元气，固脱生津，安神。治劳伤虚损，食少，倦怠，反胃吐食，大便滑泄，虚咳喘促，自汗暴脱，惊悸，健忘，眩晕头痛，阳痿，尿频，消渴，妇女崩漏，小儿慢惊，及久虚不复，一切气血津液不足之证。经药理学研究证明，人参的有效成分人参皂甙能够促进糖原分解，抑制糖原合成，降低肝糖原含量，还可以增加葡萄糖激酶的活性，加速葡萄糖氧化分解，有利于降低血糖浓度；另外，人参能够刺激胰岛素分泌，增强葡萄糖对胰岛素的敏感性，促进葡萄糖的利用，可进一步促进血糖下降；人参皂苷还可以改善血脂和降低血脂中的胆固醇，对血脂有一定的稀释作用。
黑苦荞：fagopyrumtataricum(l.)gaertn，为一年生草本植物，性平寒，能实肠胃，益气力，续精神，利耳目，炼五脏渣秽，可安神、活气血、降气宽肠、清热肿风痛、祛积化滞、清肠、润肠、通便、止咳、平喘、抗炎、抗过敏、强心、减肥、美容等功效。近代医学研究表明，黑苦荞有效成分生物碱黄酮可以软化血管，改善微循环，清热解毒、活血化瘀、拔毒生肌、有降血糖、尿糖、血脂、益气提神、加强胰岛素外周作用。
上述所述组合物为口服制剂，呈现为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、口服液体制剂、袋装茶剂、袋泡茶剂任意一种形式，优选口服液体制剂。
根据本发明的一个优选实施方案，所述组合物是通过将原料按照以下方法制得：
将所述重量份的原料药直接粉碎成粗粉；或加水或不同浓度的乙醇提取，提取液浓缩干燥得粗提物；或进一步采用水提醇沉法、离心法、有机溶剂萃取法、柱层析法、水蒸气蒸馏法进行精制得到精提物；上述药材粗粉或粗提物或精提物上述药材粗粉或粗提物或精提物不加或者加入适量辅料制成相应剂型。
进一步，组合物呈现为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、口服液体制剂、袋装茶剂、袋泡茶剂任意一种形式。
根据不同的制剂其载体或辅料有所不同，如在片剂、胶囊剂、颗粒剂等固体制剂中常用的稀释剂、崩解剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂等；在糖浆、口服液等液体制剂形式中常用的表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等。
其常用辅料如淀粉、乳糖、蔗糖、糊精、糖粉、微晶纤维素、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、改良淀粉、山梨醇、赤藓糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、重质碳酸镁、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲淀粉钠、羟丙基纤维素、聚维酮k30、白陶土、预胶化淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素、糖精钠、冰糖、蜂蜜、枸橼酸、碳酸氢钠、碳酸钠、卡拉胶、琼脂、明胶、海藻酸钠、黄原胶、瓜尔豆胶、西黄耆胶、阿拉伯胶、槐豆胶、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯聚丙烯酰胺、交联型聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、卡波姆、山梨酸、山梨酸钾、羟苯乙酯、苯甲醇、尼泊金、硫柳汞、二甲基亚砜、氮酮、三乙醇胺、氢氧化钠、甘油、丙二醇、bht、bha、十二烷基硫酸钠、吐温类、司盘类、三氯蔗糖等。
进一步，所述组合物是通过将原料按照以下方法制得：
1)按所述重量份的原料药人参加9-12倍量水提取2次，每次0.5-3小时，分别获得提取液；然后人参与黑苦荞合并，加9-12倍量水，提取0.2-1小时，获得提取液；过滤，合并滤液；
2)将滤液进一步浓缩，冷藏离心、过滤、加辅料制成相应剂型。
进一步，组合物呈现为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、口服液体制剂、袋装茶剂、袋泡茶剂任意一种形式。
进一步，其辅料为甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素、糖精钠、冰糖、蜂蜜、三氯蔗糖、木糖醇、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾中一种或几种。
本发明的另一个目的，提供一种制备所述组合物的方法，包括以下步骤：
将所述重量份的原料药直接粉碎成粗粉；或加水或不同浓度的乙醇提取，提取液浓缩干燥得粗提物；或进一步采用水提醇沉法、离心法、有机溶剂萃取法、柱层析法、水蒸气蒸馏法进行精制得到精提物；上述药材粗粉或粗提物或精提物即为本发明组合物的活性成分。
根据不同的制剂其载体或辅料有所不同，如在片剂、胶囊剂、颗粒剂等固体制剂中常用的稀释剂、崩解剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂等；在糖浆、口服液等液体制剂形式中常用的表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等。
其常用辅料如淀粉、乳糖、蔗糖、糊精、糖粉、微晶纤维素、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、改良淀粉、山梨醇、赤藓糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、重质碳酸镁、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲淀粉钠、羟丙基纤维素、聚维酮k30、白陶土、预胶化淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素、糖精钠、冰糖、蜂蜜、枸橼酸、碳酸氢钠、碳酸钠、卡拉胶、琼脂、明胶、海藻酸钠、黄原胶、瓜尔豆胶、西黄耆胶、阿拉伯胶、槐豆胶、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、聚丙烯酰胺、交联型聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、卡波姆、山梨酸、山梨酸钾、羟苯乙酯、苯甲醇、尼泊金、硫柳汞、二甲基亚砜、氮酮、三乙醇胺、氢氧化钠、甘油、丙二醇、bht、bha、十二烷基硫酸钠、吐温类、司盘类、三氯蔗糖等。
进一步，提供一种制备所述组合物的方法，包括以下步骤：
1)按所述重量份的原料药人参加9-12倍量水提取2次，每次0.5-3小时，分别获得提取液；然后人参与黑苦荞合并，加9-12倍量水，提取0.2-1小时，获得提取液；过滤，合并滤液；
2)将滤液进一步浓缩，冷藏离心、过滤、加辅料制成相应剂型。
进一步，组合物呈现为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、口服液体制剂、袋装茶剂、袋泡茶剂任意一种形式。
进一步，其辅料为甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素、糖精钠、冰糖、蜂蜜、三氯蔗糖、木糖醇、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾中一种或几种。
本发明的又一个目的，提供所述组合物的用途，用于制备具有降血糖、降血脂、增强免疫力功能的食品或保健品中的用途。
本发明的有益效果
本发明组合物组分人参和黑苦荞，一温一寒、一升一降，二者配伍其功效相互调节。同时人参有大补元气之效，故用量要恰当，因此本专利申请的发明人对二者配比及二者提取工艺不断摸索研究，在权利要求所示出的工艺条件下提取量可达到优级，且二者结合对降血脂、降血糖及增强免疫力有显著疗效，协同增效作用也很显著。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容进一步详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1人参1份、黑苦荞8份
取所述配方量的人参第一次加9倍量水，提取1小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；然后人参与黑苦荞合并，加9倍量水，提取1小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
实施例2人参0.4份、黑苦荞4份
取所述配方量的人参第一次加9倍量水，提取2小时，获得提取液；第二次人参加11倍量水，提取2小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加10倍量水，提取1小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
实施例3人参0.1份、黑苦荞1份
取所述配方量的人参第一次加10倍量水，提取2小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取2小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，减压干燥，加辅料，混匀，制粒，干燥，整粒，即得颗粒剂。
实施例4人参2.8份、黑苦荞2份
取所述配方量的人参第一次加12倍量水，提取2小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
实施例5人参2.5份、黑苦荞3份
取所述配方量的人参第一次加11倍量水，提取0.5小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加11倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，减压干燥，粉碎成细粉，加辅料，混匀，制粒，干燥，压片，包衣或不包衣，即得片剂。
实施例6人参0.7份、黑苦荞5份
取所述配方量的人参第一次加12倍量水，提取1小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，减压干燥，粉碎成细粉，加辅料，混匀，制粒，干燥，压片，包衣或不包衣，即得片剂。
实施例7人参1.5份、黑苦荞12份
取所述配方量的人参第一次加12倍量水，提取2小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
实施例8人参1.2份、黑苦荞9份
取所述配方量的人参第一次加12倍量水，提取1.5小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加11倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，减压浓缩至稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入适量辅料，混匀，制粒，干燥，装胶囊，即得胶囊剂。
实施例9人参0.3份、黑苦荞15份
取所述配方量的人参第一次加10倍量水，提取2小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加12倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，减压浓缩至稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，加入适量辅料，混匀，制粒，干燥，装胶囊，即得胶囊剂。
实施例10人参0.2份、黑苦荞18份
取所述配方量的人参第一次加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取2小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，混匀，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
实施例11人参3份、黑苦荞20份
取所述配方量的人参第一次加12倍量水，提取1.5小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取2小时，获得提取液；然后人参与苦荞合并，加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
实施例12人参1份
取所述配方量的人参第一次加12倍量水，提取2小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；第三次人参加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
实施例13黑苦荞8份
取所述配方量的人参第一次加12倍量水，提取2小时，获得提取液；第二次人参加10倍量水，提取1.5小时，获得提取液；第三次人参加10倍量水，提取0.5小时，获得提取液；过滤，合并滤液，浓缩，加辅料，混匀，加水定容，分装，灭菌，即得口服液体制剂。
通过以下实验进一步阐述本发明所述组合物的有益效果：
一、降血糖功能实验
1材料和方法
1.1材料
1.1.1样品：实施例1、2、12、13制备的样品。
1.1.2实验动物：昆明种小鼠，24g～28g，雄性，spf级。
1.1.3仪器和试剂：罗康全整合型血糖仪、血糖试纸、四氧嘧啶。
1.2方法
1.2.1正常动物降糖试验
取小鼠30只，禁食5小时，取尾血测血糖值。依据血糖水平随机分为2组，每组15只，分别为实验组、正常对照组。实验组给予受试物(实施例1组合物)，正常对照组给予蒸馏水，灌胃量：20ml/kg。连续给予30天后禁食5小时，取尾血测空腹血糖值，比较两组动物血糖值。
1.2.2胰岛素损伤高血糖模型动物
1.2.2.1降低空腹血糖试验
取健康小鼠，禁食24小时后，尾静脉给予四氧嘧啶45mg/kg(给予量10ml/kg)，7天后禁食5小时，取尾血测血糖值。血糖值在10mmol/l～25mmol/l为高血糖模型成功动物。将高血糖模型动物依据血糖水平随机分为5组，分别为模型对照组、实验组1、实验组2、对照实验组1和对照实验组2。实验组依次分别给予实施例1、2、12、13所制得相应浓度的受试物，模型对照组给予蒸馏水，灌胃量：20ml/kg。连续给予30天后禁食5小时，取尾血测空腹血糖值，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。
1.2.2.2糖耐量试验
实验组依次分别给予实施例1、2所制得相应浓度的受试物，模型对照组给予蒸馏水，灌胃量：20ml/kg。连续给予30天后禁食5小时，实验组再给予相应浓度的受试物，模型对照组给予同体积的蒸馏水，20分钟后经口给予葡萄糖2.0g/kg(灌胃量：20ml/kg)，取尾血测定给葡萄糖后0、0.5、2小时的血糖值，计算模型对照组与药物组给葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积，作为糖耐量观察指标。
血糖曲线下面积＝0.25×(0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时血糖值)。
2结果
表1本发明组合物对正常小鼠空腹血糖的影响(mmol/l)
注：与其他对照组比较p﹥0.05
由表1可见，实验组试验前后空腹血糖与正常对照组比较差异无显著意义(p﹥0.05),提示本试验条件下，本发明组合物对正常小鼠空腹血糖无明显影响。
表2本发明组合物对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响(mmol/l)
注：*与其他对照组比较p＜0.05
由表2可见，试验后各实验组高血糖模型小鼠空腹血糖低于模型对照组，差异有显著意义(p<0.05)，同时实验组1、2高血糖模型小鼠空腹血糖低于对照实验组1、2，提示本试验条件下，本发明组合物降低高血糖模型小鼠空腹血糖试验结果为阳性，并且组合物成分之间具有协同增效作用，缺少任意组分，组合物效果会显著降低。
表3本发明组合物对高血糖模型小鼠糖耐量的影响(mmol/l)
注：*与其他对照组比较p<0.05
由表3可见，实验组能减少高血糖模型小鼠的血糖曲线下面积，与模型对照组比较差异有显著意义(p<0.05)，提示本试验条件下，本发明组合物糖耐量试验结果为阳性。
本发明其它实施例均按照上述方法进行了相似的试验，结果与上述结果相同。
因此，根据以上试验结果及卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)说明：本发明组合物具有辅助降血糖功能，同时试验结果还表明本发明组合物各成分之间协同增效作用明显。
二、降血脂功能试验
1、材料
1.1样品：实施例1、2、12、13制备的样品。
1.2实验动物：健康sd种雄性大鼠，体重为(150-170)g。
1.3仪器：解剖器械、721分光光度计、自动生化分析仪，胆固醇、胆盐、血清总胆固醇(tc)、甘油三脂(tg)、高密度脂蛋白hdl-c试剂盒。
1.4剂量：剂量设计为1.5g/kg。每天一次，连续30天。
2、方法
在实验环境下大鼠喂饲基础饲料观察5天，称量体重，然后取尾血，测定血清总胆固醇(tc)，甘油三酯(tg)，高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平。根据血清总胆固醇(tc)水平随机分成6组：正常对照组、模型对照组、实验组1、实验组2、对照实验组1和对照实验组2。正式实验开始后，除正常对照组给予基础饲料外，其余各组均给予高脂饲料。同时除正常对照组和模型对照组以灌胃方式给及蒸馏水外，其余实验组以灌胃方式分别给予实施例1、2、12、13受试样品。连续给予30天后，称量体重，禁食15个小时，取尾血测其血清血清总胆固醇(tc)，甘油三酯(tg)，高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平。
3、结果
表4本发明组合物对大鼠体重的影响
*与模型对照组相比，*p<0.05。
由表4可见，相比正常对照组，各实验组大鼠体重无明显差异(p〉0.05)。
表5本发明组合物对大鼠血清tc的影响
*与模型对照组相比，*p<0.05。
由表5可见，试验后各实验组大鼠用药后的血清tc浓度均低于模型对照组，差异有显著意义(p<0.05)，提示本试验条件下，本发明组合物降低血清tc试验结果为阳性。
表6本发明组合物对大鼠血清中tg的影响
*与模型对照组相比，*p<0.05。
由表6可见，试验后各实验组大鼠用药后的血清tg浓度均低于模型对照组，差异有显著意义(p<0.05)，提示本试验条件下，本发明组合物降低血清tg试验结果为阳性。
表7本发明组合物对大鼠血清中hdl-c的影响
*与模型对照组相比，*p<0.05。
由表7可见，试验后各实验组大鼠用药后的血清hdl-c浓度均高于模型对照组，差异有显著意义(p<0.05)，提示本试验条件下，本发明组合物升高血清hdl-c试验结果为阳性。
本发明其它实施例均按照上述方法进行了相似的试验，结果与上述结果一致。
因此，根据以上试验结果及卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)说明：本发明组合物具有辅助降血脂功能。
三、增强免疫力试验
1、材料和方法
1)样品：按照实施例1、2、12、13制备的样品，分别给予实验组1、实验组2、对照实验组1、对照实验组2。
2)实验动物：18-22g昆明种健康清洁级雌性小鼠240只，共分为四批进行实验，每批随机分为5组，每组12只。
实验一批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、半数溶血值(hc50)的测定和抗体生成细胞数的测定；
实验二批进行碳廓清实验；
实验三批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；
实验四批进行cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和nk细胞活性测定。
3)剂量：
受试物以无菌水配制，每日一次经口给予，连续灌胃33天后测各项指标。小鼠灌胃体积为0.1ml/10g鼠重。
同时设一空白对照组(0g/kgbw)，用无菌水替代受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。
4)主要仪器与试剂：
es-2100a电子天平、bs223s电子天平、755分光光度计、酶标仪、二氧化碳培养箱、低速离心机、恒温水浴、显微镜、倒置显微镜、螺旋测微仪。
洁净工作台、无菌手术器械、微量注射器(25μl)、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔u型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等。
绵羊红细胞(srbc)、生理盐水、hank's液(ph7.2-7.4)、rpmil640培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、刀豆蛋白a(cona)、1％冰醋酸、1mol/l的hcl溶液、酸性异丙醇(96ml异丙醇加1mol/l的hcl溶液4ml)、mtt、pbs缓冲液(ph7.2-7.4)、补体(豚鼠血清)、sa缓冲液、琼脂糖、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000ml)、yac-1细胞、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶i、0.2mol/l的tris-hcl缓冲液(ph8.2)、1％np40、印度墨汁、0.1％na2co3、鸡红细胞、甲醇、giemsa染液等。
5)实验方法：
a.脏器体重比值的测定
小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏体重比值和胸腺体重比值。
b.迟发型变态反应(dth)实验(足跖增厚法)
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积srbc(2000r/min，10min)0.2ml，致敏后4d，测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。然后在测量部位皮下注射20％(v/v，用生理盐水配制)压积srbc20μl，于注射后24h测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值来表示dth的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
c.cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(mtt法)
无菌取脾，置于盛有适量无菌hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，制成细胞悬液。用hank’s液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，镜检计数，调整细胞浓度为3×106个/ml。再将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，在其中一孔加75μlcona液(相当于7.5μg/ml)，另一孔作为对照，置5％co2，37℃co2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同时加入mtt(5mg/ml)50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后将此液体移入比色杯中，在755分光光度计上比色测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加cona孔的光密度值减去不加cona孔的光密度值代表淋巴细胞的增值能力。受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
d.抗体生成细胞数的测定(jerne改良玻片法)
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积srbc0.2ml。将srbc免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液。离心(1000r/min)10min，用hank’s液洗2遍，最后将细胞悬液在8mlhank’s液中。将琼脂糖加热溶解后，与等量双倍hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加10％(v/v，用sa液配制)压积srbc50μl、脾细胞悬液8μl，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中37℃温育1h，然后用sa缓冲液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞来表示。受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
e.半数溶血值(hc50)的测定
取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积srbc0.2ml进行免疫。5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用sa缓冲液将血清稀释为300倍，取1ml置试管内，依次加入10％(v/v，用sa缓冲液配制)压积srbc0.5ml，补体1ml(用sa缓冲液按1∶8稀释)。另设不加血清的对照管(以sa缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温15min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1ml，加都氏试剂至3ml。同时取10％(v/v，用sa缓冲液配制)的压积srbc0.25ml，加都氏试剂至4ml于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(hc50)表示，按下式计算：样品半数溶血值＝样品光密度值/srbc半数溶血时的光密度值×稀释倍数受试样品组的hc50显著高于对照组的hc50，可判定该项实验结果阳性。
f.小鼠碳廓清实验
按体重从小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁(0.05ml/10g)。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl，并将其加到2ml0.1％na2co3溶液中。用755分光光度计在600nm波长处测光密度值(od)，以na2co3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重。以碳廓清指数(a)表示小鼠碳廓清的能力，按下式计算a：
k＝(lgod1-lgod2)/(t2-t1)a＝体重÷(肝重+脾重)×k1/3
受试样品组的碳廓清指数显著高于对照组的碳廓清指数，可判定该项实验结果阳性。
g.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)鸡红细胞(2000r/min，10min)悬液1ml，间隔30min，颈椎脱臼处死，将其仰位固定于鼠板上，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。取腹腔巨噬细胞洗液1ml，分别滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，gicmsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬百分率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
得出的吞噬百分率再按下式进行数据转换，
h.nk细胞活性的测定(乳酸脱氢酶ldh测定法)
实验前24h将靶细胞yac-1进行传代培养，应用前以hank’s液洗3次，用含10％小牛血清的rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5ml2倍hank’s液及8mlhank’s液，1000r/min，10min离心，用1ml含10％小牛血清的rpmi1640完全培养液重悬，镜检计数，用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/ml。使效靶比为50∶1。取靶细胞和效应细胞各100μl，加入u形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％np40各100μl；上述各项均设三个平行孔，37℃、5％co2培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，加入ldh基质液100μl，反应3-10min，然后每孔加入1mol/l的hcl溶液30μl终止反应，在酶标仪490nm处测光密度值(od)，计算nk细胞活性：
nk细胞活性(％)＝(反应孔od-自然释放孔od)/(最大释放孔od-自然释放孔od)×100
得出的nk细胞活性按下式进行数据转换，
6)数据处理
用spss软件进行数据处理。采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算f值，f值＜f0.05，结论：各组均数间差异无显著性，f值≥f0.05，p≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
7)结果判定依据
《保健食品检验与评价技术规范)》(2003版)规定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、nk细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性。nk细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定nk细胞活性结果阳性。
2、结果
1)本发明组合物对小鼠体重的影响
通过称重可知，小鼠的初始体重在四批实验动物各样品组与空白对照组间比较，差异均无显著性(p＞0.05)。即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。
表8本发明组合物对小鼠体重的影响
由表8可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，小鼠的体重在五批各实验组与空白对照组间比较，差异均无显著性(p＞0.05)。即本发明组合物对小鼠体重无不良影响。
2)本发明组合物对小鼠脏器/体重比值的影响
表9本发明组合物对小鼠脾脏/体重比值的影响
由表9可见，经口给予小鼠本发明组合物后，各样品组脾脏/体重比值与空白对照组比较，差异均无显著性(p＞0.05)。即本发明组合物对小鼠的脾脏/体重比值无特别影响。
表10本发明组合物对小鼠胸腺/体重比值的影响
由表10可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，各实验组胸腺/体重比值与空白对照组比较，差异均无显著性(p＞0.05)。即本发明组合物对小鼠的胸腺/体重比值无特别影响。
3)本发明组合物对小鼠细胞免疫功能的影响
表11本发明组合物对小鼠迟发型变态反应(dth)的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表11可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，小鼠的足跖肿胀度有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高小鼠足跖肿胀度。
表12本发明组合物对小鼠淋巴细胞转化实验的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表12可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，小鼠的淋巴细胞增殖能力有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高cona诱导的小鼠淋巴细胞转化能力。
4)本发明组合物对体液免疫的影响
表13本发明组合物对小鼠抗体生成细胞数的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表13可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，小鼠抗体生成细胞数有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高小鼠抗体生成细胞数。
表14本发明组合物对小鼠半数溶血值(hc50)的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表14可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，小鼠的半数溶血值有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高小鼠半数溶血值。
5)本发明组合物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
表15本发明组合物对小鼠碳廓清能力的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表15可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，小鼠的碳廓清能力有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高小鼠的碳廓清能力。
表16本发明组合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表16可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，吞噬率有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率。
表17本发明组合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表17可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，吞噬指数有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数。
6)本发明组合物对小鼠nk细胞活性的影响
表18本发明组合物对小鼠nk细胞活性的影响
*与空白对照组比较，p＜0.05
由表18可见，经口给予小鼠本发明组合物33天后，实验组与空白对照组比较，小鼠nk细胞活性有显著性差异(p＜0.05)。即本发明组合物能显著提高小鼠nk细胞活性。
本发明其他实施例均按照上述方法进行了相似的试验，结果与上述结果相同。
3、结论
经口给予小鼠本发明组合物33天后，与其他实验组比较，本发明组合物能显著提高小鼠足跖肿胀度(p＜0.05)、提高cona诱导的小鼠淋巴细胞转化能力(p＜0.05)、提高小鼠抗体生成细胞数(p＜0.05)、提高小鼠半数溶血值(p＜0.05)、提高小鼠的碳廓清能力(p＜0.05)、提高小鼠nk细胞活性(p＜0.05)，且本发明组合物对小鼠体重增长无不良影响。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)对增强免疫力保健食品的评判标准表明，本发明组合物具有增强免疫力的功能。同时，各试验结果还表明：本发明组合物各成分之间协同增效作用明显，缺少任意组分，组合物效果会显著降低。