本发明涉及水产食品保鲜技术领域，具体地涉及一种虾肉生物保鲜剂及其制备方法与应用。
背景技术：
红虾，又称为中华管鞭虾，肉质鲜美，含肉率高，具有丰富的营养价值，深受国际市场的欢迎。由于虾类的水分和蛋白质含量较高，在自身内源酶及微生物的作用下，很容易发生腐败，货架期短；所含的酪氨酸或其衍生物被酪氨酸酶催化氧化成醌类化合物，醌类物质又发生非酶促氧化反应生成大分子的黑色物质,在虾的外壳沉积大量黑色素，使虾体变黑，影响感官，寻求高效的保鲜和延缓黑变的方法对促进对虾养殖业的发展具有重要的意义。
冻藏作为一种常用的虾保鲜方式，使虾肉中90％以上水分冻结，酶活性和微生物生长几乎完全受到抑制，从而使其得以长期保藏。然而，水产品在冻藏过程中会出现干耗、蛋白变性、脂肪氧化等现象。镀冰衣作为一种有效的减少干耗，保护虾肉的贮藏手段，被广泛应用于水产品冷冻保存中。镀冰衣在冻藏期间能有效减缓质构的劣变，但随着贮藏时间的延长，简单镀冰衣虾肉通常出现颜色发黄，蛋白质氧化现象。此外，随着人们健康意识逐渐加深，开始关注保鲜剂成分残留问题，因此化学保鲜这一方法的发展受到一定的限制。生物保鲜剂凭借安全健康、水溶性好，对水产品品质影响小，能保持水产品较好的风味而更受欢迎。
目前还没有虾肉生物保鲜剂及其应用的报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种虾肉生物保鲜剂。
本发明的另一目的在于提供上述虾肉生物保鲜剂的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述虾肉生物保鲜剂的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种虾肉生物保鲜剂，通过以下方法步骤制备得到：
(1)清洁的红虾头打成浆，加入水，加热处理；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解；
(3)再加另一种复合蛋白酶进行酶解；
(4)保温后冷却至室温，离心，收集上清液即得。
所述红虾为中华管鞭虾。
步骤(1)中水的加入量为红虾头重量的2.5-3.5倍；加热条件为100-121℃，180-240min。
步骤(2)中，复合蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，二者的质量比为1:1-2；复合蛋白酶的加入量为红虾头重量的0.1％-0.15％。
步骤(3)中，复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶，二者的质量比为1:1；复合蛋白酶的加入量为红虾头重量的0.1％-0.15％。
步骤(2)酶解条件为50-60℃，1-2h；
步骤(3)酶解条件为55-65℃，1-2h。
步骤(4)保温是指在95-98℃下保温10-20min，冷却至室温；步骤(4)的离心条件为3000-4000g，离心5-10min。
本发明提供了一种虾肉生物保鲜剂的方法，包括以下步骤：
(1)清洁的红虾头打成浆，加入水，加热处理；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解；
(3)再加另一种复合蛋白酶进行酶解；
(4)保温后冷却至室温，离心，收集上清液即得。
上述方法中，步骤(1)中水的加入量为红虾头重量的2.5-3.5倍；加热条件为100-121℃，180-240min。
上述方法的步骤(2)中，复合蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，二者的质量比为1:1-2；复合蛋白酶的加入量为红虾头重量的0.1％-0.15％。
上述方法的步骤(3)中，复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶，二者的质量比为1:1；复合蛋白酶的加入量为红虾头重量的0.1％-0.15％。
其中，步骤(2)酶解条件为50-60℃，1-2h；
步骤(3)酶解条件为55-65℃，1-2h。
步骤(4)保温是指在95-98℃下保温10-20min，冷却至室温；步骤(4)的离心条件为3000-4000g，离心5-10min。
本发明提供了上述虾肉生物保鲜剂在红虾肉冻藏保鲜中的应用。
具体地应用是将去头去壳的虾肉-40℃冷冻1-2h后，浸入0℃虾肉生物保鲜剂中10-15s，得到冰衣含量为10％-18％的镀冰衣的虾肉，真空包装后，-18℃～-23℃冷冻保藏。
优选地，得到镀冰衣的虾肉后，装入聚乙烯封口袋中真空包装，再置于-18℃～-23℃温度下冷冻保藏。
本发明在查阅了国内外虾肉镀冰衣保鲜的研究基础上，结合虾头的特点，利用红虾加工的副产物虾头为原料，应用生物酶解技术制备了具有抗氧化和抗冻功能的虾头酶解产物蛋白肽，将虾头酶解产物作为一种生物保鲜剂应用于镀冰衣的虾肉中，虾肉冻藏18个月后，产品品质保持较好的水平，感官评价保持新鲜虾肉的85％以上，显著优于纯水镀冰衣的虾肉。
本发明的优点在于:
(1)虾头打浆加热处理后，利用蛋白酶直接酶解，蛋白酶的总使用量只有虾头重量的0.2-0.3％，降低了成本。
(2)酶解过程没有添加如何化学物质，开发的产品安全，无化学残留。
(3)虾肉生物保鲜剂制备方法简单，易操作，酶解过程中无需调节ph。
(4)制得的虾肉生物保鲜剂为100％虾头蛋白肽，蛋白肽中分子量为1000-2000的肽的比例为75％以上，具有较好的抗氧化、抗冻功能。
(5)本发明的虾肉生物保鲜剂用于红虾肉的贮藏保鲜，具有显著的保鲜效果，产品贮藏18个月后，产品感官品质保持在85％以上。
(6)本发明开发的蛋白肽液，能广泛作为食品保鲜剂。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。实施例所述的红虾为中华管鞭虾。
实施例1虾肉生物保鲜剂的制备与应用(1)
(1)选用冷冻红虾头100克，在10℃条件下进行解冻清洗，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗虾头，虾头清洗后用打浆机将虾头打成浆，加入虾头重量2.5倍的水在121℃的条件下煮制180分钟。
(2)按照虾头重量0.2％的重量百分比比例向步骤(1)中的煮制液加入复合蛋白酶进行分步酶解：
第一步利用0.1％的蛋白酶(碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：1)，在55℃的条件下进行酶解反应1.5h；
然后进行第二步利用0.1％复合蛋白酶(中性蛋白酶和风味蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：1)，在60℃条件下进行酶解反应2.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，在4000g条件下离心5分钟，收集上清液；
(3)将新鲜红虾去头、去壳的红虾肉经过-40℃冷冻2小时，步骤(2)得到的上清液冷却到0℃，将冷冻的红虾肉浸没于步骤(2)得到的0℃虾头酶解上清液中12s，冰衣含量控制在14％。
(4)将镀虾头酶解液冰衣的虾肉装入聚乙烯封口袋中，真空包装，置于-18至-23℃冷库中冻藏，冷冻18个月。
实施例2虾肉生物保鲜剂的制备与应用(2)
(1)选用冷冻红虾头500克，在6℃条件下进行解冻清洗，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗虾头,虾头清洗后用打浆机将虾头打成浆，加入虾头重量3.0倍的水在115℃的条件下煮制200分钟。
(2)按照虾头重量0.25％的重量百分比比例向(1)中加入复合蛋白酶进行分步酶解：
第一步利用0.15％的蛋白酶(碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：2)，在60℃的条件下进行酶解反应1.0h；
然后进行第二步利用0.1％复合蛋白酶(中性蛋白酶和风味蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：1)，在55℃条件下进行酶解反应2.0h；在98℃下保温10分钟，冷却至室温，在3500g条件下离心8分钟，收集上清液；
(3)将新鲜去头、去壳的红虾肉经过-40℃冷冻1.5小时，步骤(2)得到的上清液冷却到0℃，将冷冻的红虾肉浸没于步骤(2)0℃的液体中13s，冰衣含量为15％。
(4)镀虾头酶解液冰衣的虾肉装入聚乙烯封口袋中，真空包装，置于-18至-23℃冷库中冻藏，冷冻18个月。
实施例3虾肉生物保鲜剂的制备与应用(3)
(1)选用冷冻红虾头1000克，在10℃条件下进行解冻清洗，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗虾头,虾头清洗后用打浆机将虾头打成浆，加入虾头重量3.5倍的水在121℃的条件下煮制180分钟。
(2)按照虾头重量0.3％的重量百分比比例向(1)中加入复合蛋白酶进行分步酶解：
第一步利用0.15％的蛋白酶(碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：2)，在60℃的条件下进行酶解反应1.0h；
然后进行第二步利用0.15％复合蛋白酶(中性蛋白酶和风味蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.0h；在98℃下保温10分钟，冷却至室温，在3200g条件下离心10分钟，收集上清液；
(3)将新鲜红虾去头、去壳的红虾肉经过-40℃冷冻2小时，步骤(2)得到的上清液冷却到0℃，将冷冻的红虾肉浸没于步骤(2)0℃的液体中14s，冰衣含量控制在16％。
(4)镀虾头酶解液冰衣的虾肉装入聚乙烯封口袋中，真空包装，置于-18至-23℃冷库中冻藏，冷冻18个月。
实施例4红虾肉品质的测定试验
1、蒸煮损失率的测定
将虾肉解冻称重后装入保鲜袋中，排出空气并封口，于85℃水浴锅中煮15min后取出，室温冷却10min，用滤纸擦干后再次称重，计算蒸煮损失率。
蒸煮损失率(％)＝(蒸煮前虾肉重-蒸煮后虾肉重)/蒸煮前虾肉重×100
2、二硫键含量的测定:取0.5ml4mg/ml蛋白溶液加到4.5ml缓冲液a(8mol/l尿素，3mmol/ledta，l％sds，0.1mol/lna2so3，0.2mol/ltris-hc1)中，充分混匀，取4ml混合液，加入0.5ml缓冲液b(c)，于40℃下温育25min，412nm下测定其吸光度。空白组用ph为7，0.6mol/lnacl代替样品。
二硫键含量的高低表示蛋白质的氧化程度，蛋白质氧化程度越高，二硫键含量越高。二硫键含量计算公式为:二硫键含量＝a×d/(c×b)
其中a表示样品吸光值-空白吸光值，b表示待测液蛋白浓度(mg/ml)，c表示摩尔吸光系数，其值为13600mol-1·cm-1·l，d为稀释倍数。
3、蛋白质羰基含量的测定：取1ml浓度为2mg/ml的蛋白溶液放入离心管，每管中加入1ml10mm2,4-二硝基苯肼(dnph)(溶剂为2mol/l盐酸)，室温下反应1h暗室(每15min旋涡振荡一次)后，添加1ml20％三氯乙酸，14000g离心5min，弃清液，用1ml乙酸乙酯:乙醇(1:1)清洗沉淀3次除去未反应的试剂，加3ml6m盐酸胍(溶剂为2mol/l盐酸)溶液后置于37℃条件下水浴保温15min溶解沉淀，再将反应液14000g离心3min除去不溶物质，所得上清液在370nm处测吸光值。
蛋白质羰基含量的高低与蛋白质氧化有关，蛋白质氧化程度越高，羰基键含量越高。
羰基含量计算公式为:羰基含量(nmol/mg蛋白)＝(od370nm-空白)/(22000×浓度(mg/ml))×125×105
4、参照sc/t3032-2007标准水产品中挥发性盐基氮(挥发性盐基氮是表示虾肉的新鲜程度，挥发性盐基氮越高表示虾越不新鲜)的方法，采用半微量蒸馏法测定挥发性盐基氮。称取5.00g绞碎的虾肉置于100ml的烧杯中，加入100ml蒸馏水，搅拌30min后用中速滤纸过滤，收集滤液。取5ml滤液与5ml10g/l氧化镁混悬液在消化管中迅速混合，以盛有10ml20g/l硼酸及5-6滴甲基红-次甲基蓝混合指示剂的锥形瓶作为接受器，利用凯氏定氮仪蒸馏5min。用0.010mol/l的盐酸标准溶液滴定吸收液，以蓝紫色作为滴定终点。同时，以等量蒸馏水替代滤液进行空白试验。
5、参照fan等(foodchemistry,2008,108(1):148–153.)的方法测定k值(k值与虾的新鲜度有密切的关系，虾越小表示虾越新鲜)。取1.00g绞碎的虾肉置于研钵中，加入2ml10％冷高氯酸研磨，在6000rpm的条件下离心5min，上清液留存待用，残渣用2ml5％冷高氯酸洗涤并离心两次，合并三次上清液。用10mol/lnaoh溶液、1mol/lnaoh溶液及5％的高氯酸溶液调节上清液ph值至6.40±0.05，6000rpm离心5min，残渣用ph6.4的高氯酸洗涤，合并上清液并定容至10ml。样液经0.22μm的水系滤膜过滤后，利用高效液相色谱仪测定，所用色谱柱为cosmosil5c18-paq(4.6×250mm)，流动相为ph6.8的磷酸盐缓冲液，检测波长为254nm，进样量为50μl，流速为1ml/min。根据标准曲线及峰面积计算atp关联物的浓度。k值的计算公式如下：
6、感官评价的测定
实施例1-3每个处理任意选5只镀冰虾共15只，解冻。由受专门培训的感官评定小组(9人)根据表1对虾肉感官品质综合评分，最后取平均值。以五项指标成绩加和作为最终感官评价结果，30表示绝对新鲜，15表示已发生较明显的品质劣变。
表1感官评价表
表2不同处理虾肉在-18至-23℃冻藏18个月后主要品质指标比较
注，表2中镀茶多酚液冰衣的虾肉、镀纯水冰衣的虾肉的镀制方法均同实施例2，不同之处在于所镀液体分别为2％茶多酚液、纯水。
上述结果说明，本发明实施例1-3制得的虾肉生物保鲜剂及利用其进行镀冰衣的虾肉经过18个月冻藏后，其感官评价达到25.5分，虾的感官品质保持在85％以上，蒸煮损失率低于10％，二硫键含量小于3.5mol/105g，羰基含量小于1.6nmol/mg蛋白，显著优于纯水冰衣组和不镀冰衣组，也优于镀2％茶多酚液冰衣组。可见本发明开发的虾头生物保鲜剂能够显著延长虾肉的保存期，并在抗氧化方面效果显著。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。