专利名称：一种抗寄生虫新抗生素及其盐类的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种能从微生物培养物中提取抗寄生虫的新抗生物质戒台霉素(JEITACINS)及其盐类的制造方法。该抗生素及其可作药用的盐类的化学结构式为
式中R＝异丙基或异丁基已经知道，作为抗寄生虫的药物，在抗生素中，有奥佛麦菌素(AVERMECTIN)、巴龙霉素(PAROMOMYCIN)，在合成药中，有左旋咪唑(LEVAMISOLE)、氯硝柳胺(NICLOSAMIDE)等。这些药物作为医药品和动物药被用于治疗线虫病、丝虫病等，其效果是肯定的。但是，已知的抗寄生虫药物具有毒性、副作用或耐药性等问题。
本发明的目的，是要寻找毒副作用更小的抗寄生虫药物，以期提供有抗寄生虫活性的物质，解决人和动物治疗中的需求。
本发明的要点，是以探索新的生物活性物质为目标，从不同土壤样品中分离菌种，并对其产物进行研究。结果发现了KP-197菌株，在其培养物中含有抑制寄生虫运动活性的物质。从该菌株的培养物中分离和精制出两个抑制寄生虫运动活性的纯物质。研究了这两个物质的理化特性，测定了其化学结构。具有这种化学结构的物质，尚未见到报道。这些物质统称为戒台霉素(JEITACINS)。结构式中R为异丙基的化合物叫戒台霉素A(JEITACINSA)，R为异丁基的化合物叫戒台霉素B(JEITACINSB)。戒台霉素A和戒台霉素B的理化性质如下戒台霉素A(1)白色粉末(2)元素分析C18H34N2O2计算值C69.57;H11.04;N9.02%实验值C70.40;H11.09;N7.68%(3)分子量及分子式戒台霉素A的质谱，在m/z311处有(M+H)+的分子离子峰;在高分辨率质谱分析中，在m/z293处有(M-OH)+的离子峰。由此确定，其分子式C18H34N2O2，分子量是310。
(4)紫外吸收光谱如图1所示，在228mm处有一个特征性的吸收峰;在250nm处出现一个肩峰。
(5)红外吸收光谱用KBr溶剂法测定，如图2所示，其主要吸收极大波数如下2950、2870、1705、1475、1415、1380、1270、1090、960(cm-1)。
(6)核磁共振谱使用瓦利安XL-400，400MH核磁共振仪，在重氯仿中测定的1H核磁共振谱如图3所示。
(7)呈色反应对甲氧基苯甲醛-硫酸阳性高锰酸钾阳性硫酸阴性德拉根道夫试验阴性(8)溶解性溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿、己烷、二甲基亚砜。不溶于甲醇、水。
(9)化学结构上述技术领域阐明的结构式中，R为异丙基的结构式，是根据(1)-(9)所列理化性质与已知类似化合物进行比较得到的，它是14-甲基-1-乙烯偶氮氧15-烷-8酮。
戒台霉素B(1)无色油状物(2)分子式，在高分辨质谱分析中，于m/z307处有(M-N)离子峰，由此确定起其分子式为C19H26N2O2，分子量为324。
(3)紫外吸收光谱同戒台霉素A(4)红外吸收光谱同戒台霉素A(5)呈色反应同戒台霉素A(6)溶解性
同戒台霉素A(7)化学结构戒台霉素B是戒台霉素A的类似物，两者在烷基侧链上的炭原子数不同。
上述技术领域阐明的结构式中，R是异丁基的结构式，是根据(1)-(7)所列理化性质与已知化合物进行比较得到的结果，它是15-甲基-1-乙烯偶氮氧基16烷-8酮。
能产生戒台霉素的微生物属于链霉菌属，例如在本发明中分离到的链霉菌属的KP-197菌株，是在本发明中使用的最有效菌株之一。该菌株的分类学特性如下(1)在各种培养基上的营养菌丝发达，未观察到菌丝断裂。在淀粉无机盐培养基上，气生菌丝很稀少，白色，显微镜观察发现，孢子丝是直线状，孢子链由20个以上孢子组成，孢子大小为0.7-1.0×0.7μm，圆柱形，孢子表面光滑，未发现菌核，孢子囊以及游动孢子。
(2)在各种培养基上的特征用塞戈瓦(E.B.SHIRLING和D.G.GOTTLIEB-国际系统细菌学杂志16卷313页，1966年)法研究该产生菌的培养特征，结果如表所示(见第3页表)(3)生理特性黑色素形成阳性酪氨酸琼脂阳性蛋白胨酵母膏铁琼脂阳性葡萄糖蛋白胨明胶培养基(21-23℃)阳性胰蛋白胨酵母膏液体培养基阳性酪氨酸酶反应阳性硫化氢的产生阴性硝酸盐还原阳性明胶液化(葡萄糖、蛋白胨、明胶培养基)(21-23℃)阳性淀粉水解阳性牛奶凝固(37℃)阴性牛奶胨化(37℃)阳性生卡温度范围15-38℃炭源利用(采用普戈瓦PRIDHOM-GOTTLIEB琼脂作为基础培养基)
利用D-葡萄糖，D-果糖、甘露糖稍利用D-甘露醇，(-阿拉伯糖，D-木糖、蔗糖，不利用L-鼠李糖，I-肌醇、棉子糖、密二糖、水杨酸。
纤维素分解阴性(4)细胞壁组成细胞壁的二氨基庚二酸(DAP)是LL-DAP。
综上所述，该菌株的分类学特征可以归纳如下细胞壁的二氨基庚二酸是LL-DAP，孢子丝的形状是直线形，孢子链，孢子表面光滑，营养菌丝为米色，气生菌丝为白色，形成黑色素。由此可以确定，该菌株属链霉菌属(STREPTOMYCES)的一种。根据普柴氏分类法(PRIDHAMANDTRESNER)(伯述瓦细菌分类手册第八版748-829页，1974年)，确认该产生的菌株属于白色系列的一种。
在本发明中，作为在培养基中的微生物的例子，首先使用了能产生戒台霉素的属于链霉菌属的微生物。然而，只要能产生戒台霉素的该菌株的变株，在本发明中亦可使用。
作为培养基，可以使用合成培养基或天然培养基。这些培养基通常含有适于培养放线菌的碳源、氮源和无机盐类以及适量必要的其它营养物质。
培养基中的碳源可以使用葡萄糖、甘油、果糖、麦芽糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、淀粉及其水解物等各种碳水化合物，使用浓度通常为0.1-5%。此外还有葡萄糖酸、丙酮酸、乳酸、醋酸等有机酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸、甲醇、乙醇等醇类化合物，以及正链烷烃等非芳香族碳氢化合物或者动植物的各种油脂类均可使用。
作为氮源，可以使用铵、氯化铵、磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵等无机酸或有机酸铵盐、尿素、蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母膏、干酵母、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其水解物、大豆粉或其水解物、脱脂大豆或其水解物等含氮有机物质。还有甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸。无机盐类使用各种磷酸盐、硫酸盐、食盐等以及微量的重金属盐类。
在使用有特殊营养要求的变异株时，必须在培养基中添加能满足其营养要求的物质。这样的营养物质，在使用含有天然物质的培养基时，不须特别添加补充。
发酵培养，通常是在振动或通气搅拌等好气条件下进行。实际生产时是采用深层通气搅拌培养。培养基的pH值可以是5-8，但一般以中性pH较好。培养温度可以为20-40℃，但一般在26-32℃较好(理想温度为27℃左右)。液体培养基时间通常为3-6日，戒台霉素的效价达到最高峰时停止培养。培养基成份、培养温度、搅拌速度、通气量等培养条件，根据使用的菌株和外界条件可适当调整选定，液体培养出现泡沫时可适当选用硅酮树脂、植物油等表面活性剂消沫。
用上述方法在培养物中积累的戒台霉素，通常存在于培养液中。为了从培养滤液中提取戒台霉素，一般采用从微生物培养物中提取代谢产物的方法。这些方法可以单独或者随意结合或者反复使用。例如过滤、离心、透析、浓缩、干燥、冷冻、吸附、洗脱;对各种溶媒溶解度不同的方法(如沉淀、结晶、重结晶、转溶、逆流配布)，层析等方法。
由于戒台霉素主要产生在培养液中，因此为了分离、提取该化合物，首先从培养液中除去菌体，然后再从培养滤液中提取该物质。
为了从培养滤液中提取戒台霉素，使用非亲水性的有机溶媒如乙酸乙脂等抽提，或者用活性炭、氧化铝、多孔性高分子合成树脂、离子交换树脂等进行吸附，再用乙酸乙脂等溶媒洗脱，得到的提取液或洗脱液进行减压浓缩，再用己烷等提取。这样得到的粗提物，用通常精制脂溶性物质的方法如硅胶或氧化铝柱层析等进行精制。
该化合物可作药用的盐类如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸、琥珀酸盐等，使用常规方法可以制备。
本发明的优点和积极效果是，用上述方法制备的活性物质，其抗寄生虫幕钚员认钟幸┪锴浚涠拘匀幢认钟幸┪锏汀＞咛迨笛槭且运墒飨叱妫˙URSAPHLENCHUSLIGNICLOUS)作为治疗对象，采用木村等介绍的方法(AGRICULTUREBIOLOGICAICHEMISRY45，249，1981)测定戒台霉素抑制松树线虫的运动活性，其结果是戒台霉素A对线虫的致死率(%)0.5ug/ml100%0.25ug/ml100%0.125ug/ml99%0.063ug/ml86%戒台霉素B对线虫的致死率(%)0.5ug/ml100%
0.25ug/ml100%0.125ug/ml93%0.063ug/ml80%已知药物AVERMECTINBLA对线虫的致死率(%)5ug/ml100%2.5ug/ml100%1.25ug/ml64%0.63ug/ml58%从以上比较试验以看出，戒台霉素的抗寄生虫活性比已知药物强十倍以上，前者疗效明显优于后者。
急性毒性试验是用小鼠作为实验动物，经腹腔途径注射戒台霉素10mg/kg不致死，用相同方法观察已知药AVERMECTINBLA的急性毒形，结果小鼠死亡。可见，戒台霉素的急性低于已知抗寄生虫药物。
以上活性及毒性试验表明，本发明所得到的戒台霉素，作为人、动物和植物的抗寄生虫药是有用的。
实施例在500ml板口瓶中装入100ml培养基(培养基成份葡萄糖0.1%，马铃薯淀粉0.4%，蛋白胨0.5%，肉膏0.3%，酵母膏0.5%，碳酸钙0.4%，pH7.0)，121℃，15分钟蒸汽灭菌后，将一白金耳的KP-197的斜面培养物(其成份甘油1.0%，苹果酸钙1.0%，酵母膏0.1%，琼脂1.5%)种入上述灭菌的培养基中，在旋转摇床上27℃培养三天，将该培养作为种子。备30升的发酵罐二个，每个装入15升培养基(发酵培养基成份甘油2.0%，黄豆粉2.0%，NaCl0.3%，瓜氨酸0.01%，CoCl0.002%，pH7.0)，121℃30分钟蒸汽灭菌后，往每个发酵罐中种入6瓶上述种子，搅拌速度250r.p.m通气量15升/分，27℃120小时培养。
培养物离心(10，000r.p.m)，分离菌体和培养液，得到上清液30升，用6NHCl将上述清液的pH值调至3.0，再离心，得到沉淀物，往沉淀物中加入15升50%丙酮溶液，搅拌，提取，过滤，得到提取液，将其减压浓缩至6升，加入3升乙酸乙酯，振动提取二次，得到的乙酸乙酯提取液，减压浓缩，得到油状粗提物，往粗提物中加入750ml己烷，提取两次得到己烷提取液，减压浓缩，得到粗制品4克，粗制品装入硅胶柱(马克公司制，ART7734，160克)层析，用己烷-乙酸乙酯溶液(30∶1)溶出，分份收集，各部份用松树线虫进行生物检定，活性部份合并，减压浓缩，得到粗制品30毫克，溶于少量氯仿中，每次取1/20的量进样，用反向分离柱(山村化学研究所制，AM324(ODS，10×300mm)进行高压液相层析，用60%乙腈水洗出，流速每分钟2毫升，收集显示保留时间18.5分与19.6分的各峰的活性部份，减压浓缩干燥，分别得到戒台霉素A7.2毫克和戒台霉素B5毫克。
图1，戒台霉素A的紫外吸收光谱(在环己烷中测定)图2，戒台霉素A的红外吸收光谱(在KBr溶液中测定)图3，戒台霉素A的质子的核磁共振谱(在重氯仿中测定)
权利要求
1.一种能从微生物培养物中提取抗寄生虫的新抗生物质戒台霉素及其盐类的制造方法，其特征在于它是由从链霉菌属的KP-197菌株中，用非亲水性的有机溶媒提取制备的。
2.按权利要求1所述的制造方法，其特征是所说的KP-197菌株，其细胞壁的二氨基庚二酸是LL-DAP，孢子丝的形状呈直线形，孢子链长，孢子表面光滑，营养菌丝为米色，气生菌丝为白色，能形成黑色素。
3.按权利要求2所述的制造方法，其特征是所说的KP-197菌株，可在合成培养基或天然培养基中培养。这些培养基通常含有适于培养放线菌的碳源、氮源和无机盐类的以及适量必要的其它营养物质。发酵培养，通常是在振动或通气搅拌等好气条件下进行，深层通气搅拌培养的温度为20-40℃，PH值5-8，培养时间为3-6日。
4.按权利要求1所述的制造方法，其特征是为从培养滤液中提取戒台霉素，使用非亲水性的有机溶媒乙酸乙酯抽提，或者用活性碳、氧化铝、多孔性高分子合成树脂、离子交换树脂进行吸附，再用乙酸乙酯溶媒洗脱，将得到的提取液或洗脱液进行减压浓缩，再用乙烷提取，这样得到的精提物，用通常精制酯溶性物质的方法如硅胶或氧化铝柱层析进行精制。
5.按权利要求1和4所述的制造方法，其特征是该化合物可作药用的盐类精盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐等，使用常规方法可以制备。
6.按权利要求4所述的制造方法，其特征是用此方提取制备的戒台霉素A的分子式为C18H34N2O2，分子量为310，戒台霉素B的分子式为C19H34N2O2，分子量为324。
7.按权利要求4所述的制造方法，其特征是用此方法制备的化合物，以松鼠线虫作为治疗对象，用已知药物AVERMECTIN BLA进行对照试验，结果表明，戒台霉素的抗寄生虫活性比对照组强十倍以上，而其毒性却比对照组低，因此，本发明所得到的戒台霉素，作为人、动物和植物的抗寄生虫药物是有用的。
全文摘要
一种抗寄生虫新抗生素及其盐类的制造方法，其特点是，从KP-197菌株培养物中，用溶媒法分离，提取和精制出具有抗寄生虫活性的两种物质。该特质的抗寄生虫活性明显高于已知药物，而其毒性却低于已知药物，故可成为治疗人、动物和植物寄生虫的有效药物。
文档编号C12P1/04GK1034580SQ8810018
公开日1989年8月9日 申请日期1988年1月27日 优先权日1988年1月27日
发明者苏学惠, 大村智, 田中晴雄, 乙黑一彦, 姚恩泰 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所, 北里研究所