专利名称：D异维生素c钠的新发酵法的制作方法
技术领域：
本发明涉及D异维生素C钠(D异Vc钠)的发酵法，特别涉及直接采用大米粉、玉米粉、木薯粉及其他薯粉等制备D异Vc钠的新发酵法。
在已公开的技术(例如CW-85103026A)中，制备D异Vc钠的方法存在下列不足之处(1)原料选用葡萄糖或其母液，且发酵培养基中需加玉米浆，因而原料价格昂贵，来源狭窄;
(2)发酵时间较长，一般在36-64小时;
(3)葡萄糖转化为2-酮基葡萄糖酸钙的转化率不超过96.4%;
本发明的目的是提供一种省时、高效、廉价的制备方法，解决了D异Vc钠工业化生产问题，便于大规模工业化生产。
本发明是通过下列步骤来实现的1、培养基的配制(均以重量计)(1)斜面培养基其重量比是蛋白胨∶牛肉膏∶NaCl∶琼脂为10.3∶0.5∶(2-2.5)。PH值为7.0-7.5配制成试管斜面和茄子瓶斜面。
(2)液体培养基其重量比是蛋白胨∶牛肉膏∶NaCl∶H2O＝1∶0.3∶0.5∶(3-10)。制成PH值为7.0-7.5的液体培养基。
(3)种子培养基蛋白胨1%、酵母膏0.3%、葡萄糖1%(也可以用糖液)MgSO40.3%，泡敌(消泡剂)0.01%，余为自来水，在500升种子罐中配制成约350升种子培养基PH值为7.0-7.5。
(4)发酵培养基称取1000kg大米粉(或玉米粉、薯粉)，加水2500升左右于糖化罐中调浆，再加入CaCl2约2Kg调PH值为6.5-6.7加淀粉酶约3kg(比活4000单位)，升温以90℃约20-30分钟待液化完全后，降温至于65℃，重新调PH值为4.0-4.5，加入糖化酶3-4Kg(比活45000单位)，60℃保温20小时，糖化完全后，再升温至此100℃维持10分钟，过滤得到浅黄滤液，用自来水洗滤渣，洗渣水加入发酵罐以配培养基，糖液入糖液灭菌罐灭菌备用;在5000升发酵罐中加入MgSO4约1Kg，KH2PO4和K2HPO4各约2Kg。泡敌约500毫升，蛋白胨约4Kg，CaCO3约175Kg，加水适量调PH值至9后灭菌，再将灭菌后的糖液移入该发酵罐，使最后的总体积为3500-4000升。
2、发酵将保存的菌种萤光假单胞菌移接到试管斜面培养基上，30℃培养24小时后，移接到茄子瓶斜面培养基中，30℃培养24小时后，再移接到克氏瓶液体培养基中30℃培养24小时后;在无菌条件下将5瓶液体菌种液合并到接种瓶中，接入装有350升种子培养基的500升种子培养罐中，罐温30℃，通入净化无菌空气，通气量1∶1，搅拌速度250-300转/分继续扩大培养18-24小时，即可移种到发酵罐中。
种子液移入发酵罐和发酵培养基一起，在罐温35℃，通净化无菌空气，通气量为1∶1，搅拌速度为150转/分，发酵34小时，将罐温升至70℃-80℃，再用板框压滤机过滤，滤液浓缩到1/3时，放入结晶罐，冷却结晶，离心分离出2-酮基葡萄糖酸钙。
3、甲酯化反应在2000升搪瓷玻璃反应罐中，加入甲醇约1000升加上述2-酮基葡萄糖酸钙约500Kg，搅拌20分钟，加HNO3约150Kg，45℃-50℃反应4-5小时，然后降至此10℃-20℃，滤出2-酮基葡萄糖酸甲酯，并用甲醇冲洗。
取100Kg甲酯，加800-1000升甲醇使之溶解，再加入含有20KgNaOH的甲醇溶液200升在65℃-70℃反映15分钟，降温到20℃滤出D-异Vc钠粗品，再将粗品用蒸馏水溶解，经活性碳脱色，结晶滤出，用乙醇冲洗，经干燥即得到D异Vc钠的精品。
下面的实施例对本发明作详细说明，但不限制本发明的范围例一1、培养基的配制(1)斜面培养基蛋白胨1公斤、牛肉膏0.3公斤、NaCl0.5公斤、琼脂2.3公斤配成PH为7.3的试管斜面和茄子瓶斜面。
(2)液体培养基蛋白胨1公斤、牛肉膏0.3公斤、NaCl0.5公斤，用自来水配制成PH为7.2的液体培养基。
(3)种子培养基蛋白胨3.5公斤、酵母膏1公斤、葡萄糖3.5公斤、MgSO41公斤、泡敌(消泡剂)0.035公斤，用自来水在500升的种子罐中配制成PH为7.4的体积为350升的种子培养基。
(4)发酵培养基称取1000Kg大米粉，加水2500升，于糖化罐中调浆，加CaCl22Kg调PH值至6.6，加淀粉酶3Kg(比活4000单位)，升温到90℃约25分钟，待液化完全后，降温至65℃重新调PH值至4.3，加入糖化酶3.5Kg(比活45000单位)，60℃保温20小时，糖化完全(折纯糖821.5公斤)后，再升温至100℃维持10分钟，过滤，得浅黄色滤液，用自来水洗滤渣，洗渣水加入发酵罐以配培养基，糖液入糖液灭菌罐，灭菌备用。在5000升发酵罐中加入MgSO4lKg，KH2PO4和K2HPO4各2Kg，泡敌500毫升，蛋白胨4Kg，CaCO3175公斤，加水适量，调PH值为9后灭菌，再将灭菌后的糖液移入该发酵罐，使最后的总体为3800升。
2、发酵将保存的萤光假单胞菌移接到斜面培养基上，在30℃下培养24小时;后接入茄子瓶斜面培养基中，在30℃培养24小时;再移入克氏瓶液体培养基中，在30℃下培养24小时;在无菌条件下，将液体菌种液接入装有350升种子培养基的罐中，在罐温30℃，通纯净无菌空气量1∶1，搅拌速度280转/分的条件下，培养20小时，然后移入发酵罐;在罐温35℃，通纯净无菌空量1∶1，搅拌速度150转/分的条件下，与发酵基一起发酵30小时，发酵液中2-酮基葡萄糖酸钙含量达813.3公斤，发酵转化率为99%;将罐温升至75℃，用板框压滤机过滤，待滤液浓缩到原体积的1/3时，放入结晶罐，冷却结晶，离心分离出2-酮基葡萄糖酸钙，干燥后得到675Kg2-酮基葡萄糖酸钙结晶，提取收率为83%。
3、甲酯化反应在2000升搪瓷玻璃反应罐中，加入甲醇1350升，再加入上述2-酮基葡萄糖酸钙675Kg，搅拌20分钟，再加入HNO3200Kg，在50℃条件下反应4.5小时，降至室温滤出2-酮基葡萄糖酸甲酯，用甲醇洗甲酯得到2-酮基葡萄糖酸甲酯519.8公斤，甲酯化收率达77%;然后加入5198升甲醇使之溶解，再加入含27公斤NaOH的甲醇溶液675升，在65℃温度下，反应15分钟，降温至20℃，滤出D异Vc钠粗品，再用蒸馏水溶解，经活性碳脱色、过滤，滤出结晶，用乙醇清洗、干燥，得D异Vc钠精品483.4公斤，其转化收率为93%;D异Vc钠精品的纯度为92%。
例二除以玉米粉1000公斤代替例一中的大米粉1000公斤外，其余条件与例一同，得到2-酮基葡萄糖酸钙625公斤，然后进行甲酯化得到2-酮基葡萄糖酸甲酯478.8公斤，再经转化制得D异Vc钠成品438.1公斤;D异Vc钠精品的纯度为92%。
例三除以木薯粉1000公斤代替例一中的大米粉1000公斤外，其余条件与例一同，得到2-酮基葡萄糖酸钙585公斤，然后进行甲酯化得到2-酮基葡萄糖酸甲酯450公斤，再经转化制得D异Vc钠成品410公斤;D异Vc钠精品的纯度为92%。
本发明的优点如下(1)本发明所选用的萤光假单胞菌能利用各种碳源;
(2)本发明所采用原料为大米粉、玉米粉、木薯粉及其他薯粉直接水解产物，原料来源宽广，成本降低;
(3)发酵培养基中不需加入玉米浆降低了成本简化了生产工艺;
(4)发酵稳定，发酵时间缩短到24-34小时，提高了生产效率;
(5)葡萄糖发酵转化成2-酮基葡萄糖酸钙的转化率几乎可以达到100%，生成物单一，提取工艺简化，减少烯醇化甲醇的用量。
权利要求
1.一种制备D异维生素C钠的新发酵法，其特征在于(1)采用大米粉、玉米粉、薯粉为原料。(2)培养基的配制(A)斜面培养基的组份蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂。(B)液体培养基的组份蛋白胨、牛肉膏，NaCl。(C)种子培养基组份蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、MgSO4、KH2PO4。(C)发酵培养基的组份大米粉或玉米粉或木薯粉水解产物、MgSO4、KH2PO4、CaCO3、蛋白胨、K2HFO4。(3)发酵将菌种萤光假单胞菌移入斜面培养基，再移入液体培养基、种子培养基和发酵培养基发酵。(4)甲酯化及烯醇化反应加入甲醇、强酸HNO3和NaOH。
全文摘要
D异维生素C钠的新发酵法在于利用大米粉(或玉米粉、木薯粉及其他薯粉)的水解产物，以及由CaCO
文档编号C12P7/58GK1072457SQ9211273
公开日1993年5月26日 申请日期1992年11月10日 优先权日1992年11月10日
发明者许鸿发, 胥世荣, 张来祥, 姚怀坤, 李萍 申请人:安徽省生物研究所