专利名称：对锥虫物种的免疫的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因和相应的基因产物(DNA、RNA和蛋白质)，将其用于胞内感染病原体的特异性疫苗和诊断，特别是寄生虫感染，更特别的是锥虫感染，特别是利什曼原虫属物种的感染，更加特别的是诱导皮损伤的利什曼原虫属，更加特别的是Leishmania major。
利什曼原虫是锥虫家族的一个成员，它在美国、非洲和印度次大陆的热带地区以及西南亚的亚热带和地中海地区是地方性流行病。由白蛉传播的原虫利什曼原虫属的不同物种的感染作为自体愈合皮损伤、神经以及心脏失调或者致命的内脏感染出现。由利什曼原虫属造成的疾病一般称作利什曼病。
一些疾病形式是人类的(仅仅在人类之间传播)，而其它的是人畜互传的(包括人贮存器)。已知的利什曼原虫属物种超过20种，其中12种与利什曼病的各种形式相关。
以临床模式为基础，可以将利什曼病分成三类。皮肤利什曼病是最流行的，它引起皮肤溃疡，并且可能超过一年才能治愈。粘膜皮肤利什曼病最初造成类似的损伤，它可以治愈，但是它可能再出现而引起恶性组织破坏，主要是鼻子和口。最后，内脏利什曼病是一种十分严重的系统性疾病，如果未作治疗的话，它几乎总是致命的。
自从1980年中期以来，已经报道，由于在利什曼病的传统地方性流行区域HIV流行的传播机会性利什曼原虫属感染的数量发生了显著的增加。当前世界广泛流行的利什曼病患者有12000万(参见评论Liew和O′Donnell,1993)并且350000万居住在危险区。这种疾病的新患者数量每年1500万中有500000是内脏利什曼病。
内脏利什曼病造成大规模流行病，并且患者的数量在年与年之间的变化很大。在1991年期间，印度和苏丹发生大流行病。仅仅印度患者的数量可能就已经达到250000。在1991年，据估计可能有75000人死于内脏利什曼病。
皮肤利什曼病的影响不太显著，但是它造成的病痛在地方性流行区域中更严重，这是由于与容貌的毁损相联系的社会和心理上的创伤。对地方性流行区域的人们关注的这一重要性反映在利什曼化的老做法中，这牵涉到以利什曼原虫属故意的和冒风险的感染，以便以在身体较少的暴露部分上溃疡与损伤的代价换取诱导终生免疫。
在它们的生活史期间，利什曼原虫属生长在多样化的环境条件中，并且通过明显的发育阶段来区分(参见评论Wilson 1990,Smith等，1994)。在白蛉载体中，它们长成修长的，有鞭毛传染性的前鞭毛体。当白蛉吸血时，它将寄生虫传播到人宿主中，其中它们被皮肤上的巨噬细胞所吞噬。在巨噬细胞溶酶体内，所说的寄生虫分化成圆形的不具鞭毛的无鞭毛体，其中它们进行复制，直到巨噬细胞裂解为止。然后它们释放出来去感染其它巨噬细胞，或者由白蛉接纳，其中它们分化返回到前鞭毛体时期以重复它们的生活史。
利用利什曼原虫属通过天然或故意的感染实现的终生保护表明，对这种疾病的大量接种是切实可行的。在人临床试验中利用整个杀死的寄生虫在对皮肤利什曼病进行接种中已经取得了进展。然而，问题出现了，例如曾在免疫性感染的宿主应答中试剂或变体是非实用性的。此外，用热杀死的、无毒性的或者放射性减毒的前鞭毛体的皮下接种经常是无效的或者不好的，甚至会使损伤恶化。因此，为了避免通过接种恶化天然获得性感染的风险，十分重要的是开发第二代疫苗，例如利用免疫纯化的抗原或者衍生物。
利用Leishmania major的感染，然后在不同近交小鼠品系中模仿人利什曼病的临床症状。大多数品系(例如CBA,C57BL/6)对感染具有相对的抗性，在寄生虫接种位点上出现很小的损伤，它在几周内将自体愈合。相对地，诸如BALB/c小鼠之类的敏感品系表现出没有消退趋势的严重的皮损伤，并且最后发展成致命的感染的内脏化。在实验鼠利什曼病中，一般认为，CD4+T细胞是对Leishmania major感染的抗性起作用的，虽然CD8+淋巴细胞也显示出在对这种寄生虫的免疫性中起着重要的作用(Müller等，1989,Hill等，1989)。动物模型研究已经产生两个所定义的CD4+T淋巴细胞子集(Th1和Th2)，它们可以部分地确定Leishmania major感染的结果。Th1/Th2平衡的重要性和细胞因子网络的详尽讨论在最近的评论中已经报道(Liew和O′Donnell,1993；Milon等，1995)。简言之，Th1应答与细胞因子IL-2与γ-IFN的产生、寄生虫杀死、治愈和保护联系在一起，而Th2应答与IL-4和/或IL-10的产生、疾病进展以及易感性联系在一起(Heinzel等，1991；Scott,1989)。产生淋巴因子的这种模式在人利什曼病中也观察到(Reed和Scott,1993)。最近以来，报道了在对利什曼原虫属的免疫应答中涉及IL-12。IL-12通过刺激γ-IFN的产生和IL-4的负调节产生有利于开发Th1应答(Heinzel等，1993；Sypek等，1993)。
许多利用Leishmania major前鞭毛体所衍生的抗原的研究(如表面膜gp63和脂磷酸聚糖(Russell等，1988)，可溶性抽提物(Scott等，1987)或者gp63表位(Yang等，1991))已经显示出，在敏感的BALB/c小鼠中可以获得各种水平的保护。同样地，例如将dp72和GP46/M2分别用于杜诺夫氏利什曼原虫和Leishmania amazonensis，但是仅仅观察到部分保护性(Rachamim和Jaffe,1993；McMahon-Pratt等，1993)。
在这些试验中，仅仅利用前鞭毛体衍生的抗原。在导致本发明的研究中，人们意识到，包含抗原的疫苗存在于寄生虫生活史的不同的阶段，它们可以增加保护的百分比。此外，人们发现，一些蛋白质作为肽输出到巨噬细胞表面，并且这与对胞内寄生虫的T-细胞介导的免疫应答有关。以前没有确定过这种与诱导保护免疫性相关的寄生虫抗原。这种基因产物的鉴定和表征对于理解胞内寄生以及诊断性试验方法和疫苗的设计来说是迫切的。
因此，本发明的目的是提供如同信使RNA或蛋白质一样的基因和其衍生物，其在胞内感染病原体(如寄生虫，特别是锥虫，例如利什曼原虫属物种)感染的诊断、预防以及治疗中有用。
在导致本发明的研究中，人们惊奇地发现，一般来说锥虫(特别是利什曼原虫属)的胞内蛋白质具有诱导对相应的寄生虫物种的免疫性的能力。特别是在这些寄生虫的组蛋白中发现的。
本发明基于一般的发现，即胞内抗原(如组蛋白)是设计和开发疫苗、药物和诊断性试验方法的一个好的起点，该组蛋白已经参与胞内寄生虫的T-细胞介导的免疫应答。在下文中一般通过提及锥虫(特别是利什曼原虫属物种)来说明这个原理。
因此，本发明以它的最基本的形式提供了用作抗锥虫感染的保护性抗原的实质上分离形式的锥虫组蛋白。所说的组蛋白可以从相应的寄生虫物种分离，但是优选地，它们借助于重组DNA技术产生。
对于后一种方法，本发明也提供了编码保护性组蛋白的基因。这些基因的共性是它们与下列进行杂交的能力a)图6A中所描述的序列的多核苷酸的至少区别部分；或者b)编码部分对多肽的保护能力起作用的组蛋白的图6A的序列的那些部分；或者c)a)或b)的互补链。
由以上所述得出，所说的重组体组蛋白的最基本的形式可以是由分离自寄生虫物种的基因编码的完全组蛋白。在进一步的实施方案中，可以利用仅仅部分所说的基因，一部分或更多部分，该基因编码一部分或更多部分的组蛋白，该组蛋白至少某些部分对它的保护性能力起作用。
术语“多核苷酸的至少区别部分”意指本发明基因不必一定与图6A所描述的全序列进行杂交。事实上，本发明提供一个基因家族，该基因家族的成员享有序列相似性和它们编码组蛋白的事实，特别的是组蛋白H1。这两个特征将使技术人员能够确定图6A的序列与本家族的其它成员进行杂交的程度。
确定已分离的基因是否属于本发明的家族的一个可能性是将其衍生的氨基酸序列与氨基酸数据库进行比较，如瑞士Prot数据库或EMBL数据库。这样的数据库将提供关于衍生的氨基酸序列与已知序列同源性的信息。以其为基础，技术人员可以确定他是否确实分离了组蛋白。在确定是否分离了组蛋白基因中的另外的工具是该基因产物的化学和物理表征。例如，组蛋白是核蛋白质并且结合DNA。
图6A所描述的核苷酸序列是指定为SW3的序列，并且前面已经描述过。本发明旨在包括这种基因和其衍生物以及上述的其家族成员的用途。
此外，本发明涉及该基因的衍生物，这种衍生物包含基因片段、该基因的完全或部分互补DNA、对该基因的完全或部分信使RNA、该基因编码的完全或部分的蛋白质、至少包含一种该蛋白质的免疫原性部分的肽、反义寡或多核苷酸、在至少部分该基因，互补DNA，信使RNA，蛋白质或肽与至少部分其它基因，互补DNA，信使RNA，蛋白质或肽之间的融合产物、该基因，互补DNA，信使RNA，蛋白质，肽或其融合产物的抗体、该基因，互补DNA或信使RNA的特异性引物，其中每种衍生物都可以分离或者可以通过重组DNA技术而获得。该表述将不作为本发明限制而是注释。对于本领域技术人员，上述将作为定义属于本发明范围内的衍生物的指导。这些衍生物可以通过利用公知和相当明确的分子生物技术而获得，例如Sambrook等，1989(下文)所描述的。
在本申请中，可以将“基因”、“互补DNA”、“信使RNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”以及它们的反义或者互补配对物称之为“核酸”。
“蛋白质”、“肽”或者“多肽”意指通过核酸的转录和翻译可以获得的产物，并且一般称之为“基因产物”。
通过与所说的基因进行分子杂交(对于反义多核苷酸或者RNA)、通过它们的活性、通过它们的功能、通过识别基因产物或者其部分(对于抗体)、通过作为辅助性或细胞毒性T淋巴细胞表位的免疫系统可以确定这些衍生物。
本发明进一步涉及包含产生信使RNA或基因产物的核酸的表达载体。技术人员再次能够很好地选择出合适的载体和必需的表达信号，如以他的普通知识和本申请所包含的信息为基础的转录与翻译的起始和终止序列。
按照其进一步方面，本发明提供了针对核酸的探针、针对基因产物、核酸分子或识别基因产物的氨基酸序列的多肽的抗体。基因产物是核内蛋白，由于它结合到DNA上，因而可以将它进行分离。
此外，本发明提供了用于检测感染并因而诊断利什曼原虫属感染的诊断剂，其包含所说的核酸、抗体或者所说的基因产物，以及为预防目的所说的核酸、抗体或者所说的基因产物的应用，例如作为在疫苗以及治疗中的组分。
特别是本发明涉及胞内蛋白质，特别是核酸结合蛋白质，更加特别的是核蛋白。尤其是，本发明涉及组蛋白，并且更加特别的是组蛋白H1，特别是组蛋白H1基因家族，它是通过分子杂交或者聚合酶链反应分离的，更加特别的是SW3基因的多肽。
人们发现基因产物引发一种强的免疫应答并且显示保护性能力，特别是Leishmania major的SW3基因或者其它利什曼原虫属物种的SW3类似物的产物。
在本发明中，在小鼠中通过注射由所说的基因衍生的重组蛋白引发免疫应答。当皮下注射蛋白质，并且随后用活寄生虫对动物进行攻击时获得了特异性保护。在免疫领域中，另一个实施例教导了一条核多肽序列、组蛋白H1以及它的应用。在其它利什曼原虫属物种中检测交叉杂交信使RNA。更特别的是在大肠杆菌中通过用谷胱甘肽S转移酶(GST)融合将SW3多肽作为重组蛋白进行表达。用纯化的GST-SW3多肽对小鼠进行免疫。产生的抗体识别所注射的产物。用Leishmania major感染所免疫的小鼠。观察到特异性识别并且在攻击实验中显示出多肽的保护效应。
上文在参照Leishmania major下描述了本发明。然而，本发明也旨在包括其它利什曼原虫属物种，如利什曼原虫属亚属物种，包括所说的复合的Leishmania major(仅包括Leishmania major物种)，复合的杜诺夫氏利什曼原虫(包括例如Leishmania chagasi、杜诺夫氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫)，复合的Leishmania mexicana(包括特别是Leishmaniaamazonensis和Leishmania mexicana)以及Viannia亚属物种，包括复合的巴西利什曼原虫，Leishmania peruviana和复合的Leishmaniaguyanensis，包括物种Leishmania guyanensis和Leishmaniapanamensis。
下列实施例说明本发明，不应该认为它们是对本范围的限制。实施例1．材料和方法在下列实施例中所利用的许多技术是已知的并且易为分子生物学、蛋白质化学、免疫学以及利什曼原虫属生物学领域技术人员所理解的。这样的方法并非总是详尽地加以描述。酶是市售的，并且按照供应商说明进行使用。细菌培养基和当前的克隆技术在Sambrook等(分子扩增实验室手册，CSH出版社1989)中已描述过。
1.1.寄生虫前鞭毛体的培养和无鞭毛体的分离将Leishmania major前鞭毛体(品系LV39-MHRO/SU/59/P或者MRHO/IR/75/ER)在26℃下在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；Gibco-BRL)中进行培养，在固态兔血琼脂(Louis等，1979)上补充了10％胎牛血清(Seromed)和庆大霉素(10μg/ml)。无鞭毛体是在体内产生的。用2-5×107个寄生虫/ml的稳定期前鞭毛体在后脚垫上皮下注射BALB/c小鼠。
另外，通过使寄生虫通过瑞士裸鼠的背部获得无鞭毛体。Leishmania major无鞭毛体是从背部损伤纯化的，并且按照所述的方案(Glaser等，1990)进行提取。
1.2.核分离将前鞭毛体转移到50ml Falcon试管中并且在4℃,270×g下离心5分钟。将沉淀在10ml冷1×PBS中进行重新悬浮，并且如前转移到15mlGreiner试管中再进行离心。将沉淀在2ml包含40μl的200mM氧钒核苷复合物(Berger和Birbenmeier,1979)的裂解缓冲液(140mMNaCl,1.5mM MgCl2,10mMTris-HCl(pH8.6),0.5％NP-40)中进行重新悬浮并且涡旋10秒。在4℃,6000×g下离心3分钟之后，获得与核组分相应的沉淀和2ml上清液，可以将该上清液进一步处理以抽提胞质RNA。在液氮中冰冻该核沉淀，并且将其存储于-70℃。利用一个类似的方案完成无鞭毛体核的分离。
1.3.总组蛋白和组蛋白H1的抽提组蛋白在HCl中是可溶性的，并且一种组蛋白(H1)在高氯酸中是选择性可溶的。将细胞收集，并且在1×PBS中洗涤两次，在140mM NaCl,1.5mM MgCl2,10mM Tris-HCl(pH8.6),0.5％NP-40中进行裂解。将核在6000g下沉淀3分钟(Kontron)。为了抽提总组蛋白将核在1.25N HCl中进行重新悬浮，而为了回收组蛋白H1在5％高氯酸中进行重新悬浮，涡旋30秒，并且在室温下在旋转的轮子上混合一小时。将不溶的蛋白质在7000rpm下沉淀5分钟。用8体积用冰预冷的丙酮沉淀HCl组蛋白提取物，并且用8体积冷乙醇沉淀H1高氯酸提取物。然后，将样品在10000rpm下离心15分钟，并且在分析样品缓冲液中通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行重新悬浮，通过免疫印迹法利用α415肽血清作为检测抗体确定SW3本性。α415肽血清是由下面1.4所述的415肽免疫兔所产生的血清。
1.4.抗体的产生和纯化合成从SW3互补DNA推定的并且与头二十个氨基酸相应的肽序列(NH2-MSSNSAAAAVSAATTSPQKS-COOH)(“415”)。按照固相合成的F-moc，叔-丁基策略完成肽合成，如由Merrifield(1986)和Atherion等(1988)所描述的。将该肽利用葡聚糖凝胶-G25通过凝胶过滤来进行纯化，并且通过在LDI 1700质量监测器(线型科学公司，Reno,NV)上进行质谱检测确认它的分子量，并且显示大于90％的纯度。将冻干的肽以2mg/ml溶解在1×PBS中，并且将其注射到兔中以便产生特异性抗体(由Eurogentec SA，比利时完成)。将获得的血清称为“α415肽血清”。
1.5.寄生虫蛋白质分析和免疫印迹通过离心(4℃,3000转/分钟，10分钟)收集前鞭毛体，在1×PBS中洗涤3次并且在SDS-PAGE凝胶样品缓冲液中重新悬浮(Lammli,1970)。无鞭毛体是按照一种公开的方法分离的(Glaser等，1990)，然后如所描述的前鞭毛体进行处理。如所描述过的进行蛋白质凝胶电泳。通常将来自3×107个细胞的蛋白质用15％SDS-PAGE分离，该蛋白质已经在1XLammli缓冲液中煮5分钟，并且已经将其装载到4mm宽阔的狭槽中。将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜(Immunoblots)上。如Harlow和Lane所描述的(1988)进行来自SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的免疫印迹，并且将1∶1000兔α415肽血清的稀释液添加到在室温下温育一夜的滤液中。利用山羊抗兔次级抗体和过氧物酶结合蛋白质A，并且利用化学发光反应底物(Amersham)来揭示反应多肽的存在。
1.6.SW3基因与SW3同系物的分离在聚合酶链反应中，将从LV39品系分离的总Leishmania major信使RNA的互补DNA或基因组DNA作为模板，在寡核苷酸S-SW3(5′-cccgtcgacggatgtcctctaattc-3′)和A-SW3(5′-agagtcgacctatgatgcgtcttcgggcacgt-3′)存在下，在包含20mMTris-HCl(pH8.3)、100mM KCl、3mM MgCl2、2.5mM每种dNTPs和一单位Taq聚合酶的缓冲液中进行。获得与SW3交叉杂交的不同扩增产物，并且将其亚克隆到pGemini载体(Promega Inc.)中。确定该核苷酸序列并且将推定的氨基酸序列与SW3氨基酸序列进行比较(Fasel等，1994)。
1.7.RNA分离和分析如以前描述的(Fasel等，1994)分离不同的利什曼原虫属物种的胞质RNA。将15μgRNA在0.8％琼脂糖凝胶上进行分级分离，并且将其转移到加膜的基因筛(NEN研究产物)上。通过插入到pGEM-1/2载体中的SW3互补DNA的体外转录产生放射性反义探针，该载体包含T7和Sp6RNA聚合酶启动子。如(Fasel等，1994)所描述的进行杂交和洗涤。
1.8.序列比较将氨基酸序列与Swiss Prot序列数据库进行比较，并且通过利用多序列的序列对比估计其相似性程度(http:/www2pasteur.fr/-takaia/MAcours/multalign.html)。
1.9.在大肠杆菌中SW3的表达通过聚合酶链反应从构建体pCRⅡ-SW3(Fasel等，1994)扩增开放读框SW3，利用寡核苷酸S-SW3(5′-cccgtcgacggatgtcctctaattc-3′)和A-SW3(5′-agagtcgacctatgatgcgtcttcgggcacgt-3′)，在包含20mM Tris-HCl(pH8.3)、100mM KCl、3mM MgCl2、2.5mM每种dNTPs和一单位Taq聚合酶的缓冲液中进行。黑体字符的核苷酸序列对应于SalⅠ限制酶切位点，这些限制酶切位点可以用来将PCR产物插入表达载体的SalⅠ位点。利用下列循环完成扩增98℃下1分钟，60℃下3分钟，72℃下2分钟，接着98℃下8分钟，60℃下1.5分钟，72℃下2分钟进行33个循环。与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的读框同时协调地将该片段插入到载体pGEX-KG的SalⅠ位点(Guan和Dixon,1991)上。通过电穿孔法转化大肠杆菌(DH5α)，并且通过HaeⅢ限制性酶确定插入子的取向，按照插入子的取向，这种酶将产生不同长度的片段。通过双链DNA测序可以确定插入子的取向和序列。将命名为pGEX-KG-415的DNA构建体进一步用来获得融合蛋白质GST-SW3的表达。将包含pGEX-KG-415质粒的大肠杆菌菌落接种到补充了100μg/ml氨苄青霉素的细菌培养基(2×TY)上，并且使其在37℃下生长一夜。将一小份在200ml包含100μg/ml氨苄青霉素和培养物的2×TY中进行1∶50稀释达到在600nm处光密度为0.6和0.8之间。添加IPTG使终浓度为1mM，并且将培养物额外温育两小时。
如果没有另外提到，采用由Smith和Johnson,1988以及Frangioni和Neel,1993改编的纯化方案。在6000×g下通过离心15分钟收集细菌，并且用6ml的STE(10mM Tris(pH8.0),150mM NaCl,1mM乙二胺四乙酸)洗涤一次。将细胞在6ml包含5mg/ml溶茵酶的STE中进行重新悬浮。将10μl浓度为10mg/ml的DNA酶Ⅰ添加到混合物中并且将溶液在冰上温育15分钟。添加二硫苏糖醇和肌氨酰分别至终浓度为5mM和1.5％。通过两次30秒的超声处理获得额外的裂解(Sonifier250,Brandson)。将该裂解物在10000×g下离心10分钟，在冰上温育15-30分钟之前，将Triton X-100添加到终浓度为1.4％的上清液中。然后，利用琼脂糖-谷胱甘肽小珠(Sigma,Nr.G-4510)通过轻微的搅拌该混合物将融合蛋白质在室温下在1×PBS中纯化30分钟。在1000×g下离心5分钟使小珠沉降，并且用1ml冷的PBS洗涤4-5次。最后，通过在10mM谷胱甘肽溶液(pH8.0)(Merck Nr4090)中重悬浮该小珠，将融合蛋白质从树脂中洗脱出来，并且将它们在室温下不停搅拌下温育10-30分钟。在500×g下将该混合物离心5分钟，并且将上清液转移到一个新试管中。重复洗脱2至3次，并且收集上清液。通过如Lammli所描述的(1970)SDS10％PAGE分析制剂的小份。通过在280nm处测量吸光度或者通过比较在考马斯R-250染色后的融合蛋白质的强度与所定义数量的分子量标记物的染色可以量化融合蛋白质。
1.10.免疫方案将2×25μ1的1∶1不完全弗洛因德佐剂的超声处理混合物以及在1×PBS中，2mg/ml的GST-415、415肽或者仅仅GST皮下注射到BALB/c小鼠中。在4周后，以一种等同的材料进行加强免疫。
1.11．寄生虫免疫性试验方案通过将2-5×106感染性的前鞭毛体接种到右后脚垫来进行感染，左后脚垫作为内部参照。利用两脚规测量每周损伤的生长。将脚垫的大小对感染后的天数作图。
2．结果在胞内无鞭毛体时期与自生前鞭毛体时期相比，SW3基因在RNA水平上具有更高的表达。它编码一种具有与组蛋白H1蛋白质序列相似性的蛋白质，并且已被描述为组蛋白H1-样蛋白质(Fasel等，1994)，但是对于它还没有提供任何证据。
为了表示SW3基因产物的特征，我们产生了针对与SW3推定的氨基酸序列(参见材料和方法)的氨基-末端相应的肽(“415”)的兔抗血清，并且分析了LV39品系的胞质或者核溶胞产物。在Leishmania major前鞭毛体的免疫印迹中，在核抽提物中，抗-415兔血清特异性识别大小在17-19kDa范围的蛋白质双联体(图1，泳道d)，但是在胞质抽提物中不识别(图1，泳道b)，这显示至少有两种相关的但不同的核蛋白质的核定位和存在。两个反应多肽的检测是两个SW3相关基因的存在的暗示。用兔免疫前血清没有识别到类似大小的多肽(图1，泳道a和c)。
SW3多肽的生化分析确定了编码多肽的组蛋白性质。利用所说的组蛋白(HCl)与组蛋白H1制备(高氯酸)方法可以从核组分中纯化SW3蛋白质达到高程度(图2，泳道b、d和f)。当蛋白质提取物用免疫前血清分析时，不存在任何信号(图2，泳道a、c和e)。
将部分蛋白质作为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白质在细菌表达系统中表达。在GST-琼脂糖柱上纯化之后，可以检测预期分子量的产物(图3，泳道c，用箭头1表明)。箭头2表明包含连接SW3的50个氨基酸的GST的GST-415融合蛋白质。将纯化的重组蛋白质混合物注射到敏感的小鼠品系(BALB/c)中以便显示它在寄生虫免疫实验中作为保护性抗原的潜力。将小鼠组用重组蛋白质GST-415和不完全弗洛因德佐剂的混合物(图4,D组)，仅用不完全弗洛因德佐剂(图4，组A)或者GST和不完全弗洛因德佐剂的混合物(图4，组B)进行皮下免疫(在尾的基部)。也可利用所说的415合成肽(图4，组C)。小鼠在进行免疫一个月或者三个月之后，在它的后脚垫处用2-5×106Leishmania major感染性前鞭毛体感染。通过测量后脚垫厚度的增加(与未感染的对侧脚垫相比)每周监测损伤的发展。在用GST-415重组产物或用415肽注射的动物中(图4，组D和C，分别地)，克服了对感染的易感性虽然损伤开始表现为感染的征候，但是抑制了它的生长并且缩减了损伤的大小。在用肽415或GST-415感染的小鼠右脚垫中，图4给出显示损伤消退的图表。在仅用IFA(组A)或GST(组B)免疫的小鼠中没有观察到任何消退。
利用引物S-SW3和A-SW3扩增Leishmania major的基因组DNA至SW3编码区的大多数5′和3′末端以产生各种PCR产物(图5，泳道a)。将一定的这些产物进行亚克隆和测序。我们的测序数据已经确定，测序的互补DNA在开放读框内与SW3不同(氨基酸块的缺失)。图6给出了SW3家族的两个附加成员(A3,P3)的序列。
如果可以用于控制其它利什曼原虫属物种，那么SW3和SW3相关多肽是令人感兴趣的。由于这个原因，在新世界利什曼原虫属物种如Leishmania chagasi,Leishmania guyanensis,Leishmania panamensis和Leishmania amazonensis中已经寻找到各种大小的交叉杂交信使RNA转录物(图7)。这个结果提供了在其它可用来获得保护的利什曼原虫属中存在相关基因和基因产物的证据。
图1利用兔抗血清通过免疫印迹法的组蛋白H1的生化定位，该兔抗血清是由与SW3基因产物的N-末端相应的肽415产生的。在用兔抗血清α-415(泳道b和d)或用兔免疫前血清(泳道a和c)进行免疫印迹和探测之前，将稳定期Leishmania major前鞭毛体胞质蛋白质(泳道a和b)或核蛋白质(泳道c和d)在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。表明参考分子量(21kDa)。图2SW3基因产物的生化表征。稳定期前鞭毛体的核抽提物(泳道a和b)和0.1N HC1核抽提物(泳道c和d)或5％高氯酸核抽提物(泳道e和f)用针对肽415产生的兔抗血清(泳道b、d和f)或用兔免疫前血清(泳道a、c和f)的蛋白质印迹分析。在进行免疫印迹之前，将抽提物在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。图3融合蛋白质GST-415在大肠杆菌中的表达和纯化。将蛋白质在12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并且用考马斯蓝进行染色。将样品按照如下进行填充泳道a，纯化的谷胱甘肽-S转移酶(GST)；泳道b，分子量标记(MW)；泳道c，纯化的融合蛋白质GST-415(箭头1表明全长产物；箭头2表明包含与作为内部蛋白水解切割结果的SW3的氨基酸连接的GST的GST-415融合蛋白质。图4采用Leishmania major LV39品系进行感染之后对脚垫大小的测量。将BALB/c小鼠的右后脚垫(充满的菱形符号)用LV39寄生虫进行传染，该小鼠已经用IFA(实验对象A)，用GST(实验对象B)，用肽415(实验对象C)或者GST-415融合蛋白质(实验对象D)进行免疫。将左脚垫(开阔的菱形符号)用作内部对照。图5利用S-SW3和A-SW3寡核苷酸对LV39基因组DNA的聚合酶链反应(参见材料与方法)。如下进行上样泳道a，利用S-SW3和A-SW3寡核苷酸对LV39基因组DNA的扩增；泳道b，在S-SW3和A-SW3存在下(但是缺少DNA模板的情况下)与扩增相应的负对照；泳道c，在S-SW3和A-SW3存在下与SW3互补DNA扩增相应的正对照。图6SW3(图6A)和两个新等位基因A3(图6B)与P3(图6C)的核苷酸和氨基酸的序列。图7在其它利什曼原虫属物种中，SW3交叉杂交的信使RNA的蛋白质印迹分析。实验对象ASW3转录物、SW3基因和反义SW3核糖探针的图示。实验对象B将从Leishmania major(泳道a)、Leishmaniaguyanensis(泳道b)、Leishmania panamensis(泳道c)、Leishmaniachagasi(泳道d)和Leishmania amazonensis(泳道e)前鞭毛体分离的胞质RNA在0.8％琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙膜上并且如实验对象A所显示的用SW3反义核糖探针进行杂交。参考文献●Atherton E.,Logan C.J.和Shepard R.C.(1988).肽合成.Ⅱ.在聚酰胺支持物上利用Nα-芴甲氧氨基甲酰氨基酸的固相合成方法P物质和酰基载体蛋白质65-74十肽的合成。化学科学杂志1,538。●Berger S.L和Birbenmeier C.S.(1979).利用氧钒核糖核苷复合物抑制难处理的核酸酶从休眠淋巴细胞分离信使RNA.生物化学18,5143。●Fasel,N.J.,Robyr,D.C.,Mauёl,J.和Glaser,T.A.(1994).在Leishmania major中表达的组蛋白H1-样基因的鉴定，分子生物化学寄生虫学62,321。●Frangioni J.V.和Neel B.G.(1993)酶促活性谷胱甘肽S-转移酶(pGEX)融合蛋白质的溶解和纯化．分析生物化学210,179。●Glaser T.A.,Wells,S.J.,Spithill,T.W.,Pettit,J.M.,Humphris,D.C.,和Mukkuda,A.J.(1990)在Leishmania major和杜诺夫氏利什曼原虫一种无鞭毛体的快速纯化的方法。实验寄生虫学71,343。●Guan,K.和Dixon,J.E.(1991).在大肠杆菌中表达的真核生物蛋白质一种用谷胱甘肽S-转移酶对融合蛋白质的改进的凝血酶切割与纯化方法。分析生物化学192,262。●Harlow,E.和Lane,D.(1988).抗体实验室手册。冷泉港实验室，冷泉港，纽约。●Hecker,H.,Betschart,B.,Burri,M,以及Schlimme,W.(1995)。锥虫染色质的功能形态学。今日寄生虫学11,79●Heinzel,F.P.,Schoenhaut,D.,S.,Rerko,R.M.,Rosser,L.E.和Gately,M.K.(1993).重组体白细胞介素12治愈用Leishmaniamajor感染的小鼠.J.Exp.Med.177,1505。●Heinzel,F.P.,Sadick,M.D.,Mutha,S.S.和Locksley,R.M.(1991).在痊愈和进行性利什曼病期间由CD4+淋巴细胞在体内产生干扰素-g、白细胞介素2、白细胞介素4以及白细胞介素10。美国国家科学院院报.88,7011。●Hill,J.O.,Awwad,M.和North,R.J.(1989).敏感性BALB/c小鼠消去CD4+抑制T细胞以释放CD8+淋巴细胞来介导对利什曼原虫属的保护性免疫。实验医学杂志，1819。●Laemmli,U.(1970)在噬菌体T4的头部装配期间结构蛋白质的切割。自然227,680。●Louis,J.,Moedder,E.,Behin,R.和Engers,H.(1979)由鼠T-淋巴细胞对原虫寄生虫抗原的识别。Ⅰ.对Leishmania tropica的特异性T淋巴细胞依赖性增殖反应的诱导。欧洲免疫学期刊9,841。●Liew,F.Y.和O′Donnell,C.A.(1993).利什曼病的免疫学。高级寄生虫学.32,161。●McMahon-Pratt D.,Rodriguez,D.,Rodiguez,JR.,ZhangY.,Manson K.,Bergman,C.,Rivas,L.,Rodrigue JF.,Lohman KL.,Ruddle NH.等，(1993).表达GP46/M-2的重组牛痘病毒抵抗利什曼原虫属的感染。感染和免疫性.61,3351。●Merrifield,R.B.(1986)固相合成。科学232,341。●Milon,G.,Del Giudice,G.,和Louis,J.(1995).实验皮肤利什曼病的免疫生物学。今日寄生虫学.11,244。●Müller,I.,Pedrazzini,T.,Farrell,J.P.和Louis,J.(1989).对用Leishmania major实验感染的T-细胞应答和免疫性。免疫学年鉴7,561。●Rachamim,N.和Jaffe,CL.(1993).来自杜诺夫氏利什曼原虫的纯蛋白质保护小鼠免得皮肤和内脏利什曼病.免疫学杂志150,2322。●Reiner,S.L.,和Locksley,R.M.(1995).对Leishmania major免疫性的调节。免疫学年鉴13,151。●Reed,S.G.,和Scott,P.(1993).在利什曼病中T-细胞的细胞因子应答。免疫学现行观点5,524。●Russell,D.G.和Alexander,J.(1988).用所定义的在脂质体中重建的膜抗原对皮肤利什曼病的有效免疫。免疫学杂志.140,1274。●Scott,P.,Pearce,P.,Natovitz,和Sher,A(1988).在amurine模型中对皮肤利什曼病的接种。Ⅰ.用前鞭毛体的可溶性抽提物对保护性免疫的诱导。免疫学杂志139,221。●Scott.P.(1989).在实验皮肤利什曼病中Th1和Th2细胞的作用。实验寄生虫学.68,369。●Smith,D.F.,Gokool,S.,Keen,J.K.,McKean,P.G.和Rangarajan,D.(1994)感染期间利什曼原虫属的蛋白质的结构和功能.Biochem.Soc.Trans.22,286。●Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)用谷胱甘肽S-转移酶作为融合在大肠杆菌中表达的多肽的一步纯化。基因67,31。●Sypek,T.P.,Chung,C.L.,Mayor,S.E.H.,Subramanyam,J.M.,Goldmann,S.J.,Sieburth,D.S.,Wolf,S.F和Shaub,R.G.(1993).皮肤利什曼病的消退白细胞介素12引起保护性T辅助类型1免疫应答。实验医学杂志177,1797。●Wilson,M.E.(1990)利什曼病。传染病的现行观点3420。●Yang,D.M.,Rogers,M.V.,和Liew,F.Y.(1991).来自Leishmania major的主要表面糖蛋白(gp639)的宿主保护性表位的鉴定和表征.免疫学.145,2281。
权利要求
1．实质上分离形式的锥虫组蛋白，该锥虫组蛋白用作抗锥虫感染的保护性抗原。
2．如权利要求1所要求的组蛋白，其中所说的锥虫是利什曼原虫属的物种，例如所说的利什曼原虫亚属的物种，包含物种Leishmania major,Leishmania chagasi，杜诺夫氏利什曼原虫(Leishmania donovani)，婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum),Leishmania mexicana,Leishmania amazonensis，以及所说的Viannia亚属的物种，包含物种巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis),Leishmania peruviana,Leishmania guyanensis,Leishmania panamensis，以及所说的锥虫感染利什曼病。
3．如权利要求1所要求的组蛋白，其中所说的锥虫是锥虫属(Trypanosoma)物种，如克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)，布氏锥虫(Trypanosoma brucei)。
4．如权利要求1-3之任一所要求的组蛋白，该组蛋白是H1组蛋白。
5．编码如权利要求2或4所要求的组蛋白多肽的利什曼原虫基因，该多肽具有一种对利什曼病的保护能力，并且，其中所说的基因具有一种核苷酸序列，该核苷酸序列可以与下列序列杂交a)图6A中所描述的序列的多核苷酸的至少区别部分；或者b)编码部分对多肽的保护能力起作用的组蛋白的图6A的序列的那些部分；或者c)a)或b)的互补链。
6．如权利要求5所要求的利什曼原虫基因，其特征在于所说的基因来源于Leishmania major，并且它的编码区本质上具有图6B所描述的核苷酸序列或它的互补链。
7．如权利要求5所要求的利什曼原虫基因，其特征在于所说的基因来源于Leishmania major，并且它的编码区本质上具有图6C所描述的核苷酸序列或它的互补链。
8．如权利要求5-7所要求的利什曼原虫基因的衍生物，该衍生物包括所说的基因片段、所说的基因的完全或部分互补DNA、所说的基因的完全或部分信使RNA、由所说的基因编码的完全或部分的蛋白质、包含至少一部分免疫原性的蛋白质的肽、反义寡核苷酸或多核苷酸、至少部分所说的基因，互补DNA，信使RNA，蛋白质或者肽与至少部分另一种基因、互补DNA，信使RNA，蛋白质或者肽之间的融合产物、所说的基因，互补DNA，信使RNA，蛋白质，肽或者其融合产物的抗体，抗所说的基因，互补DNA或者信使RNA的特异性引物，其中每种衍生物可以被分离或者可以通过重组DNA技术而获得。
9．如权利要求8所要求的衍生物，其特征在于所说的衍生物是针对具有下列氨基酸序列的肽的抗体NH2-MSSNSAAAAVSAATTSPQKS-COOH。
10．如权利要求5-9所要求的利什曼原虫基因和/或它们的衍生物，将其运用于寄生虫感染的诊断、预防以及治疗。
11．如权利要求10所要求运用的利什曼原虫基因和/或它们的衍生物，其特征在于所说的寄生虫感染是锥虫感染，特别是利什曼原虫感染。
12．如权利要求10所要求运用的利什曼原虫基因和/或它们的衍生物，其特征在于所说的寄生虫感染是由一种或多种利什曼原虫属物种的感染，该利什曼原虫属物种选自下组利什曼原虫亚属，包括Leishmaniamajor、Leishmania chagasi、杜诺夫氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、Leishmania mexicana、Leishmania amazonensis、以及Viannia亚属的物种，包括巴西利什曼原虫、Leishmania peruviana、Leishmaniaguyanensis、Leishmania panamensis。
13．如权利要求5-9所要求的利什曼原虫属基因或/和它们的衍生物的用途，将其用于诊断性试验的制剂，用于治疗寄生虫感染的预防组合物或治疗组合物，特别是锥虫感染，例如利什曼原虫属感染，例如由一种或多种选自下组的利什曼原虫属物种引起的利什曼原虫亚属，包括Leishmania major,Leishmania chagasi，杜诺夫氏利什曼原虫，婴儿利什曼原虫，Leishmania mexicana,Leishmania amazonensis，以及Viannia亚属，包括巴西利什曼原虫，Leishmania peruviana,Leishmania guyanensis,Leishmania panamensis。
14．DNA构建体，包含一种或多种如权利要求5-7所要求的基因，或者其片段或互补DNA，或者包含至少部分所说的基因的融合产物，所说的基因可操作地与适当的表达信号连接。
15．携带如权利要求14所要求的DNA构建体的载体。
16．如权利要求15所要求的载体，其特征在于所说的载体是如在说明书中所定义的pGEX-KG-415质粒。
17．包含如权利要求14所要求的DNA构建体和/或如权利要求15和16所要求的载体的宿主有机体。
18．诊断性试验方法，该试验方法包含通常的试剂和材料以及一种诊断剂，该诊断剂对于在所说的被试者中检测传染性病原体的存在是合适的，并且它选自如权利要求5-7所要求的基因或者如权利要求8或9所要求的衍生物。
19．如权利要求18所要求的诊断性试验方法，其中所说的试验对于在所说的被试者的体液中检测传染性病原体的存在是合适的。
20．疫苗组合物，该疫苗组合物包含通常的载体和/或佐剂以及至少一种如权利要求1-4所要求的组蛋白和/或如权利要求8或9所要求的一种或多种衍生物，这种组蛋白或者衍生物能够在接收所说的组合物的被试者中引发保护性免疫。
21．如权利要求1-4所要求的组蛋白，该组蛋白通过包含下列步骤的方法是可以获得的a)将锥虫物种的细胞进行裂解以获得裂解物；b)将核从裂解物中分离；c)在抽提介质中重悬浮所说的核以获得组蛋白溶液，该抽提介质例如为了获得总组蛋白的0.5-2.5N，优选的是1.25N HCl溶液，或者为了获得组蛋白H1的1-10％，优选的是5％高氯酸；d)可以从也可以不从组蛋白溶液中除去不能溶解的蛋白质；e)通过添加沉淀剂沉淀出组蛋白，该沉淀剂例如过量的为了总组蛋白的冷丙酮或为了组蛋白H1的冷乙醇。
22．如权利要求1-4或21所要求的组蛋白，将该组蛋白用于寄生虫感染的诊断、预防和治疗，特别是锥虫感染，如利什曼原虫感染，例如由一种或多种利什曼原虫属物种引起的感染，该利什曼原虫属物种选自下组利什曼原虫亚属，包括Leishmania major、Leishmania chagasi、杜诺夫氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、Leishmania mexicana、Leishmaniaamazonensis、以及Viannia亚属的物种，包括巴西利什曼原虫、Leishmania peruviana、Leishmania guyanensis、Leishmaniapanamensis。
23．如权利要求21所要求的组蛋白，将该组蛋白用作分离编码保护性抗原和/或所说的基因的衍生物的起点。
24．如权利要求1-4或21所要求的一种或多种组蛋白的用途，将该组蛋白用作诊断性试验方法的制剂、治疗寄生虫感染的预防组合物或治疗组合物，特别是锥虫感染，如利什曼原虫感染，例如由一种或多种利什曼原虫属物种引起的感染，该利什曼原虫属物种选自下组利什曼原虫亚属，包括Leishmania major、Leishmania chaqasi、杜诺夫氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、Leishmania mexicana、Leishmania amazonensis、以及Viannia亚属的物种，包括巴西利什曼原虫、Leishmania peruviana、Leishmania guyanensis、Leishmania panamensis。
25．胞内或核蛋白质的用途，将该胞内或核蛋白质用作寄生虫感染治疗和/或预防的保护性抗原。
全文摘要
本发明涉及实质上分离形式的锥虫组蛋白,该锥虫组蛋白用作抗锥虫感染的保护性抗原。这些组蛋白可以从相应的寄生虫分离或者借助于重组DNA技术产生。对于后一目的,本发明也提供编码组蛋白的基因和该基因的衍生物(如其它核酸)以及基因产物(如肽与蛋白质)。本发明进一步提供了诊断试验、包含通常的赋形剂和/或佐剂和至少一种组蛋白,组蛋白编码基因或其衍生物的药物组合物和疫苗。
文档编号C12N15/09GK1216584SQ97193835
公开日1999年5月12日 申请日期1997年3月12日 优先权日1996年3月12日
发明者N·J·法瑟尔, T·A·格拉瑟 申请人:索瓦雷克股份有限公司