组成型植物启动子的制作方法

专利名称：组成型植物启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型植物启动子，更具体地，由具有互补专一性的启动子部分组装而产生的那些启动子。
背景技术：
由于两大发现使得植物遗传工程成为可能首先是将异源遗传材料转化到植物细胞的可能性(最有效的是通过细菌根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以及相关菌株来完成的)，再者是能够驱动所述的异源遗传材料表达的植物启动子的存在。
典型的植物启动子由特定元件组成。其基础由使得转录起始的基本启动子元件所形成，其还时常有被命名为TATA-框的一段序列相伴，作为转录起始因子的结合位点。在大多数启动子中，TATA-框的存在对于正常的转录起始十分重要。一般，它位于转录起始位点上游的35至25碱基对(bp)处。启动子的另一部分由能与DNA结合蛋白相互作用的元件组成。已知的是由六核苷酸CACGTG基元所构成的G-框结合元件。已经显示，这些元件能够与结合形成二聚体的bZIP DNA结合蛋白相互作用(Johnson & Mcknight，生物化学综述年报(Ann.Rev.Biochem.)58，799-839，1989)。其它G-框相关基元，例如，Iwt和PA基元已经被描述(WO 94/12015)。
已经显示，这些基元参与植物中组织特异的启动子表达。例如，Iwt四聚体的存在赋予胚胎特异性表达，而PA四聚体则促使高水平的根表达、低水平的叶表达，但无种子表达。
相似地，描述了GT-1样结合位点(以中等共有序列GGTA/TA为根据分组)。在拟南芥属(Arabidopsis)质体蓝素启动子的启动子远上游区发现了这样的结合位点，其似乎参与光周期中转录的激活(Fisscher,U.等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，26，873-886，1994)。
另一种在植物启动子中经常发现的、与序列有关的现象是致使Z-DNA形成的序列的存在。Z-DNA是由双核苷酸GC或AC的重复所引起的、以左手螺旋折叠的DNA。据信，Z-型的折叠会影响RNA聚合酶分子与DNA接近的有效性，从而抑制转录速率。
植物蛋白表达领域中，最早的也是最重要的发明之一是(植物)病毒的和土壤杆菌属来源的启动子的使用，它们使得异源基因在转基因植物中有效地、组成型表达。一些这类启动子已在植物遗传研究中得到非常深入的使用，而且仍然是快速、简便、低危险性表达研究的优选启动子。最有名的有早在1984年就发现在实践上非常有用的花椰菜花叶病毒(CaMV)中的35S和19S启动子(EP 0 131 623)，在土壤杆菌属T-DNA中发现的启动子，如胭脂氨酸合酶(nos)、甘露氨酸合酶(mas)以及章鱼氨酸合酶(ocs)启动子(EP 0 122 791，EP 0 126 546，EP 0 145 338)。具有相似特征的植物来源的启动子是遍在蛋白质启动子(EP 0 342926)。
已多次尝试了提高这些启动子的表达水平。其中的实施例是双倍增强的35S启动子(US 5,164,316)，最近还有超启动子，其是将土壤杆菌属启动子的多个部分偶联(EP 729 514)。
然而，在许多情况下，这些启动子不能达到理想启动子的标准。以上所描述的所有启动子清楚地显示着一种器官或发育特异性表达方式，在使用这些启动子时，经常发现表达方式对于某些应用是不理想的。尤其是对于生物技术的应用，例如，真菌抗性以及昆虫抗性工程，它们要求表达既发生在正确的位置上同时又在植物发育的准确时间框架中，因此需要新的能够在准确的时间和位点高水平转基因表达的组成型启动子。
发明概述本发明提供新型植物启动子，其特征在于它们包含1)基本启动子，以及2)来自一组启动子的转录激活元件，这些元件将指导植物中的一种转录互补方式与水平。
更明确地，这种植物启动子是一种组成型启动子，其中每一个转录激活元件都不表现出一种绝对组织特异性，但是能在大多数植物部位以大于或等于转录最为活跃的植物部位所达到水平的1％水平介导转录活性。这种启动子对的一个实施例是一组启动子，其中一种在植物的绿色部位最为活跃，而另一种启动子在植物的地下部位是最活跃的。更明确地，新型启动子是铁氧还蛋白启动子与RolD启动子的组合。优选地，在此构建体中基本启动子元件是由铁氧还蛋白启动子衍生的，铁氧还蛋白启动子来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。RolD启动子来自发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。
本发明中还包括一种植物启动子，它是由质体蓝素启动子与S-腺苷甲硫氨酸-1启动子组合而成的，由此优选地，基本启动子元件由S-腺苷甲硫氨酸-1启动子衍生而来，质体蓝素启动子与S-腺苷甲硫氨酸-1启动子都是由拟南芥衍生而来的。
本发明另外的部分是用于在植物中的基因表达的嵌合基因构建体，其含有以上所描述启动子的基因。
附图描述

图1pMOG410和pMOG1059的示意2由构建体pMOG1059和pMOG410转化的马铃薯系的GUS表达的分布状况。GUS染色通过肉眼观察来判断，与最高的GUS表达相关的表达分级由本实验室测定(规定为4)。0值表示没有可见的表达。图3番茄、油籽油菜以及马铃薯中之初级转化子中GUS酶的平均表达示意图。GUS表达由肉眼测定，定级为4分，并与定为4分高水平表达35S GUS转基因番茄植物比较。测量值的标准偏差如每一个小横线所示。图4含有SAM-1-、Pc-35S和PcSAM1-GUS构建体的不同GUS表达水平的马铃薯植物的分布状况示意图。得分表明在叶片叶肉、叶片维管系统、茎以及根中的表达。
发明详述对于此说明书，以下定义是有效的启动子包括DNA上的RNA聚合酶的结合位点，形成功能性转录起始的开始位点。启动子通常包括至少一个TATA框，以及可能的还包括转录起始位点(起始密码子)周围的其它序列，启动子可以独立地使用(基本启动子)，又可与转录激活元件、沉默子或增强子的结合位点相连而使用，从而可以加快或降低转录起始速率，其可根据不同的发育阶段、或外部的或内部的刺激发挥功能。
起始位点是第一个核苷酸周围的部位，其是转录序列的一部分，又被定义为位置+1。根据这个位点将这个基因的其它序列和它的调控区编号。下游序列(即，3’方向的进一步蛋白编码序列)被命名为正的，而上游序列(5’方向的大多数调控区)则被命名为负的。
基本启动子是仅仅由所有的转录起始所需的基础元件，例如TATA-框和/或起始密码子组成的一种启动子。
增强子是这样的DNA元件，它存在于启动子的附近，能够提高转录起始速率。
当启动子能够表达在植物所有的或近乎所有的发育阶段中、在全部的或近乎全部的植物组织中其所控制的基因时，该启动子便是组成型的。
特异性表达是局限于一个或几个植物组织(空间局限性)和/或，一个或者几个植物的发育阶段(时间局限性)的基因产物的表达。众所周知，几乎不存在任何真正的特异性启动子似乎在某些组织中优选地开启，而在其它的组织中可能没有或几乎没有活性。这种现象被认为是渗漏表达(leaky expression)。然而，本发明中的特异性表达是指在一种或几种植物组织中优选表达。
启动子(有或没有增强子)的表达方式是指在植物的何种部位，以及在何种发育阶段中由所述的启动子启动的转录所显示的表达水平的方式。
当一种启动子的表达方式和其它启动子的表达方式几乎不显示出重叠时，称一组启动子的表达方式是互补的。
启动子的表达水平可通过测量一种标准转录的报道基因mRNA的稳态浓度来决定。因为报道基因mRNA的浓度不仅依赖于它的合成速率，还依赖于这种mRNA的降解速率，所以对它的测定是间接的。因此稳态水平是合成速率与降解速率的乘积。然而，当转录的序列相同，可认为降解速率按照一个固定的速率进行时，那么这个值可用来测定合成速率。当用这种方法比较启动子时，本领域技术人员可利用的技术是杂交S1-RNA酶分析、Northern杂交以及竞争性RT-PCR。这种技术的列举绝对不代表所有可以使用的技术，而只是描述用于分析mRNA转录活性以及表达水平所通常使用的方法。
在这种分析中所遇到的技术困难之一是，只有将转录激活部位和报道基因RNA分子相融合使得只转录报道基因序列，才能得到最高质量的结果。这就要求精确测定RNA合成起始，并在该位点连接报道基因mRNA的序列。
多种原因表明这一点是重要的。首先，几乎所有启动子中转录起始位点的分析表明了转录起始通常不是在单一碱基上，而是在或多或少成簇的一组起始位点上，其中每一个都起着mRNA的一些起始位点的作用。由于启动子和启动子之间的这种分布的不同，在每一个种群中报道基因mRNA序列相互之间也是有差别的。因为每个mRNA种或多或少都有降解的倾向，没有单一的降解速率可用来预测不同的报道基因mRNA。其次，已经显示对于多种真核生物启动子序列来说，起始位点(起始密码子)周围的序列在决定该特定启动子所指导的RNA表达水平上起着重要的作用。这还包括部分的转录序列。因此，启动子与报道基因序列的直接融合将会导致远不是最为理想的转录水平。
这些转录序列确实可测定转录速率，但也潜在地改变报道基因mRNA的稳定性，并影响一个最终开放阅读框的翻译起始速率。
然而，这种分析的作用是测定异源蛋白质组成型表达的相对水平，是生物技术中最常用的应用。因此，最重要的参数是所测试序列对异源报道基因蛋白高水平表达的驱动能力。
本发明还包括将报道基因蛋白的编码序列与转录激活部分、启动子以及用来测试基因性质的5’非翻译序列相偶联。这样，一组复合的结果(结合转录速率，mRNA稳定性(即mRNA的降解速率)以及翻译起始速率)将约简为对于决定生物技术应用中所测试的基因元件是否有效的一个非常有用的数值。
没有一个现成的单词或短语来去描述这个数值。在此申请中，除术语‘表达值’以外，还使用术语‘表达水平’和‘转录活性我们意识到这可能会引起某种混乱。在所有的情况下，我们确实用这些和与之相关的术语表示刚刚提及的数值。经常用来分析表达方式和水平的方法是测定细胞中蛋白质积累的‘稳态’水平。本领域技术人员所熟知的常用候选报道基因是β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)以及具有荧光特性的蛋白质，例如，维多利亚水母(Aequoravictoria)中绿色荧光蛋白(GFP)。然而，假如蛋白质不干扰基本的植物功能，原则上还有更多的蛋白质可用于此目的。许多手段适用于定位的鉴定和测定。根据例如，已有基于免疫化学、酶学、荧光测定和鉴定的检测系统或很容易建立这样的系统。蛋白质水平可通过在植物组织抽提物中或在完整组织中蛋白质表达的原位分析来测定。
一般地，含有一种嵌合启动子-报道基因构建体的单个转化系在报道基因的表达水平方面各不相同。经常观察到的现象还有，这样的转化子不表达任何可检测的产物(RNA或者蛋白质)。尽管经历失活的分子机理通常不清楚，但这种表达中的可变性常常归因于位置效应’。
此处用术语平均表达来表示在所有确实表达了可测定量的报道基因的系中可见的表达之平均水平，因此，排除了去分析那些不表达任何可测定报道基因mRNA或蛋白质的植物。
根系表达水平表示完整的植物根部蛋白质抽提物中可见的表达水平。同样地，‘叶表达水平’和‘茎表达水平’是采用叶和茎的完全抽提物测定的。然而，应当清楚在刚刚描述的每一个植物部位中，存在着具有多种功能的细胞，其中启动子的活性可能是不同的。
对于本申请中描述的启动子，测定了含有具有各种功能细胞的多种植物部位中的表达水平。然而，更为详尽的分析可能有助于构建一个‘更为组成型的’启动子，它可以兼顾一个植物部位内更多的细胞型。
作为判断表达水平的标准，花椰菜花叶病毒的35S启动子是方便并广泛使用的。可以将这个启动子的平均表达水平归类为中等高度。
本发明表明，有可能将负责一种特异表达的启动子中的元件与负责互补表达方式的另一种启动子中的元件组合，构建一个启动子，结果使它在形成两个启动子表达方式的部分的组织和发育阶段中表达。如果互补导致在(近乎)所有植物细胞中具有活性，这样的互补就产生了一个组成型启动子。然而，似乎有必要，在对其它启动子特异的组织和发育阶段中，两个启动子都具有一个低的表达值。已经确定，为达到适当的结果，在低表达的植物部位中的转录活性应该优选地大于或等于在转录活性高的植物部位中所能达到的转录水平的1％。
这限制了构建新组成型启动子的启动子和启动子元件的可利用性。能达到以上提及的标准的启动子对是与rolD启动子结合的铁氧还蛋白启动子与质体蓝素启动子结合的S-腺苷甲硫氨酸启动子也可使用互补的、以及在对其它启动子特异的组织和发育阶段中至少有某些表达的其它启动子对。所需启动子和/或增强子元件的描述然而转录调节元件(尤其在真核生物中)可能与启动子/转录起始位点之间存在着很大距离，并且位于起始位点的下游或上游，许多植物基因的大多数调节元件直接位于启动子上游区域。为了识别启动子的主要转录激活元件，常用的方法是将启动子上游(和下游)发现的非转录区部分与报道基因连接，来分析每一个截短的DNA元件对于该报道基因表达的指导能力。为了描述更多参与转录调节的启动子近端的序列，增强子序列的片段最经常地和一个可能由转录调节被研究的基因衍生的一个启动子相偶联。另外，可以使用一种异源启动子，例如，35S启动子的相对于转录起始点的-46到+4序列，其与以上描述的报道基因功能性地偶联。
这样，有可能用一种本领域技术人员熟知的方法来描述大多数基因的转录激活元件。
已经用这种方法分析了大量的基因转录调节元件。本领域技术人员通过科学性出版物可直接使用与这些分析相关的资料。
选择至少在一些植物的部位平均指导35S启动子的大约平均水平的表达(至少这个水平的50％)的转录激活元件，以及那些在其它植物部位也能够指导至少0.5％(35S水平的)转录的转录激活元件以供下一步的使用。
一般，基本启动子元件是由启动子对的其中一种启动子衍生而来的，尽管不是必须的。可以构想这种基本元件由第三种启动子衍生或甚至是合成得到的。
根据以上所描述的分析结果，选择具有互补活性的转录激活元件。例如，在整个植物中表达的启动子(指导高水平根部表达和较低叶和茎表达水平的转录激活DNA片段)与主要指导叶和茎表达但在根部较低表达的元件组合起来。互补转录激活元件的其它组合是显而易见的。
优选地，在那些最低表达部位的表达水平不低于最高部位所能获得的水平的1％。更优选的情形是植物部位之间的最低和最高表达之间的关系大于5％。
这种偶联可通过已知的遗传工程技术最为方便地实现。必须由新型组成型启动子表达的基因可以被克隆到启动子之后。在与启动子相连的5’非翻译序列连接一个独特的NcoI克隆位点，使得开放阅读框与能够插入目的基因的启动子3’端精确连接，这样将是可取的。铁氧还蛋白-rolD对。
本发明中优选的组合之一是包含铁氧还蛋白启动子元件和rolD启动子元件的一个组成型植物启动子。优选的，铁氧还蛋白启动子获自拟南芥，它可驱动参与光合作用的铁氧还蛋白A基因。已经报道了这个基因的表达以及这个启动子对光的反应性(Vorst,O.等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)14,491-499,1990；Vorst,O.等人，植物杂志(The PlantJ.)3(6),793-803,1993；Dickey,L.F.等人，植物细胞(The Plant Cell)6，1171-1176，1994)。因为铁氧还蛋白参与光合作用，这个启动子在绿色组织中是最活跃的。在含有叶绿体的器官，例如茎、叶和苞片，以及幼嫩的正在生长的组织，例如全花和幼苗中显示高的mRNA水平。有趣的是，在植物的土壤传播区有较小的但是明显的表达。启动子序列含有G-框以及一个包含Ⅰ-框的区域。另外，在-182位置上发现一个潜在的Z折叠的DNA序列。
据报道rolD启动子在根部有强烈的表达，它可从发根土壤杆菌中得到。尽管来源生物是一种细菌，但因为这种细菌是在植物中可引起发根病的植物病原菌，这个启动子对植物中的表达是非常适合的。因此，它将DNA转移到植物，其中rolD基因负责根的延伸。为了能在植物中表达，这个基因需要一个在植物中发挥功能的强启动子rolD启动子。GUS研究表明，rolD启动子控制下的表达产生主要的根特异性(Leach,F．Aoyagi K．等人，植物科学(Plant Sci.)79，69-76，1991)。另外，也观察到在叶中有一定的表达。
根据采用哪个启动子中的基本启动子元件和5’非翻译序列，可通过两种方法实现铁氧还蛋白启动子和rolD启动子的组合。在我们的实施例中，我们已经使用了铁氧还蛋白启动子中的基本启动子元件，但是，由rolD启动子衍生的也是同样好的。S-腺苷甲硫氨酸合成酶和质体蓝素对另一个优选的启动子可以通过将S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM)启动子和质体蓝素启动子的特定部分组合的方法来获得。优选地，两个启动子都获自拟南芥。
SAM启动子调节S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达，这是一种在多胺与乙烯的合成中具有活性的酶。启动子研究表明在维管组织、愈伤组织、厚壁组织中具有强烈的表达，而在根皮层中有一些表达(Peleman，J等人，植物细胞，1,81-93,1989)，这是由于该酶参与木质化作用。
质体蓝素启动子类似于铁氧还蛋白启动子，也是一种在光合作用途径中有活性的启动子。在绿色的含有叶绿体的结构中，例如，叶、茎生叶、茎以及全幼苗中有高水平的mRNA。在花中启动子也是非常活跃的。在长角、种子以及根部几乎不能检测出表达(Vorst，O等人，植物杂志，4(6)，933-945，1993)。
将这些特异性结合起来，有可能产生一种嵌合启动子，它既可驱动在叶和茎的光合作用区中良好地表达，又可驱动在不参与光合作用的区域，如形成或环绕叶和茎的维管系统的细胞中良好地表达。其它启动子对以上所列举出的启动子对的例子表明，在两个例子中都存在着光合作用过程中具有活性的启动子。可以想象，调节光合作用活性所需基因表达的其它启动子也可适于同rolD或者其它的根部优先的启动子组合。
在驱动植物全株表达的启动子构建中如果组分之一是对绿色部位或多或少特异的启动子，这就自动地意味着启动子对中的另一个，在根部或者其它非光合作用器官中应该是占主导地位的(但不是排他性的)。
驱动在叶和茎的所有部位表达的启动子之构建中，可以用一种或多或少对绿色部位特异的启动子与一种驱动主要在维管组织中表达的启动子组合。
然而，本发明不局限于将根部优先的与绿色部位优先的启动子组合，以及绿色部位优先的与维管系统优先的启动子组合。可以使用任何启动子组合，只要特殊启动子的表达方式互补。
也有可能，例如，一种构成新型组成型启动子的元件衍生于具有多于两种启动子的一个启动子组。那样也应该存在以上所讨论的互补性。
实施例部分实施例1嵌合Fd-rolD启动子的克隆从位点-512到+4(相对于铁氧还蛋白开放阅读框的ATG起始密码子来说)的512bp拟南芥铁氧还蛋白启动子片段(O.Vorst等人，1990，植物分子生物学(PMB)14，491-499)是通过HincⅡ和NcoⅠ消化而分离的。这个片段含有大部分的铁氧还蛋白启动子的转录调节序列、启动子序列以及铁氧还蛋白的转录前导区。为了克隆，在相对于ATG的-5到-10的位置上引进了一个XbaⅠ位点(O.Vorst等人，1990，植物分子生物学(PMB)14，491-499)。这将此位点的克隆之原初序列从ACAAAA改变成TCTAGA(SEQ ID NO1)。
将部分的发根土壤杆菌rolD的上游序列(SEQ ID NO2)(Leach等人，1991，植物科学(Plant Sci.)79，69-76)与以上所描述的铁氧还蛋白启动子序列融合。将包括相对起始密码子-385到-86核苷酸的HindⅢ-RsaⅠ片段克隆到铁氧还蛋白片段后面，将后者的RsaⅠ位点与前者的HincⅡ位点的连接。这个嵌合元件含有启动子和铁氧还蛋白基因的一些激活序列，至于rolD基因的上游激活序列由于其转录激活特性(SEQ ID NO3)将在下面的研究中使用。
实施例2GUS融合将Fd-rolD嵌合启动子/激活子偶联到改造过的含有内含子基因的GUS基因上(Jefferson等人，(1987)欧洲分子生物学杂志(EMBO J)63901-3907)。ATG起始密码子上的NcoⅠ位点用来将启动子连接到GUS基因开放阅读框上，它与含有蛋白酶抑制剂Ⅱ之3’端非翻译以及转录终止序列的265bp片段相偶联(Thornburg等人，1987，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84，744-748；An等人，植物细胞1，115-122)。
使用BamHⅠ和EcoRⅠ将包含启动子、GUS基因以及3’PⅠ-Ⅱ序列的整个表达盒克隆出来，并导入用相同酶消化的二元载体pMOG800(保藏于真菌菌种保藏中心(Centeaal Bureau voor Schimmelcultures)，Baarn，荷兰，保藏号CBS 414.93，1993年8月12日)。随后产生的构建体(pMOG1059)用于各种植物的转化实验。采用35S CaMV启动子-GUS构建体作为对照。这是构建体pMOG410。两个构建体的图解表示如图1所可。
实施例3植物转化早期阶段的启动子表达水平和方式首先，用两种构建体制得拟南芥转化子，在转化过程中及时出现了GUS的表达。
在0到5的等级上，GUS表达水平可通过肉眼观察测定，其中，0表示没有可观测的表达，而5是在转基因植物一种稀有的35S-GUS-转基因烟草(96306系)叶片中所观测到的GUS最高水平。在所有实验包括了取自这种植物叶片的样品用作内部参考。
表l中显示了与根癌土壤杆菌共培养后，多次拟南芥外植体中相对的GUS表达(DAC；共培养后的天数)。
表1．拟南芥属根外植体的相对GUS活性 从这个比较中可以看出，嵌合启动子驱动的GUS表达在共培养后稍微晚一些启动，但从第7天以后，超过了作为参考的35S启动子所获得的表达水平。
评价Brassica napus外植体的GUS表达时得到了十分相似的结果。共培养5天后，35S启动子略为高一些，但在共培养20天后，情况发生了逆转。对于烟草也得到了相似的结果。此处，甚至在最早期的分析中，pMOG1059转基因物的表达都超过pMOG410转基因物的表达。
实施例4体外生长的植物中的表达水平和方式当植物进一步长大，这些启动子之间的差别就越来越明显了。使用完全再生的植物叶片样品来分析GUS表达。根据构建体，从11到48株植物中得到平均值。
对于只在体外生长的拟南芥，在pMOG1059和pMOG410转基因物中没有观察到大的GUS表达差异。
表2．所有测试作物的叶片样品中平均相对的GUS活性 图2中所列出的结果也清楚地表明，相当多的35S-GUS转基因系(约50％在我们的实验中重复发现)GUS表达不到一个可观察到的水平。因此，不仅在Fd-rolD-GUS转基因植物中的最大的以及平均的表达较高，而且转基因植物确实表达GUS的频率也急剧地上升。在携带Fd-rolD-GUS构建体的约50株转基因马铃薯植物中，我们发现没有弱的表达子，提示在得到的植物系中至少98％都有可靠的高表达。
实施例5在各种作物中启动子行为表现的比较还将构建体pMOG410(35S-GUS)和pMOG1059(Fd-rolD-GUS)导入油籽油菜和番茄中进一步比较启动子的行为表现。此处还包括马铃薯的资料。如图3A中所示，在番茄中，无论是在体外生长的最后阶段，还是在四周龄和七周龄的植株叶片中，Fd-rolD启动子的整体表达水平都较高。在七周龄的茎中也是如此，然而，对于根来说，观察到具有Fd-rolD启动子的比35S启动子的平均表达水平弱一些。
在油籽油菜和马铃薯中也获得相似的结果，除了一个显著的区别，即在马铃薯的根部，采用Fd-rolD启动子的表达水平超过了采用35S启动子的情况。如图3B和3C中所示，Fd-rolD启动子的平均表达都较高，并且表达中的变动非常低。综上，我们可以说我们已创造了一种启动子，它在三种主要的作物中经受了与35S启动子的比较。
实施例6nptⅡ转基因的表达另外，为了检查Fd-rolD启动子对于其它目的之可用性，将启动子与nptⅡ基因连接，这个基因的相应基因产物的表达使得植物产生了对于抗生素卡那霉素的抗性。将这个元件放置于T-DNA的左右两边界之间，T-DNA允许根瘤土壤杆菌介导到植物的转移。作为对照，使用相似的构建体，其中nos启动子控制nptⅡ基因的表达。
在标准的转化方法中，通过转基因愈伤组织和枝条的发育证实转基因马铃薯植株中卡那霉素的抗性，其中卡那霉素用于培养液中。
平均而言，对于具有nos-nptⅡ选择盒的构建体，马铃薯的转化率为45％，对于具有Fd-rolD-nptⅡ选择盒的构建体，平均转化率为61％。但是，我们不知道，在这一刻转化频率的增加与这个构建体是如何相对应的，这表明Fd-rolD启动子至少与普遍使用的组成型启动子如nos一样，适于驱动异源的基因，例如nptⅡ。
实施例7肉眼观察打分与定量数值的比较我们知道，从依据1)组织化学分析以及根据一个内部对照打分以及2)GUS酶活性的定量分析之GUS表达分析这两种方法，都能给出一个可再现的定量数值。番茄和油籽油菜的叶和根得分之完整分析得出了这样的结论，等级3(最好是和35S的相比)相当于定量分析中所得到的约2000pmol MU/分钟.mg。等级1和2，平均值分别为1000和1500，是35S数值的50％。那个水平的1％的表达相当于100pmol MU/分钟.mg，这常常低于组织化学测定的检测水平。尽管有时由于GUS表达，可以观察到非常弱的蓝色。因此，人们可使用组织化学染色，通过测定蓝染色的水平，来作为启动子效能的标准，并利用这些资料来选择所用的启动子元件。
实施例8SAM1启动子的构建以及与GUS的融合为了构建SAM1启动子，采用CTAB抽提方法从拟南芥Landsbergerecta叶中分离基因组DNA(SEQ ID NO4)。根据公布的拟南芥K85的SAM1基因的序列设计引物(Peleman等人，(1989)基因(Gene)84，359-369)。使用PCR方法(95℃，45秒；50℃，45秒；72℃，1分钟，共30个循环，此部分所描述的所有其它PCR反应都在相同的程序下进行)，用引物FR-Psam-143 5’AGA TTT GTA TTG CAG CGA TTT CATTTT AG 3’(SEQ ID NO5)和引物FR-Psam-216 5’ATC TGG TCA CAGAGC TTG TC 3’(SEQ ID NO6)扩增启动子元件，产生了一个约550bp的片段。将该DNA片段从琼脂糖凝胶中分离，克隆到pGEM-T载体(Promega Corp_Madison WI，美国)中。将这个克隆用作模板，使用引物FR-Psam-144 5’GTC TCC ATG GTG CTA CAA AGA ATA G 3’(SEQ ID NO7)以及FR-Psam-143，用PCR方法，在翻译起始位点引入一个NcoⅠ位点。将所得的500bp片段克隆到pGEM-T载体中。用PCR方法，使用这个克隆作为模板，分两步去除位于启动子区的EcoRⅠ和HindⅢ位点。在这个PCR中，将BamHⅠ位点导入SAM1启动子的上游，将HindⅢ位点导入到启动子的3’端。在第一个PCR步骤中，产生了三个启动子片段。第一个片段(1)将含有5’BamHⅠ位点以及使用引物FR-Psam-248 5’CGG GAT CCT GCA GCG ATT TCA TTT TAG 3’(SEQ ID NO8)以及FR-Psam-249 5’ACA TGA ACG AAT GCA AAATCT C 3’(SEQ ID NO9)得到的突变的EcoRⅠ位点。中间片段(2)是使用引物FR-Psam-250 5’AGA TTT TGC ATT CGT TCA TGT G 3’(SEQ ID NO10)以及FR-Psam-251 5’TGT AAG CAT TTC TTA GATTCT C 3’(SEQ ID NO11)而获得的。这个片段与片段1和3具有部分的重叠，并含有突变的EcoRⅠ和HindⅢ位点。第三个PCR片段(3)将含有突变的内部HindⅢ位点，在翻译起始处包含NcoⅠ位点的启动子的3’端导入了一个HindⅢ位点，它是通过使用引物FR-Psam-252 5’AAGAAA TGC TTA CAG GAT ATG G 3’(SEQ ID NO12)以及FR-Psam-253 5’GAC AAG CTT GAT CCC ATG GTG CTA CAA AGAATA G3’(SEQ ID NO13)来产生的。在第二次PCR中，将片段1、2和3在一个管中混合，并用引物FR-Psam-248和FR-Psam-253扩增。由于片段1和2，以及2和3之间的重叠，这次PCR产生了完整的突变启动子。EcoRⅠ和HindⅢ消化后，将所得的SAM1启动子克隆到pBSK+载体中。然后，通过使用BamHⅠ和NcoⅠ限制性酶切位点交换上游区域，将SAM1启动子克隆到含有GUS内含子-TpⅠ-Ⅱ报道基因盒的载体中。这可通过用BamHⅠ和NcoⅠ消化SAM1克隆，并从琼脂糖凝胶中分离启动子片段来完成。将GUS载体用相同酶消化，然后从琼脂糖凝胶中分离，这样就去除了原初上游序列启动子。
然后用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，将SAM1启动子-GUS内含子-TpⅠ-Ⅱ报道基因盒从载体中切出，并从琼脂糖凝胶分离报道基因盒，再克隆到用BamHⅠ和EcoRⅠ消化的二元载体pMOG800中。将所得的二元载体pMOG1402导入根瘤土壤杆菌菌株EHA105中用于转化马铃薯。
实施例9Pc-SAM1嵌合启动子的构建以及与GUS基因的融合通过PCR获得拟南芥Col-0的质体蓝素增强子(Pc)。因此改进引物FR-Pc-146(5’agt ggt acc atc ata ata ctc atc ctc ctt ca3’)(SEQ ID NO14)和引物FR-Pc-247(5’cga agc ttt aca aat cta att tca tca cta aat cgg3’)(SEQID NO15)，在增强子的上游导入一个KpnⅠ限制性酶切位点，在质体蓝素增强子的下游导入一个HindⅢ限制性酶切位点。使用克隆的pfuDNA聚合酶(Stratagene)进行PCR反应，95℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，4分钟；共30个循环，以及95℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，10分钟，1个循环。使用KpnⅠ和HindⅢ将所得的PCR片段连接到高拷贝克隆载体中，产生了pPM15.1构建体。
将这个克隆用作PCR(95℃1分钟，50℃1分钟，70℃2分钟，共30个循环)的模板，引物为FR-Pc-145 5’GCT GCA ATA CAA ATC TAATTT CAT CAC TAA ATC GG3’(SEQ ID NO16)和FR-Pc-146 5’AGTGGT ACC ATC ATA ATA CTC ATC CTC CTT CTT 3’(SEQ ID NO14)。PCR产生了大约850bp的包含Pc增强子的片段(SEQ ID NO17)，它含有一个上游KpnⅠ位点，并与SAM1启动子的5’端相重叠(参见实施例8)。然后将PCR片段，与使用引物FR-Psam-143和FR-Psam-144并采用含有实施例8中所描述的调整过的SAM1之pBKS+克隆得到的SAM1启动子的PCR片段混合。用这个混合物，使用引物FR-Psam-144和FR-Psam-146经过PCR得到了PcSAM嵌合启动子。用KpnⅠ和NcoⅠ消化后，从琼脂糖凝胶中分离得到约1.3kb的启动子片段(SEQ IDNO18)，将它克隆到用相同酶消化的高拷贝克隆载体(pUC28)中。然后用BamHⅠ和NcoⅠ消化，将启动子片段从这个载体中切出，并克隆到实施例8中所描述的GUS内含子基因的前面。然后，如实施例8中所描述的SAM1-GUS-TPⅠ-Ⅱ报道基因盒那样，将完整的Pc-SAM-GUS-TPⅠ-Ⅱ报道基因盒克隆到pMOG800中。将所得pMOG1400二元载体导入根瘤土壤杆菌菌株EHA105中用于转化马铃薯。
实施例10Pc增强子-35S启动子的构建以及与GUS基因的融合通过PCR获得拟南芥Col-0的质体蓝素增强子(Pc)(参见上文)。
这个克隆用作PCR的模板(95℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，2分钟；共30个循环，此部分所描述的所有其它PCR反应都在相同的程序下进行)，所使用的引物是FR-Pc-291 5’GTC TTG TAC AAA TCTAAT TTC ATC ACT AAA TCG G 3’(SEQ ID NO19)和FR-Pc-146 5’AGT GGT ACC ATC ATA ATA CTC ATC CTC CTT C 3’(SEQ IDNO14)。PCR产生了大约850bp的包含Pc增强子的片段，它含有一个上游KpnⅠ位点，，并与基本35S启动子的5’端相重叠。基本35S启动子是用pMOG971作为模板(含有35S启动子以及ω5’UTR)并使用引物FR-35S-292 5’TTA GAT TTG TAC AAG ACC CTT CCT CTA TAT AAGG 3’(SEQ ID NO20)和ls19(SEQ ID NO21)而获得的。所得片段与Pc增强子重叠，并在翻译起始部位含有一个内部的NcoⅠ位点。然后将两个PCR片段混合，用引物FR-Pc-146和ls19进行PCR反应。用KpnⅠ和NcoⅠ消化所得片段，从琼脂糖凝胶中分离并将它克隆到用同种酶消化的pUC28中。随后，用BamHⅠ和NcoⅠ消化所得克隆，从琼脂糖凝胶中分离启动子片段(SEQ ID NO22)，并如实施例7中所描述克隆到GUS基因的上游。接着，将完整的报道基因盒导入如实施例7中所描述的二元载体pMOG800中。将所得pMOG1401二元载体导入根瘤土壤杆菌菌株EHA105中用于转化马铃薯。
实施例11体外生长的植物中的表达水平和方式培养转化的植物，并用完全再生的植物的叶片样品进行GUS表达分析。图4中显示了叶片叶肉、叶片维管系统、茎和根中的表达分析。尽管得分显示了GUS表达水平为0，在SAM1转基因植物叶片的叶肉部分却可观察到极低水平的GUS染色。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名Zeneca MOGEN(B)街道Einsteinweg 97(C)城市Leiden(E)国家荷兰(F)邮政编码2333CB(G)电话31-(0)71-5258282(H)传真31-(0)71-5221471(ⅱ)发明名称新组成型植物启动子(ⅲ)序列数目22(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型磁盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatnetIn Release#1.0 Version#1.25(EPO)(ⅵ)在先申请信息(A)申请号EP 97203912.7(B)申请日1997年12月12日(2)SEQ.ID.NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度520个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假拟非(ⅲ)反义否(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述GACTGAAGTG TGAAGGTGGA GATTATGTAT TCACTTGTTG ATTTGGTATA CATTCTATGT 60AAGGTTCAAT TATTTACGTT ATATAATTAT AATGGAGTAA TTTACAGTAA TTGGGTTAAA 120ATGGTTTGAT TCGGTCAGGT TGATACGGTT TGGAAGTTAA ACCCGGCCTA GATATGATGT 180TACAACCAGT CCATATCTTT TATGATTTTA GTGGAACAAA CGAAGAGTTA TTTAGACGAT 240ACAAACAAGG TCCGAATAAG TGTGAGCTGT CCCAAGTAAG ACCACGTAAT ACTCACCTCA 300ACAAGATAGT GTTCTTAAAG TGTGTCAAAC ACAATCACAC ACACACAAAT CATAAAACAC 360AAAGACGATA ATCCATCGAT CCACAGAATA GACGCCACGT GGTAGATAGG ATTCTCACTA 420AAAAGTTCTC ACCTTTTAAT CTTTCTCCAC GCCATTTCCA CAAGCCATAA TCCTCAAAAA 480TCTCAACTTT ATCTCCCAAA ACACAAATCT AGAAACCATG520(2)SEQ.ID.NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度300个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假拟非(ⅲ)反义否(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.2的序列描述CCCACTACAA TGAATTTGTT CGTGAACTAT TAGTTGCGGG CCTTGGCATC CGACTACCTC 60TGCGGCAATA TTATATTCCC TGGGCCCACC GTGAACCCAA TTTCGCCTAT TTATTCATTA 120CCCCCATTAA CATTGAAGTA GTCATGATGG GCCTGCAGCA CGTTGGTGAG GCTGGCACAA 180CTCATCCATA TACTTTCTGA CCGGATCGGC ACATTATTGT AGAAAACGCG GACCCACAGC 240GCACTTTCCA AAGCGGTGCC GCGTCAGAAT GCGCTGGCAG AAAAAAATTA ATCCAAAAGT 300(2)SEQ.ID.NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度840个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假拟非(ⅲ)反义否(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.3的序列描述GGATCCGAGC TTGCATGCCC CCACTACAAT GAATTTGTTC GTGAACTATT AGTTGCGGGC 60CTTGGCATCC GACTACCTCT GCGGCAATAT TATATTCCCT GGGCCCACCG TGAACCCAAT 120TTCGCCTATT TATTCATTAC CCCCATTAAC ATTGAAGTAG TCATGATGGG CCTGCAGCAC 180GTTGGTGAGG CTGGCACAAC TCATCCATAT ACTTTCTGAC CGGATCGGCA CATTATTGTA 240GAAAACGCGG ACCCACAGCG CACTTTCCAA AGCGGTGCCG CGTCAGAATG CGCTGGCAGA 300AAAAAATTAA TCCAAAAGTG ACTGAAGTGT GAAGGTGGAG ATTATGTATT CACTTGTTGA 360TTTGGTATAC ATTCTATGTA AGGTTCAATT ATTTACGTTA TATAATTATA ATGGAGTAAT 420TTACAGTAAT TGGGTTAAAA TGGTTTGATT CGGTCAGGTT GATACGGTTT GGAAGTTAAA 480CCCGGCCTAG ATATGATGTT ACAACCAGTC CACATCTTTT ATGATTTTAG TGGAACAAAC 540GAAGAGTTAT TTAGACGATA CAAACAAGGT CCGAATAAGT GTGAGCTGTC CCAAGTAAGA 600CCACGTAATA CTCACCTCAA CAAGATAGTG TTCTTAAAGT GTGTCAAACA CAATCACACA 660CACACAAATC ATAAAACACA AAGACGATAA TCCATCGATC CACAGAATAG ACGCCACGTG 720GTAGATAGGA TTCTCACTAA AAAGTTCTCA CCTTTTAATC TTTCTCCACG CCATTTCCAC 780AAGCCATAAT CCTCAAAAAT CTCAACTTTA TCTCCCAAAA CACAAATCTA GAAACCATGG 840(2)SEQ.ID.NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度477个碱基对
(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假拟非(ⅲ)反义否(ⅵ)初始来源(A)生物拟南芥(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.4的序列描述GGATCCTGCA GCGATTTCAT TTTAGATTCT CAAAAATATT CTCAGATGTG TGGGATTTGA 60GTAGAGTTTA TGTTGCGTTG GCATGATTTG AATAGTATGC AAGATTTTTG AGATTTTGCA 120TTCGTTCATG TGTGTATGTG TGATTGTAGC TTGATATGAT TTAACCTGTT AGTTAAATGT 180GCATAGACAA TAAGTAACAT ACGAAGCGAG TCACTAAGCA TAAGAGTCAA CTTGTTTTGC 240TGAAAAGATA TCACTTATGA TTTTCGAATC ATTTTAGCTT TTTTGTCACT TGAGCTTAAT 300GATTCTTCTG AAATTCGATT CTTTGTTTGG TTTATGTCAC ATTCTTTAGA ATTGAGAATC 360TAAGAAATGC TTACAGGATA TGGTGAAACT ATTCTTTTAA GATAGCATGA TGCTTCTTTT 420ATGATTCTAC AGTGGCTAAG TCATTTTTTT TTTGTTCTAT TCTTTGTAGC ACCATGG 477(2)SEQ.ID.NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.6的序列描述ATCTGGTCAC AGAGCTTGTC 20(2)SEQ.ID.NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.7的序列描述GTCTCCATGG TGCTACAAAG AATAG 25(2)SEQ.ID.NO.8的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.8的序列描述CGGGATCCTG CAGCGATTTC ATTTTAG27(2)SEQ.ID.NO.9的信息(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.9的序列描述ACATGAACGA ATGCAAAATC TC 22(2)SEQ.ID.NO.10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.10的序列描述AGATTTTGCA TTCGTTCATG TG 22(2)SEQ.ID.NO.11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.11的序列描述TGTAAGCATT TCTTAGATTC TC22(2)SEQ.ID.NO.12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.12的序列描述AAGAAATGCT TACAGGATAT GG 22(2)SEQ.ID.NO.13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.13的序列描述GACAAGCTTG ATCCCATGGT GCTACAAAGA ATAG 34(2)SEQ.ID.NO.14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.14的序列描述AGTGGTACCA TCATAATACT CATCCTCCTT C 31(2)SEQ.ID.NO.15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.15的序列描述CGAAGCTTTA CAAATCTAAT TTCATCACTA AATCGGA37(2)SEQ.ID.NO.16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.16的序列描述GCTGCAATAC AAATCTAATT TCATCACTAA ATCGG 35(2)SEQ.ID.NO.17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度876个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假拟非(ⅲ)反义否(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.17的序列描述ATCATAATAC TCATCCTCCT TCTCAAGGTT CGTACGTATT ATCAATATCT AGTATATACT 60TGTCTTTGTT CTATGCTTTA TATCATCATT TTATGACAAA AAATGATTAA GGTCTTAGTT 120AATGATTATG TATATGTGAA ACTTATATTT AGGGGCACAA TTTAATTTCG TATGATAATT 180GTCTAGTTAG CTTTATGTAC TTATCATAAA AACCTTAGTG TTTATCGCAA TACTTTTCAA 240ATATAGTGTA GAATCATAAT GGTCCCACTG TCATTATGTT TGATGCAAAT CTATTTGGAT 300TTTGTTGGAT AATAAACCGA TGACGTGGAC CAGACCAGTA GCTATAAGAT TTGGTTCACA 360TAGAAATTTT TTATAAGATA ATGTATCTAG GTTTGCTTAT GATTATACAT GTGATATTTA 420ATACATGGCA CAGGTTCGTC GAGTTTCACA GCCATAGGTA CAATAGAAGG CAAATTCGAT 480TGTGGTTATC TGGTAAAAGT TAAGTTGGGC TCAGAGATTC TTAACGGCGT TCTTTATCAT 540TCGGCCCAGC CCGGCCCATC ATCATCTCCA ACCGCTGTTC TAAACAATGC CGTTGTACCT 600TATGTTGAAA CTGGGAGGAG ACGGCGTCGT TTAGGTAAAA GACGAAGAAG CAGACGCAGA660GAAGATCCGA ATTACCCGAA ACCGAACCGG AGCGGTTACA ATTTCTTCTT TGCTGAGAAA720CATTGCAAGC TCAAATCACT TTATCCCAAC AAGGAGAGAG AGTTTACGAA ACTTATCGGA780GAATCGTGGA GCAATCTCTC TACCGAAGAA CGAATGGTAA CAAATTATCT TTTAAACCGT840TACCGATTTA GTGATGAAAT TAGATTTGTA GTAAAT 876(2)SEQ.ID.NO.18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1357个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假拟非(ⅲ)反义否(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.18的序列描述GGATCCCCGG GTACCATCAT AATACTCATC CTCCTTCTCA AGGTTCGTAC GTATTATCAA 60TATCTAGTAT ATACTTGTCT TTGTTCTATG CTTTATATCA TCATTTTATG ACAAAAAATG 120ATTAAGGTCT TAGTTAATGA TTATGTATAT GTGAAACTTA TATTTAGGGG CACAGTTTAA 180TTTCGTATGA TAATTGTCTA GTTAGCTTTA TGTACTTATC ATAAAAACCT TAGTGTTTAT 240CGCAATACTT TTCAAATATA GTGTAGAATC ATAATGGTCC CACTGTCATT ATGTTTGATG 300CAAATCTATT TGGATTTTGT TGGATAATAA ACCGATGACG TGGACCAGAC CAGTAGCTAT 360AAGATTTGGT TCACATAGAA ATTTTTTATA AGATAATGTA TCTAGGTTTG CTTATGATTA 420TACATGTGAT ATTTAATACA TGGCACAGGT TCGTCGAGTT TCACAGCCAT AGGTACAATA 480GAAGGCAAAT TCGATTGTGG TTATCTGGTA AAAGTTAAGT TGGGCTCAGA GATTCTTAAC 540GGCGTTCTTT ATCATTCGGC CCAGCCCGGC CCATCATCAT CTCCAACCGC TGTTCTAAAC 600AATGCCGTTG TACCTTATGT TGAAACTGGG AGGAGACGGC GTCGTTTAGG TAAAAGACGA 660AGAAGCAGAC GCAGAGAAGA TCCGAATTAC CCGAAACCGA ACCGGAGCGG TTACAATTTC 720TTCTTTGCTG AGAAACATTG CAAGCTCAAA TCACTTTATC CCAACAAGGA GAGAGAGTTT780ACGAAACTTA TCGGAGAATC GTGGAGCAAR CTCTCTACCG AAGAACGAAT GGTAACAAAT840TATCTTTTAA ACCGTTACCG ATTTAGTGAT GAAATTAGAT TTGTATTGCA GCGATTTCAT900TTTAGATTCT CAAAAATATT CTCAGATGTG TGGGATTTGA GTAGAGTTTA TGTTGCGTTG960GCATGATTTG AATAGTATGC AAGATTTTTG AGATTTTGCA TTCGTTCATG TGTGTATGTG1020TGATTGTAGC TTCATATGAT TTAACCTGTT AGTTAAATGT GCATAGACAA TAAGTAACAT1080ACGAAGCGAG TCACTAAGCA TAAGAGTCAA CTTGTTTTGC TGAAAAGATA TCACTTATGA1140TTTTCGAATC ATTTTAGCTT TTTTGTCACT TGAGCTTAAT GTTTCTTCTG AAATTCGATT1200CTTTGTTTGG TTTATGTCAC ATTCTTTAGA ATTGAGAATC TAAGAAATGC TTACAGGATA1260TGGTGAAACT ATTCTTTTAA GATAGCATGA TGCTTCTTTT ATGATTCTAC AGTGGCTAAG1320TCATTTTTTT TTTGTTCTAT TCTTTGTAGC ACCATGG 1357(2)SEQ.ID.NO.19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.19的序列描述GTCTTGTACA AATCTAATTT CATCACTAAA TCGG 34(2)SEQ.ID.NO.20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.20的序列描述TTAGATTTGT ACAAGACCCT TCCTCTATAT AAGG 34(2)SEQ.ID.NO.21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假拟非(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.21的序列描述TTCCCAGTCA CGACGTTGT 19(2)SEQ.ID.NO.22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1006个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假拟非(ⅲ)反义否(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.22的序列描述GGATCCCCGG GTACCATCAT AATACTCATC CTCCTTCTCA AGGTTCGTAC GTATTATCAA 60TATCTAGTAT ATACTTGTCT TTGTTCTATG CTTTATATCA TCATTTTATG ACAAAAAATG 120ATTAAGGTCT TAGTTAATGA TTATGTATAT GTGAAACTTA TATTTAGGGG CACAGTTTAA 180TTTCGTATGA TAATTGTCTA GTTAGCTTTA TGTACTTATC ATAAAAACCT TAGTGTTTAT 240CGCAATACTT TTCAAATATA GTGTAGAATC ATAATGGTCC CACTGTCATT ATGTTTGATG 300CAAATCTATT TGGATTTTGT TGGATAATAA ACCGATGACG TGGACCAGAC CAGTAGCTAT 360AAGATTTGGT TCACATAGAA ATTTTTTATA AGATAATGTA TCTAGGTTTG CTTATGATTA 420TACATGTGAT ATTTAATACA TGGCACAGGT TCGTCGAGTT TCACAGCCAT AGGTACAATA 480GAAGGCAAAT TCGATTGTGG TTATCTGGTA AAAGTTAAGT TGGGCTCAGA GATTCTTAAC 540GGCGTTCTTT ATCATTCGGC CCAGCCCGGC CCATCATCAT CTCCAACCGC TGTTCTAAAC 600AATGCCGTTG TACCTTATGT TGAAACTGGG AGGAGACGGC GTCGTTTAGG TAAAAGACGA 660AGAAGCAGAC GCAGAGAAGA TCCGAATTAC CCGAAACCGA ACCGGAGCGG TTACAATTTC 720TTCTTTGCTG AGAAACATTG CAAGCTCAAA TCACTTTATC CCAACAAGGA GAGAGAGTTT 780ACGAAACTTA TCGGAGAATC GTGGAGCAAT CTCTCTACCG AAGAACGAAT GGTAACAAAT 840TATCTTTTAA ACCGTTACCG ATTTAGTGAT GAAATTAGAT TTGTACAAGA CCCTTCCTCT 900ATATAAGGAA GTTCATTTCA TTTGGAGAGG ACACGTATTT TTACAACAAT TACCAACAAC 960AACAAACAAC AAACAACATT ACAATTACTA TTTACAATTA CCATGG 100权利要求
1．植物启动子，其特征在于它包括一种基本启动子以及来自一组启动子的转录激活元件，这些元件在植物中具有互补的转录方式和水平。
2．根据权利要求1所述的植物启动子，其特征在于每一个转录激活元件都不显示一种绝对的组织特异性，但能在大多数植物部位以大于或等于转录最为活跃的植物部位所达到水平的1％水平介导转录活性。
3．根据权利要求1或2所述的植物启动子，其特征在于一组启动子中的一种启动子在植物的绿色部位有特异活性，而另一种启动子则在植物的地下部分具有特异活性。
4．根据权利要求3的组成型植物启动子，其特征在于它是铁氧还蛋白启动子和RolD启动子的组合。
5．根据权利要求4的组成型植物启动子，其特征在于基本启动子元件来自铁氧还蛋白启动子。
6．根据权利要求4或5的组成型植物启动子，其特征在于铁氧还蛋白启动子来自拟南芥。
7．根据权利要求6的组成型植物启动子，其特征在于它包括SEQ IDNO1和SEQ ID NO2的序列。
8．根据权利要求7的组成型启动子，其特征在于它包括SEQ ID NO3的序列。
9．根据权利要求3的植物启动子，其特征在于它是质体蓝素启动子和S-腺苷-甲硫氨酸-1启动子的组合。
10．根据权利要求9的植物启动子，其特征在于基本启动子元件来自S-腺苷-甲硫氨酸-1启动子。
11．根据权利要求9或10的植物启动子，其特征在于质体蓝素启动子来自拟南芥。
12．根据权利要求9、10或11的植物启动子，其特征在于S-腺苷-甲硫氨酸-1启动子来自拟南芥。
13．根据权利要求12的植物启动子，其特征在于它包括SEQ ID NO4和SEQ ID NO17的序列。
14．根据权利要求13的植物启动子，其特征在于它包括SEQ ID NO21的序列。
15．用于植物中基因表达的嵌合基因构建体，其包括权利要求1-14中任一项的启动子。
全文摘要
本发明描述来自具有互补表达方式的一组启动子的元件所构建的新型启动子。
文档编号C12N15/09GK1285876SQ98813138
公开日2001年2月28日 申请日期1998年12月10日 优先权日1997年12月12日
发明者M·H·斯图维尔, F·H·希伯尔兹 申请人:杰尼克莫根有限公司