专利名称：一种5－烯醇丙酮酰－莽草酸－3－磷酸合成酶基因的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种基因合成方法，尤其涉及一种可应用于创制抗草甘膦的双子叶植物如油菜、大豆、棉花等以及抗草甘膦的单子叶植物如水稻、玉米、小麦等合成的基因的方法。
5-烯醇丙酮酰-草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)是芳香族氨基酸，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸合成过程的关键酶，存在于植物和细菌中。草甘膦是一种广谱、内吸、高效的灭生性除草剂，可以通过植物的韧皮部进行运输。它通过与该酶分子的结合，阻断这些氨基酸的生物合成，从而引起细胞死亡。
通过改变EPSPS蛋白一级结构可以阻碍草甘膦与酶分子的结合从而使其获得对草甘膦的抗性。沙门氏杆菌aroA结构基因(编码EPSPS)上101位的脯氨酸突变为丝氨酸后获得了对草甘膦的抗性(Comai，L.，Sen，L.C.，Stalker，D.M.，1983.An altered aroA gene product confers resistanceto the herbicide glyphosate.Science 221370-371)。从已有研究结果得知，目前所用的抗草甘膦EPSPS基因都是通过分子生物学手段直接从植物(包括油菜、矮牵牛、棉花、大豆等)或细菌(包括大肠杆菌和沙门氏杆菌)中克隆出来再转移到植物细胞中的。如，来自沙门氏杆菌的EPSPS基因导入了烟草(Comai，Letal.1985. Expression in plants of amutant aroA gene from Salmonella typhimuriumconfers tolerance to glyphosate.Nature 317741-744.)，来自大肠杆菌的EPSPS基因导入了烟草(Della-Cioppa，G.et al.1987.Targeting a herbicide-resistant enzyme from E.coli to chloroplasts ofhigher plants.Bio/Technology 5579-584.)，来自矮牵牛的EPSPS基因导入了矮牵牛(Shah，D.M et al.1986.Engineering herbicide tolerance in transgenicplants.Science 233478-481.)。美国孟山都(Monsanto)公司直接从抗草甘膦的变异植物细胞系中克隆出EPSPS基因，通过转基因技术将这种EPSPS基因导入植物中育成了抗草甘膦的大豆、棉花、油菜新品种，并将该项技术申请了专利(专利号5188642)。
相对于本发明而言，上述从生物体直接克隆EPSPS基因的方法有两点不足1、步骤多，程序复杂，耗时长。目前从生物体(尤其是植物体)中克隆基因的方法很多，如转座子标签技术、图位克隆技术等，但无论那种技术，所需的时间都很长，步骤相当繁琐。一般而言，克隆一个基因所需的时间要2-3年，而且花费也相当巨大。
2、基因本身没有经过密码子优化，因而使基因表达效率受到限制。通常，基因是一段有功能的DNA序列，而这段DNA序列就是由密码子组成的。基因在细胞内首先转录成信使RNA(即mRNA)，然后由mRNA再翻译成蛋白质。在此过程中，核糖体首先要识别mRNA，然后启动密码子的译读。因此，如果密码子不是该生物所偏爱的，则核糖体的识别效率就降低，因此影响到该基因的表达水平。
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种快速、经济，表达效率高的EPSPS基因设计合成方法。针对在背景技术中所谈到的直接从生物体中克隆基因的两点不足，利用本方法合成EPSPS基因可以大大节省时间，一般只需2个月左右，花费也大大降低；同时，因为经过对密码子的优化，可以预计，所合成的EPSPS基因将会有较高的表达效率。
本发明是这样实现的本发明主要介绍一种全新的人工设计EPSPS基因的方法原理以及用该方法获得的基因和基因序列。所合成的EPSPS基因是一杂合体基因，具有抗草甘膦的特征。它所编码的蛋白与信号肽以正确阅读框架相融合，后者可以将前者导入到植物细胞的叶绿体中。所合成的EPSPS基因可以在植物细胞和再生植株中进行表达，因而使植物细胞和再生植株获得对草甘膦的抗性。所述的植物包括单子叶植物如水稻、玉米、小麦等，以及双子叶植物如棉花、油菜、大豆等，但并仅限于上述植物。
从已有研究结果得知，目前所用的抗草甘膦EPSPS基因都是直接从植物(包括油菜、矮牵牛、棉花、大豆等)和细菌(包括大肠杆菌和沙门氏杆菌)中克隆出来的。本发明通过重新设计，综合了植物和细菌来源的EPSPS蛋白的不同结构域而构成一种EPSPS蛋白。
已有知识表明，编码氨基酸的密码子在不同生物体中的使用频率不同，表现在植物中G+C的含量较高，而其他生物体G+C含量较低。这种密码子的使用频率直接影响蛋白质表达水平的高低。为了使抗草甘膦EPSPS蛋白在植物中能够高效表达，将EPSPS基因序列中的密码子按照植物高效表达基因密码子使用偏向进行优化，第三位碱基G+C的含量提高到68.5％。
目前，获得基因的方法基本上可以分为两种，一种是从生物体中直接克隆，另外一种就是采用人工合成的方法。本发明所述的基因合成方法的特征是将DNA双链分成若干个寡核苷酸片段进行人工化学合成，然后使这些寡核苷酸片段退火，配对成为完整的双链DNA分子。
已有知识表明，有两条途径可以使植物获得对除草剂草甘膦的抗性。一种是使植物体内过量表达野生型EPSPS蛋白，另一种是使野生型EPSPS蛋白上与草甘膦结合的结构域发生改变，这样草甘膦对它就不能产生抑制作用。本发明根据已有知识，在EPSPS蛋白中引入点突变，使草甘膦对EPSPS蛋白不能产生抑制作用，因此，所述的EPSPS具有抗草甘膦的特征。
本发明中所述的EPSPS基因可以利用不同的转化方法转移至植物中，这些转化方法包括农杆菌介导法、花粉管通道法和基因枪法等。
EPSPS基因经过在核甘酸和蛋白水平上的修饰，重组。该基因的编码区是由分别来源于植物和微生物的DNA序列所组成的编码EPSPS蛋白的杂合体序列编码该酶的基因序列按照植物选择偏向进行了密码子优化。所述的EPSPS酶基因采用化学方法进行人工合成。所获得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶具有抗除草剂的特征。所获得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶可以在植物中合成。
本发明的效果在于由本方法合成的EPSPS基因在植物中具有更高的表达水平。如前面所解释的那样，由于在EPSPS基因的设计过程中，已经人为地针对该基因将来要转化的植物(包括水稻、玉米、油菜、大豆、棉花等)所偏爱使用的密码子进行优化改造，因此当该基因在植物细胞中进行表达时(与未经密码子优化的EPSPS基因相比)，所转录出的mRNA就会被核糖体高效转译，其结果是EPSPS蛋白就会在细胞中有较高的含量，从而对除草剂草甘膦具有较高水平的抗性。
以下根据附图对本发明的实施例加以详述
图1抗草甘膦基因序列及其编码的氨基酸序列，图2抗草甘膦基因片段的合成示意图，图3抗草甘膦基因CHEP-1的克隆如图1所示，图中上列表示编码EPSPS蛋白的核苷酸序列，共1505个碱基，其中最后两个密码子是终止密码子；下列表示所编码的氨基酸，共500个，以单字符表示。
如图2所示，将全长的EPSPS基因分成两部分，每一部分由26个寡核苷酸片段组成。这些寡核苷酸片段两两相互部分配对。
实施例例1 EPSPS基因的设计本实施例说明抗草甘膦基因的设计和基因本身的特征。所设计的基因全长1506bP，共编码500个氨基酸，3’端有2个终止密码子即TAA TGA。该基因是一杂合基因，1～71位氨基酸编码植物矮牵牛来源的信号肽，其作用是将其后面的成熟蛋白定向导入到植物的叶绿体中；72～99位氨基酸编码矮牵牛EPSPS蛋白N-端的一部分；100～227位氨基酸编码沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)EPSPS蛋白的一部分；228～500位氨基酸编码大肠杆菌(E.coli)EPSPS蛋白的一部分。为了使该基因能够在植物中高效表达，对基因序列中的密码子进行了优化，使第三位碱基G+C的含量达到68.5％。基因序列及所编码的氨基酸见图1。
例2 EPSPS基因的化学合成本实施例的目的是说明抗草甘膦基因CHEP-1的合成方法和过程。采用双链合成法。以第744位的碱基A为界，将整个基因分为AB两部分，A部分的5′端设计成NcoI的粘端，3′端设计成PstI的粘端；B部分的5′突出端为PstI，3′端为SalI的粘端。A部分的两条链共分为26个寡核苷酸片段，分别命名为A1……A26每个片段长度为60bP；B部分也作同样处理，各片段分别命名为B1……B26，用DNA自动合成仪合成完务寡核苷酸片段后，各取0.2μg在20μl反应体系中用T4 DNA激酶对其5′端进行磷酸标记，37℃标记反应30分钟后，将A1到A26按摩尔数比1∶1混合于另外一管，然后分别用酚/氯仿，氯仿将两种混合物抽提一次，加入1/10体积3mol/lNaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，-20℃放置30分钟，离心后将DNA溶于1/100的T4 DNA连接酶缓冲液中，共30μl。将两混合物在90℃水溶中保持5分钟，然后自然冷却至室温。这样，A1～A26混合物退火形成CHEP-1A，B1～B26混合物退火形成CHEP-1B(图2)。
例3 EPSPS基因的克隆将质粒pUCNH用限制性内切酶NcoI和PstI酶切，然后回收，将回收的DNA溶于水中，定量后，与片段CHEP-1A按摩尔数比1∶3混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，并鉴定挑选阳性重组子。将该阳性重组子用PstI和SalI酶切后，将片段CHEP-1B插入到这两个位点之间，就得到了含有完整基因CHEP-1的重组质粒，pCHEP-1(图3)。
权利要求
1.一种全新的合成5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的方法，其特征在于该基因经过在核苷酸和蛋白质水平上的修饰、重组。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所说的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因，该基因的编码区是由分别来源于植物和微生物的DNA序列所组成的编码EPSPS蛋白的杂合体序列；编码该酶的基因序列按照植物选择偏向进行了密码子优化。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因采用化学方法进行人工合成。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所获得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶具有抗除草剂草甘膦的特征。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所获得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶可以在植物中合成。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所说的植物包括双子叶植物如棉花、大豆、油菜，以及单子叶植物如玉米、水稻、小麦。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物被转化的方法可以是农杆菌介导法、花粉管通道法和基因枪法等。
全文摘要
一种5－烯醇丙酮酰—莽草酸－3－磷酸合成酶(EPSPS)基因的合成方法,包括基因的设计合成、基因序列和基因克隆。所合成的基因可应用于创制抗草甘膦的双子叶植物如油菜、大豆、棉花等,以及抗草甘膦的单子叶植物如水稻、玉米、小麦等。
文档编号C12N15/10GK1268572SQ9910347
公开日2000年10月4日 申请日期1999年3月31日 优先权日1999年3月31日
发明者赵军, 范云六, 张春义 申请人:中国农业科学院生物技术研究中心