] 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘W稀释倍数报告之。
[0134] 如果有两个稀释度，其生长的菌落数都在30-300之间，视两者的比值来确定，如果 其比值小于2,应报告其平均数;如果小于2,则报告其中较小的数字。
[0135] 如果所有的稀释度平均菌落数均大于300,则应按照稀释度最高的平均菌落数乘 W稀释倍数报告。
[0136] 如果所有的稀释度平均菌落数均小于30,则应按照稀释度最低的平均菌落数乘W 稀释倍数报告。
[0137] 如所有稀释度均无菌落生长，则W小于1乘W最低稀释倍数报告之。
[0138] 如所有稀释度平均菌落数均不在30-300之间，其中一大部分大于300或小于30时， 则W最接近300或30的平均菌落数乘W稀释倍数报告之。
[0139] (6)结果报告
[0140] 菌落在IOOW内时，按其实有数报告;大于100时，采用两位有效数字，其后面数值， W四舍五入的方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可采用10的指数来表示。
[0141] 6、计算公式
[0142] X=AXlOB
[0143] 其中；
[0144] X--每毫升样品中益生菌落数
[0145] A------最终计数的菌落总数
[0146] B-------稀释倍数
[0147] 二、检验结果见表3:
[0148] 表3检验结果
[0150] 实施例6青金枯酵素功效试验：
[0151] -、抗氧化功能试验
[0152] 1.材料与方法
[0153] 1.1实验材料与仪器
[0154] D-半乳糖（Sigma,美国），青金枯酵素（海南南派实业有限公司，中国，产品批号： 151006)。
[0155] 蛋白质幾基(PC)试剂盒(A087)、还原性谷脫甘肤(GSH)试剂盒(A006-1)、丙二醒 (MDA)试剂盒(A003-1)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(AOOl-I)，总蛋白定量试剂盒(AS045- 2)(南京建成生物研究所，中国）。
[0156] 冷冻离屯、机;二氧化碳培养箱;pro型多功能酶标仪;饮水瓶，灌胃针，动物电子砰， 手术剪，眼科綴，高压灭菌锅，水浴锅;振荡培养箱。
[0157] 2.动物与实验方法
[0158] 雄性小鼠，年龄3-4个月大，体重25-30邑。
[0159] 3.实验分组
[0160] 实验前，小鼠适应性饲养一周。将小鼠随机分为5组，每组10只：
[0161] ①正常组(n = 10):给予正常饮食，小鼠颈背部注射生理盐水(0.1 mL/lOg)，连续注 射72天，第43天开始灌胃给予生理盐水(20mL/kg)，灌胃30天。
[0162] ②模型组(n=10):小鼠颈背部注射D-半乳糖(D-半乳糖浓度，注射剂量= 400mg/ kg，0.1mL/10g)，连续注射72天，第43天开始灌胃给予生理盐水(20mL/kg)，灌胃30天。
[0163] ③试验组(n=10):小鼠颈背部注射D-半乳糖(D-半乳糖浓度，注射剂量= 400mg/ 4邑，0.11111710肖），连续注射72天，第43天开始灌胃给予实施例1制备的青金枯酵素（3011117 kg)，灌胃30天。
[0164] 4.实验方法
[0165] 小鼠末次给药Ih后处死动物，取肝脏和血清，分别根据试剂盒方法测定血清中MDA 含量、GSH含量、SOD活力W及肝脏中PC含量。
[0166]判定标准:MDA、PC、SOD、GSH四项指标中S项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能 动物实验结果阳性。
[0167] 5.数据处理
[0168] 试验数据采用方差分析进行统计处理。p<0.05为差异显著，有统计学意义。
[0169] 6.试验结果及分析见表4:
[0170] 表4青金枯酵素对小鼠体重增重和脾指数的影响
[0172] 冲<0.05。与模型组相比。
[0173] 研究表明，D-半乳糖会引起活性氧的积累，导致氧化应激、减少寿命。在D-半乳糖 诱导的小鼠实验中，给予青金枯酵素后，上调了脾指数，提高了机体抗氧化水平。
[0174] 表5青金枯酵素对D-半乳糖氧化损伤小鼠 MDA，GSH，PC含量和SOD酶活力的影响
[0176] 冲<0.05,与模型组相比。
[0177] 考察了酵素对小鼠机体的抗氧化功能的影响，试验结果表明，青金枯酵素可W显 著下调小鼠血清丙二醒和肝脏中蛋白质幾基水平，上调小鼠血清中谷脫甘肤和超氧化物歧 化酶的水平，青金枯酵素具有显著的抗氧化功能。
[0178] 取实施例2、实施例3制备的青金枯酵素进行上述试验，试验结果与实施例1制备的 青金枯酵素的结果无显著差异(P>〇.05)。表明本发明制备的青金枯酵素具有抗氧化功能。
[0179] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种青金桔酵素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1:取青金桔打浆收集浆液;取所述浆液与β-环糊精混合脱苦脱涩； 步骤2:取步骤1制得的脱苦脱涩后的浆液经均质、过滤，收集滤液； 步骤3:取步骤2制得的所述滤液加热、降温，制得发酵原液； 步骤4:取乳酸菌制得发酵菌种； 步骤5:将步骤4制得的发酵菌种接种至步骤3制得的发酵原液中，初步发酵，收集发酵 液，澄清、后续发酵。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述接种的接种量为步骤3制 得的发酵原液质量的〇. 5 %~5 %。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤4制得的发酵菌种的活菌数至 少为106个/mL。4. 根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述初步发酵的温 度为25°C~35°C，所述初步发酵的时间为5~60d。5. 根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述初步发酵的温 度为25°C~35°C，所述初步发酵的时间为5~60d。6. 根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述澄清为 8000rpm离心6 ~lOmin。7. 根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4具体为将乳酸菌接种 0.5 %~5 %至灭菌的20 %蔗糖溶液中于25 °C~35 °C恒温培养，制得发酵菌种。8. 根据权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述加热的温度为 60°C，所述加热的时间为5min~lOmin;所述降温至25°C~35°C。9. 根据权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述浆液与β-环糊 精的质量比为100: (〇. 01~〇. 05);所述混合的时间为5min~20min; 步骤2中所述过滤为经40~100目的筛网进行过滤。10. 根据权利要求1至9任一项所述的制备方法制得的青金桔酵素。11. 根据权利要求10所述的青金桔酵素在制备抗氧化、平衡内分泌、活化细胞、美容养 颜、增强身体抵抗力的药物、食品和/或保健品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种青金桔酵素及其制备方法、用途。采用青金桔为原料进行无糖发酵，即青金桔洗净，打浆，灭菌，接入乳酸菌进行无氧发酵，发酵过程分两步，分别为前发酵和后发酵，经过两步发酵后，青金桔酵素口感更加醇厚，产品含有大量的益生菌，具有抗氧化等功效，青金桔酵素加工过程中采用低温加工技术，此加工温度可保证青金桔的营养成分不流失，更保证了青金桔酵素口感的纯正。本发明的青金桔酵素可作为食品及保健品。
【IPC分类】A23L33/135, A23L19/00
【公开号】CN105661548
【申请号】CN201610209645
【发明人】潘成立, 梁海燕
【申请人】海南南派实业有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月5日