专利名称：降眼压类脂类的制作方法
背景技术：
1、发明领域本发明涉及降眼压类脂类。更具体地说，本发明涉及PGF2α1-乙醇酰胺及相关化合物，并涉及含这些化合物的药物组合物，以及用这些化合物降低哺乳动物眼内压的方法。
2、现有技术简述现有技术已充分了解许多降眼压药剂，用它们治疗各种眼高压症状，包括代表严重的人类健康问题的原发性和续发性青光眼。治疗眼高压(青光眼)所用的药包括β-肾上腺素能受体拮抗剂和各种前列腺素。有着大量有关前列腺素及其在治疗眼高压中的应用的科学及专利文献。例如见Bito，L.Z.的“前列腺素的生物保护作用”(BiologicalProtection with Prostaglandins)，Cohen，M.M.编，BocaRaton.Fla.，CRC出版公司，1985，231-252页；以及Bito，L.Z.的“青光眼医疗中的应用药物学”，Drance，S.M.和Neufeld，A.H.编，纽约，Grune & Stratton，1984，477-505页。
US 5,288,754包括针对前列腺素及相关衍生物具体的现有技术的进一步引文，前列腺素和其相关衍生物作为降低哺乳动物眼内压的药剂是有效的。US 5,288,754本身描述了“极性的前列腺素C-1酯类”，包括称为PGF2α的羧酸化合物C-1酰胺类和C-1取代酰胺类。相关于PGF2α的另外的前列腺素衍生物以下式表示并以任取号码“现有技术化合物1号”和“现有技术化合物2号”标明，这些衍生物出现于以本申请社团受让人研究设备进行的现有技术研究中并显示强烈的降眼内压活性。现有技术化合物1号在US 5,352,708、5,607,978和5,688,819中作了描述，而现有技术化合物2号在US 5,545,665中作了描述。 现有技术化合物1号 现有技术化合物2号绝大多数具有前列腺素相关(或密切相关)结构的降眼压药通过已知的“前列腺素”受体起作用。特别是，PGF2α化合物已知通过称为FP的受体发挥其降眼压作用。所谓“FP受体”意思是一种人类的前列腺素受体，如Abramovitz等在生物化学杂志2692632(1994)中所公开的，特此于本文中引入作为参考。PGF2α的结构，包括用于前列腺素及相关化合物命名法中的习惯编号，如下所示。 本发明针对一类涉及PGF2α1-乙醇酰胺的化合物，已令人惊奇地发现此类化合物同现有技术化合物1号和2号一起，可作为具有强烈降眼压活性的药剂，但此药剂并不通过FP受体也不通过迄今已认知的任何前列腺素受体如DP、EP、EP2、EP3、EP4、FP、IP和TP发挥其降眼压效应。
发明概述本发明涉及式1化合物类，其中虚线表示没有键或有一个其条件为在式中没有两个相邻双键的键；波纹线附着基表示α(向下)或β(向上)构型，在附着于双键的波纹线处它们表示Z(顺式)或E(反式)构型；影线指示α构型，实心三角形指示β构型；m是0至5的整数；n是1至6的整数，条件是以该式表示的化合物不是PGF2α1-乙醇酰胺；q和r各自是0至6的整数；X是CH2、O或S，条件是，当X是O或S时，邻接于X的虚线表示没有键；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的环烷基，或者是以一或二个取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基则选自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6个碳；R1、R2、R3和R4各自表示氢、1至6碳的直链或支链烷酰基、苯甲酰基或1至6碳低级烷基；R5是氢或1至6碳的直链或支链烷基；以及R6是氢、1至4碳的直链或支链烷基或者是该化合物的药物学上可接受的盐，所说的化合物对哺乳动物的眼具有降低眼内压活性，但不通过FP前列腺素受体也不通过任何迄今已认知的前列腺素受体发挥其降眼压活性。 式1本发明也涉及分离出的基本纯的PGF2α1-乙醇酰胺，已令人惊奇地发现它作为天然产物存在于某些生物体系中。而且，本发明针对含有PGF2α1-乙醇酰胺和/或一种或更多种式1的化合物作为活性组分的药物组合物，并涉及为降低眼内压而使用有效量的该药物组合物治疗需要治疗的哺乳动物包括人类的方法。
附图简述
图1表明PGF2α1-乙醇酰胺的分级剂量对猫的虹膜括约肌平滑肌的影响。各点为平均值±SEM；n＝4。
图2表明PGF2α1-乙醇酰胺的分级剂量对离体的豚鼠输精管电场刺激收缩的抑制效应。各点为平均值±SEM；n＝4。
图3表明PGF2α1-乙醇酰胺的分级剂量对离体的小鸡回肠的影响。各点为平均值±SEM；n＝4。
图4表明PGF2α1-乙醇酰胺的分级剂量对离体的豚鼠回肠的影响。各点为平均值±SEM；n＝4。
图5表明PGF2α1-乙醇酰胺的分级剂量对离体的大鼠主动脉平滑肌的影响。各点为平均值±SEM；n＝4。
图6表明PGF2α(■)和PGF2α1-乙醇酰胺(●)在CRL1497细胞中的分级剂量产生的细胞内Ca2+浓度[Ca2+]i的增量。各点为平均值±SEM；n＝4。
图7表明前列腺素F2α1-乙醇酰胺(●)和前列腺素F2α(■)对组胺预收缩的兔颈静脉片段的血管舒张效应。各点为平均值±SEM；对PGF2α1-乙醇酰胺，n＝6，对PGF2α，n＝7。
图8表明PGF2α(■)和PGF2α1-乙醇酰胺(●)在以重组猫FP受体稳定转染的HEK-293细胞中的分级剂量产生的细胞内Ca2+浓度[Ca2+]i的增量。各点为平均值±SEM；n＝3。
图9表明17-苯基前列腺素F2α(▲)和前列腺素F2α1-乙醇酰胺(●)在以重组猫FP受体稳定转染的HEK-293细胞中分级剂量产生的磷酸肌醇酯总积累。各数值为平均值±SEM。N＝3。
图10表明17-苯基前列腺素F2α(▲)和前列腺素F2α1-乙醇酰胺(●)在以重组人FP受体稳定转染的HEK-293细胞中分级剂量产生的磷酸肌醇酯总积累。各数值为平均值±SEM。n＝3。
图11表明使用以重组猫FP受体稳定转染的HEK-293细胞对5nM3H-17-苯基PGF2α的放射配体结合竞争作用研究。画出了由未标记的PGF2α1-乙醇酰胺(●)和未标记的17-苯基PGF2α(▲)提供的竞争反应图。各点是平均值±SEM；重复三次实验的n＝3。
图12表明使用以重组人FP受体稳定转染的HEK-293细胞对5nM3H-17-苯基PGF2α的放射配体结合竞争作用研究。画出了由未标记的PGF2α1-乙醇酰胺(●)和未标记的17-苯基PGF2α(▲)提供的竞争反应图。各点是平均值±SEM；重复三次实验的n＝3。
图13表明0.1％PGF2α1-乙醇酰胺(●)对狗眼内压的影响。对侧的眼睛接受赋形剂(○)作为对照。各点是平均值±SEM；n＝6。
图14表明0.1％PGF2α1-乙醇酰胺(●)对狗瞳孔直径的影响。对侧的眼睛接受赋形剂(○)作为对照。各点是平均值±SEM；n＝6。
图15表明PGF2α1-乙醇酰胺(●)对狗眼表充血的影响。对侧的眼睛接受赋形剂(○)作为对照。各点是平均值±SEM；n＝6。
发明详述与本发明相关连，令人惊奇地发现，PGF2α1-乙醇酰胺是一种天然物质，它可以由天然拟大麻的花生四烯乙醇胺，通过重组体COX-2和PGF合酶形成。已知COX-2(环-(加)氧酶-2)是一种前列腺素桥过氧化物合酶，它可以诱发而且在组织中基本不存在(参见Meade等，(1993)生物化学杂志，2686610-6614)。由于不能指望COX-2在未受刺激的组织中存在，与本发明相关连的发现，即对首次实验的鼠给以anandamide后产生了大量PGF2α乙醇酰胺是预想不到的结果。而且，令人惊奇地是，在未接受anandamide的鼠中也检测到了PGF2α乙醇酰胺，提示PGF2α1-乙醇酰胺是体内组成要素，并可以表现为一种内源合成激素。
按本发明，合成了PGF2α1-乙醇酰胺，以分离出的基本纯的形式提供了这一物质，并能配制含此物质的药物组合物。PGF2α乙醇酰胺的合成也使得使用在合成过程中唯一的这种改良来合成所有在式1范围内化合物成为可能，这样的合成对实验有机化学家来说是易于做到的，特别对工作在前列腺素及相关化学领域的化学家更是如此。因此，本发明涵盖式1化合物。 式1a在本发明范围内优选的化合物以式1a表示，具体优选的是在式1a范围内的化合物，其中碳10和11、8和12及17和18之间的虚线表示没有键，而碳5和6之间则表示有一个键。此外，涉及到式1a或式1化合物羟基官能团的取代(R1至R4基)，则优选一个或更多个羟基官能团未酯化也未烷基化(一个或更多个R1至R4是H)的化合物，或者酯化时，酯化基是1至6个碳的烷酰基(甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基或任何3至6个碳的支链烷酰基)。涉及到式1a或式1中R5选定的取代基，优选化合物的R5是氢或1至3个碳的低级烷基，更优选氢。R6优选氢，或1至3个碳的低级烷基，更优选氢，n优选2。
涉及式1a和式1的还有，OR1、OR2和OR3的构型优选α(C-9、C-11和C-15α)，而5-6双键的构型优选Z(顺式)。
按本发明，最优选的化合物是以式2表示的PGF2α1-乙醇酰胺及其酰化或烷基化衍生物，其中R1至R4定义为与式1相关连，但酰化衍生物比烷基化的更受优选。 式2PGF2α1-乙醇酰胺＝R1＝R2＝R3＝R4＝H本发明化合物的合成以示于反应图式1的PGF2α1-乙醇酰胺的合成为例来说明，并在以下实验详情中公开。现在谈一下反应图式，市场上可购得的PGF2α羧酸的三乙醇胺(三甲醇氨基甲烷)盐用酸处理得游离羧酸。游离的PGF2α羧酸在酸受体(优选1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯)存在下用甲基化试剂(优选碘代甲烷)处理，转化为PGF2α甲酯。此后，PGF2α甲酯用乙醇胺处理，得到PGF2α1-乙醇酰胺。这样，在PGF2α甲酯和式3的羟烷基胺衍生物的反应中将完整的“酰胺”结构引入分子，式中R5、R6和n像与式1相关连那样定义，而当R5、R6为氢和n为2时，式3表示乙醇胺。式3的羟烷基胺可根据化学文献制得，而且完全在实验有机化学家的技艺之中。式1中一个或更多个虚线表示一个键，和/或羟基构型，或在一个或更多个双键周围的取代基构型不同于PGF2α1-乙醇酰胺的一些化合物可以通过类似于反应图式1所示的一些反应来获得，但要由适当的相应结构与立体化学的前列腺素衍生物C-1羧酸开始合成。这些起始化合物可按化学文献制得，而且在实验有机化学家的技艺之中。式1中一个或更多个R1至R4基不是氢的化合物，即C-9、C-11、C-15中一个或更多个，以及酰胺部分中羟烷基结构的羟基酯化或烷基化的化合物可以由“游离羟基”化合物经酯化或烷基化反应而获得。一般来说。式1化合物α和ω侧链的修饰如同相关于该式的定义一样，在实验有机化学家的技艺之中，按照或类似于US 5,545,665，5,834,498和5,352,708中的公开内容，这些专利的说明书特地引入本文作为参考。 PGF2三甲醇氨基甲烷基 游离的PGF2羧酸 PGF2甲酯 PGF2 1-乙醇酰胺R5＝H；R6＝H；n＝2反应方式1生物活性本发明化合物是独特的，其独特在于，它们是有效力的降眼压药然而不通过FP受体起作用。这种情况用许多检定方法作了证实，在确定降低眼内压活性及确定化合物通过其作用的受体的领域中完全认可这些方法。当PGF2α1-乙醇酰胺的生物特征与“母体”化合物PGF2α相比较时，其降低眼内压活性以及其在许多探查FP或其它已知前列腺素受体活性的检定中实际上的惰性特别引入注目并令人惊奇。
在下文中提供生物检定的描述及检定结果。
方法离体组织研究用力位移转换仪(Grass FT-03)等比例地测量离体组织的平滑肌张力并在Grass多导描记器(7G型和79E型)上记录。盛装Krebs液的器官浴保持在37℃并供以95％O2/5％CO2气使pH为7.4。Krebs液具有下列组成(mM)NaCl，118.0；KCl，4.7；KH2PO4，1.2；CaCl2，1.9；MgSO4，1.18；NaHCO3，25.0；葡萄糖，11.7；消炎痛，0.001。(a)猫虹膜成年家猫静脉注射过量戊巴比妥钠(Anthony，Arcaia，CA)致死，立即剜出眼睛并置于冰上。虹膜括约肌在50至100mg张力下垂直安放在加套的10ml器官浴中。开始每一次实验前要使其稳定60分钟。活性作为收缩性反应而测定。将化合物以累加方式加入器官浴中并在完全清洗后使之恢复至少30分钟，回到基线张力。在各次实验的开始和终了以及剂量-反应曲线间测定10-7M PGF2α的反应作为参照。在每件组织上检验的化合物不多于两个。(b)大鼠主动脉重180-220g的成年Sprague Dawley鼠使吸入CO2麻醉，然后断头并除去血。取出胸主动脉，清除掉任何粘附的组织。脉管用水冲洗除去所有血污。主动脉分割为5-8mm长的三个小段。每段用两只金属丝钩穿过脉管在2g张力下安放在加套的10ml器官浴中。这样的安放方式使得可以测量由环状平滑肌发出的收缩力。在以累加方式将化合物加入器官浴之前要让组织平衡1小时。在各次实验的开始和终了，测定对10-7M U-46619(一种拟血栓素)的反应作为参照。完全清洗掉药物后，使之有30-45分钟恢复时间。每件组织上只检查一个试验化合物。(c)小鸡回肠小鸡回肠是一种EP3受体标本。1.5cm长的小鸡回肠在1g张力下悬吊着。经1小时平衡期后，以非累加方式及各单个剂量间用30分钟清洗时间，取得PGE2的标准剂量-响应曲线。随后，以非累加方式加入试验化合物。最后给予最大剂量的PGE2(10-6M)作为第二级参照标准。然后计算各浓度的收缩活性作为达到10-6M浓度的最大PGE2反应的％数。(d)豚鼠回肠豚鼠回肠是一种EP1受体标本。约1.5cm豚鼠回肠段在1g张力下悬吊在加套的器官浴中。在1小时平衡周期后，获得PGE2的清洗剂量响应曲线。在各剂量之间要有30分钟清洗期间。然后以相同方式产生PGF2α1-乙醇酰胺的剂量反应曲线。最后给予PGE210-6M作为参照。数据以最大值PGE2响应的％数表示。(e)豚鼠输精管对前列腺素敏感的EP3受体亚型的活性也以前列腺素类化合物抑制由电流在离体豚鼠输精管中刺激平滑肌抽搐反应的能力而测定。1.5cm份额的豚鼠输精管在1g起始张力下悬吊并使之平衡至少30分钟。然后使组织经受每30秒20伏电脉冲的刺激。在抽搐反应稳定后，以累加方式完成对PGE2的标准剂量反应曲线。然后通过完成累加剂量的反应曲线来评估试验化合物。在各化合物之间要清洗组织并使之平衡1小时。在实验结尾再次评估PGE2作为标准参照。活性计算为肌肉抽搐反应高度的百分抑制率。(f)兔颈静脉重2-4kg的任何性别的新西兰白化体兔，将1000U肝素注入其耳缘静脉，然后用CO2气致死。清出外颈静脉的脂肪和粘附的连接组织并除去。横切静脉，每个环为3-4mm长，悬吊在加套器官浴中两个金属钩之间。此组织在0.75g张力下平衡1小时，它被再调整为舒张组织。给予10-5M然后2-3×10-6M的单剂量组胺使组织收缩并建立反应度，每次投药后要用水洗涤。以5分钟加入10-6M的TP-受体拮抗剂SQ29548(0gletree等，(1985)药理学实验与理论杂志234435-441)，然后加入2-3×10-6M组胺以引起收缩反应。在用组胺作30分钟预处理后，通过加入累加剂量的试验化合物检验舒张反应，在各剂量-反应曲线结尾用10-8至10-7M的PGE2作为参照。在清洗组织后要有30-50分钟恢复周期。舒张活性计算为组胺引起的参照伸缩性的百分数。(g)人血小板前列腺素类化合物在DP-、TP-和IP-受体型上的活性通过引起体外的人血小板聚集(TP-受体活性)或抑制ADP诱发的聚集(DP-和IP-受体活性)的能力而测定。由同意的健康人志愿者得到新鲜全血，与酸性柠檬酸右旋糖酯(ACD)混合。血液以1000rpm离心15-20分钟，得到富血小板血浆(PRP)。4.5μl前列腺素类化合物或赋形剂加入到450μlPRP中并在Payton集合度计中在37℃保温2分钟，观察聚集活性。然后加入2×10-5M ADP(最终浓度)诱发完全聚集。聚集的抑制作用计算为用2×10-5M ADP在不存在和存在药物之下引起的聚集之间的百分差别。聚集活性计算为前列腺素类化合物诱发的聚集相对于2×10-5M ADP诱发的聚集的百分数。在各次实验的开始和结尾单独对2×10-5M ADP进行标准聚集反应。(h)CRL1497细胞Ca2+信号人CRL1497细胞接种在培养瓶中并加进含有10％胎牛血清、2mM 1-谷氨酰胺和0.05mg/ml硫酸庆大霉素(这些都从Gibco，GrandIsland，NY购来)的Dulbecco的改良Eagle介质(DMEM)。细胞培养保持在增湿的95％空气、5％CO2的气氛中并生长至汇合。通过在Hanks平衡盐溶液(HBSS，Gibco，GrandIsland，NY)中用胰蛋白酶0.05％/0.53mM EDTA在37℃处理约1分钟，由培养瓶中移出细胞。分解蛋白的活性以在DMEM中加5ml 10％的胎牛血清来抑制。细胞顺序地在Hank的BSS和含有140mM NaCl、50mM KCl、1mM MgCl2、1.5mM CaCl2、10mM HEPESTRIS、5mM葡萄糖、5mM丙酮酸钠、0.1％牛血清清蛋白，pH为7.4的介质中洗涤。洗涤物的离心分离在室温以200g进行15分钟。细胞计数，再悬浮在上述介质中并在37℃与2×10-6M Fura2/乙酸基甲酯一起在摆动水浴中保温30分钟。随后，细胞在如上述的介质中洗涤，并以2×106细胞ml-1的浓度再悬浮。然后将等分为0.5ml一份的细胞悬浮液加入autocap microtube，对每次实验测定细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)提供106个细胞。
在Perkin-Elmer LS-5荧光分光光度计中以激发与发射波长分别为340和492nm，二者狭缝均为10nm测量荧光。对于各次实验测定，106个细胞要洗涤(200×g，5分钟)并用含120mM NaCl、6mM KCl、1mM MgSO4、1.5mM CaCl2、20mM HEPES、1mg ml-1葡萄糖和1mgml-1丙酮酸钠的缓冲液悬浮在2ml的液槽中。温度保持在37℃，用装在槽顶的浆式搅拌机完成搅拌。用毛地黄皂苷(10μl的100mg ml1DMSO溶液)松解(或“溶解”)细胞以获得fmax。然后，连续加入EGTA(100mM)和足够的10N NaOH，调节pH至8.5以获得fmin。(i)重组的猫和人FP受体；稳定的转染子
HEK-293细胞在具有10％胎牛血清(FBS)、250μg ml-1G418(“生物技术”)和200μg ml-1庆大霉素或青霉素/链霉素的DMEM中生长。稳定转染子的选择以200μg ml-1的潮霉素来达到，最适宜浓度通过潮霉素杀伤曲线研究来确定。
就转染作用而言，在10cm平皿上，细胞生长至50-60％汇合。结合了人FP受体cDNA插入片段的质粒pCEP4(20μg)加入到500μl的250mM CaCl2中。然后将HEPES缓冲盐水×2(2×HBSS、280mM NaCl、20mM HEPES酸、1.5mM Na2HPO4，pH7.05-7.12)在室温下以滴加方式连续涡旋地加入至总量为500μl。30分钟后，9ml DMEM加入混合物。然后将DNA/DMEM/磷酸钙混合物加到此前已用10毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)涮洗过的细胞中。再后将细胞在37℃、增湿的95％空气/5％CO2中保温5小时。接着除掉磷酸钙溶液，细胞用10％甘油在DMEM中的溶液处理2分钟。然后甘油溶液用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM置换。细胞保温过夜，介质用含有250μg ml-1G418和青霉素/链霉素的DMEM/10％FBS置换。第二天加入潮霉素B至最终浓度为200μg ml-1。
转染之后十天，选出各个耐潮霉素B的克隆系并转移到24孔平皿上的不相连孔中。在汇合时，各克隆转移到6孔平皿的一个孔中，然后在10cm培养皿中扩展。细胞直至使用前均保持在连续的潮霉素选择之下。
以类似方法用脂质转染胺试剂制备稳定的猫FP受体转染子。细胞也在10cm平皿上生长至50-60％汇合，结合了猫FP受体cDNA插入片段的质粒pCEP4用脂质转染试剂转染。转染后48小时开始潮霉素选择。转染后8天，选出耐潮霉素B的克隆系并转移到24孔平皿上。
对重组猫和人FP受体的Ca2+信号研究以相同于已描述的CRL1497细胞研究的方式进行。(j)磷酸肌醇酯的形成受体媒介的磷酸肌醇(PI)水解通过测量与3H-肌醇一起预保温的细胞中总磷酸肌醇酯(IP)的积累量而测定。表达人或猫FP受体的HEK293细胞的稳定细胞株接种在10cm培养皿中(每皿106个细胞，在含有10％FBS的DMEM中)。第二天，细胞在37℃下与在6ml含10％FBS的DMEM中的18μCi[23H]肌醇(Amersham；10-20μCi mmol-1)混在一起保温24小时。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)涮洗细胞两次，细胞与1ml胰蛋白酶-EDTA一起培养5分钟，而后悬浮在10ml含25mM HEPES缓冲液的DMEM中。在1000rpm下，细胞群形成小团并再悬浮于含10mM LiCl的DMEM/25mM HEPES中10分钟。等分为200μl一份的细胞悬浮液连同50μl药物在37℃保温30分钟(双份测定)，而后用750μl氯仿∶甲醇∶4N HCl(100∶200∶2)的混合物终止兴奋剂刺激作用，接着加250μl氯仿和0.5N HCl抽提磷酸肌醇酯。750μl体积的水层装入以0.5ml Dowex AG1-X8阴离子交换树脂(甲酸形式，100-200目，BioRad)充填的柱上以分离出放射标记的组分。洗脱程序由3次3ml含5mM肌醇的水洗，然后以750μl含0.1M甲酸的1.3M甲酸铵洗脱两次等组成。洗出液与10ml水溶胶闪烁液(Packard仪器公司)混合，[3H]磷酸肌醇酯总量以液体闪烁计数器测定。(k)放射配体结合以人或猫FP受体稳定转染的HEK293细胞的血浆膜标本如下获得。用TME缓冲液洗过的细胞由瓶底刮下，用Brinkman PT10/35polytron均化30秒。按需要加TME缓冲液以达到在离心管中为40ml体积。TME由100mM TRIS碱、20mM MgCl2、2m EDTA组成，再加10NHCl达到生理pH。
细胞匀浆用Backman Ti-60离心机以19000rpm在4-6℃下离心分离20分钟。然后细胞团在TME缓冲液中再悬浮，按生物放射检定，具有1mg/ml的最终蛋白浓度。放射配体结合检定在200μl体积中完成。(N)17-苯基PGF2α(比活性85Ci/mmol)的结合经两次重复测定，而实验则重复三次。在25℃保温60分钟，而后加入4ml冰冷却的50mM TRIS-HCl使终止，继之通过Whatman GF/B滤纸迅速过滤，并将收得的细胞作3次另加的4ml水洗(Brandel)。竞争作用研究用最终浓度为5nM[3H](N)17-苯基PGF2α来完成，而非特异结合则用10-5M未标记的17-苯基PGF2α来测定。(1)眼内压(IOP)涉及Pneumatonometry的对狗的眼内压研究以清醒状态下两种性别的小猎兔犬(10-15kg)进行。在整个研究过程中该动物保持清醒，用手轻柔地加以约束。一般对一只眼用药为25μl体积的一滴，另一只眼接受25μl赋形剂(0.1％吐温80∶10mM TRIS)作为对照。在眼压测定过程中，0.1％丙对卡因用于角膜麻醉。在5天研究的每一天，眼内压于恰在给药之前和此后的2、4和6小时时测定。在首次IOP读数后立即用药。(m)瞳孔直径测量狗瞳孔直径用Optistick(一种包括标准宽度(mm)的半圆形参照的mm尺)为参照。用手轻柔地约束狗，通过在标准室内光中使半圆对瞳孔匹配来测定瞳孔直径。对具有很黑瞳孔的狗使用一种专门的钢笔形小手电筒，但只是很简单地避免瞳孔收缩。在IOP和眼充血的同时测量瞳孔直径。(n)眼表充血眼表充血凭目视按一般临床用的体系估计并评分。
眼充血等级指定值＜1轻微 0.51轻度 1中等 2严重 3眼表充血与眼内压测量在同一时间评估。应当注意，未经处理的狗眼常常具有粉红/红色调。因此，轻微或甚至轻度的值并不必然是超出了正常的范围。
结果前列腺素F2α1-乙醇酰胺对猫虹膜括约肌的影响描绘在图1中并列表显示(表1)。前列腺素F2α1-乙醇酰胺(PGF2α1-乙醇酰胺)产生了依赖于其剂量的猫虹膜括约肌平滑肌收缩作用。获得了58nM的有效浓度(E.C.)50值。此数据表明在10nM范围内的阈值浓度。
前列腺素F2α1-乙醇酰胺在抑制电场刺激引起的离体豚鼠输精管标本收缩方面有节制地有效。数据描绘在图2中并列表显示(表2)。
图3描绘PGF2α1-乙醇酰胺对离体小鸡回肠的影响。对参照化合物(前列腺素E2，10-6M)响应的比较暗示PGF2α1-乙醇酰胺可作为弱的局部兴奋剂而运作。数据列于表3中。PGF2α1-乙醇酰胺对豚鼠回肠显示效力较低(图4，表4)，豚鼠回肠据报告是EP1受体标本。
PGF2α1-乙醇酰胺分级剂量对离体鼠主动脉的影响表达在图5和表5中。在10-6和10-5的高剂量出现残留活性。由于鼠主动脉是TP受体标本，TP受体活性用血小板聚集作了进一步的评估。此外，测定抑制ADP诱发人血小板聚集的作用以揭示DP或IP受体的任何相互作用。对血小板没有影响是明显的。数据列在表6中，未提供图，因为绝对没有反应发生。
前列腺素F2α1-乙醇酰胺分级剂量在人皮肤成纤维细胞(CRL1497细胞)中产生的Ca2+信号与前列腺素F2α所产生的在图6中作了对比。数据还作了列表显示(表7)。PGF2α和PGF2α1-乙醇酰胺的E.C.50值分别为16nM和1586nM，表明在对人FP受体的效力方面约100倍的差别。
近年的研究已表明，前列腺素F2α可产生内皮依赖的，氧化氮(NO)介导的血管舒张作用(Chen等(1995)英国药理学杂志1163035-3041)。因此，在对组胺预收缩的，离体兔颈静脉片段产生内皮依赖的血管舒张作用方面，将PGF2α1-乙醇酰胺的效果与PGF2α的作了比较。虽然PGF2α强有力地产生显著的血管舒张作用，但PGF2α1-乙醇酰胺还是显示了较小的活性(图7)。数据也列表显示(表8)。对预收缩的兔颈静脉片段的血管舒张作用得到如下的E.C.50值PGF2α1-乙醇酰胺＝2000nM，PGF2α＝5.3。
由于观察到PGF2α1-乙醇酰胺在猫虹膜括约肌标本中的显著活性，所以将它的活性与PGF2α在重组猫FP受体上的活性作了比较。图8比较了PGF2α1-乙醇酰胺和PGF2α在以重组猫FP受体稳定转染的HEK-293细胞中引起Ca2+信号的活性。获得PGF2α和PGF2α1-乙醇酰胺的E.C.50值分别为14nM和1458nM，表明了在效力上约100倍的差别。数据也列表显示(表9)。
PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α对以重组猫FP受体稳定转染的HEK-293细胞中磷酸肌醇酯总累积量的影响在图9中作了描绘。效力上的差距大也是明显的。17-苯基PGF2αE.C.50值为9nM，而PGF2α1-乙醇酰胺E.C.50值则为524nM。数据列表显示(表10)。
另外，PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α对以重组人FP受体稳定转染的HEK-293细胞中磷酸肌醇酯总累积量的影响也作了调查。得到了E.C.50值，17-苯基PGF2α为8nM，PGF2α1-乙醇酰胺为1003nM。数据显示于图10和表11中。结果类似于重组猫FP受体情形下所得结果。
与使用稳定转染FP受体的标本的功能研究相-致，PGF2α1-乙醇酰胺对FP受体具有相对有节制的结合亲合力。因此，PGF2α1-乙醇酰胺(现有技术化合物1号)对猫受体仅有弱亲合力，而17-苯基PGF2α则呈现高亲合力(图11；表12)。得到的抑制浓度50(I.C.50)是，PGF2α1-乙醇酰胺为882nM，而17-苯基PGF2α则为43.5nM。对重组人FP受体获得类似结果PGF2α1-乙醇酰胺I.C.50＝2015nM，17-苯基PGF2αI.C.50＝2.3nM。这些放射配体结合数据描绘在图12中并列表显示(表13)。
用狗研究了PGF2α1-乙醇酰胺对眼球的影响。0.1％剂量的PGF2α1-乙醇酰胺显著地、高效地降低了眼内压(图13；表14)。此效果持续整整24小时实验期。PGF2α1-乙醇酰胺也引起显著的瞳孔缩小(图14；表15)。不像降眼压效果，瞳孔直径缩小在24小时处便消除了。与赋形剂相比，PGF2α1-乙醇酰胺在整个24小时实验期中引起轻度眼表充血。(图15；表16)。
在接连列出的表中，除非另作说明，试验或对照化合物的浓度都只以对数的指数表示。因此，例如在表中的“-8”意思是10-8M浓度的试验或对照物质。
表1、PGF2α1-乙醇酰胺分级剂量对离体猫虹膜括约肌平滑肌的影响。参照收缩由10-7PGF2α提供。各数值为平均值±SEM；n＝4
表2、PGF2α1-乙醇酰胺分级剂量对离体豚鼠输精管电场刺激收缩的抑制效应。各数值为平均值±SEM；n＝4
表3、PGF2α1-乙醇酰胺分级剂量对离体小鸡回肠的影响。参照收缩由10-6M PGE2提供。各数值为平均值±SEM；n＝4
表4、PGF2α1-乙醇酰胺分级剂量对离体豚鼠回肠的影响。参照收缩由PGE210-6M提供。各数值为平均值±SEM；n＝4
表5、PGF2α1-乙醇酰胺分级剂量对离体的朋鼠主动脉的影响。参照收缩由10-7M U-46619提供。各数值为平均值±SEM；n＝4
表6、PGF2α1-乙醇酰胺分级剂量对血小板聚集的影响及对ADP诱发聚集的抑制作用的影响。参照反应由2×10-5M ADP提供。各数值为平均值±SEM；n＝4
表7、由PGF2α1-乙醇酰胺和前列腺素F2α的分级剂量在CRL1497人表皮成纤维细胞中产生的细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i的增量。各数值为平均值±SEM；n＝4
表8、PGF2α1-乙醇酰胺和PGF2α对预收缩的兔颈静脉片段血管的舒张作用。参照的血管舒张作用由PGE210-7M提供。各数值为平均值±SEM；PGF2α1-乙醇酰胺，n＝6；PGF2α，n＝7。
表9、由PGF2α1-乙醇酰胺和前列腺素F2α的分级剂量在以重组猫FP受体稳定转染的HEK-293细胞中产生的细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i的增量。各数值为平均值±SEM；n＝3。
表10、由PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α的分级剂量在以重组猫FP受体稳定转染的HEK-293细胞中产生的磷酸肌醇酯总累积量。参照刺激由17-苯基PGF2α10-6M提供。各数值为平均值±SEM；PGF2α1-乙醇酰胺，n＝3；17-苯基PGF2α，n＝4；实验双份进行。
表11、由PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α的分级剂量在以重组人FP受体稳定转染的HEK-293细胞中产生的磷酸肌醇酯总累积量。参照刺激由17-苯基PGF2α10-6M提供。各数值为平均值±SEM；PGF2α1-乙醇酰胺，n＝3；17-苯基PGF2α，n＝4；实验双份进行。
表12、对重组猫FP受体的放射配体结合竞争研究(PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α对5nM3H-17-苯基PGF2α)。各数值为平均值±SEM；n＝3，实验双份进行。
表13、对重组人FP受体的放射配体结合竞争研究(PGF2α1-乙醇酰胺和17-苯基PGF2α对5nM3H-17-苯基PGF2α)。各数值为平均值±SEM；n＝3，实验双份进行。
表14、0.1％PGF2α1-乙醇酰胺对狗眼内压的影响。各数值为平均值±SEM；n＝6。**按学生的成对t验测，从基线眼内压发生p＜0.01的有效变化。
表15、0.1％PGF2α1-乙醇酰胺对狗瞳孔直径的影响。各数值为平均值±SEM；n＝6。**按学生的成对t验测，从基线瞳孔直径发生p＜0.01的有效变化。
表16、0.1％PGF2α-1乙醇酰胺对狗眼表充血的影响。各数值为平均值±SEM；n＝6。
药物组合物，使用方法药物组合物可如下制备，结合治疗上有效量的至少一种按本发明的化合物或其在药物学上可接受的盐作为一种活性成分，加上通常眼科可接受的药物赋形剂，并制备成适于局部眼球使用的单位剂量形式。治疗上的有效量一般在约0.0001和约5％(W/V)之间，优选在约0.001至约1.0％(W/V)，用液体配方。
就治疗应用而言，溶液优选用生理盐水作为主要赋形剂来制备。这样的治疗溶液应优选用一种合适的缓冲液体系，使pH保持在6.5和7.2之间，受到优选的是实际上为中性的pH。配方也可以包含通常药物上可接受的防腐剂、稳定剂和表面活性剂。
优选的可以用于本发明药物组合物的防腐剂包括(但不限于)洁尔灭、氯代丁醇、乙基汞硫代水杨酸钠、乙酸苯汞和硝酸苯汞。优选的表面活性剂例如Tween80。同样，各种优选的赋形剂可以用于本发明的眼药制备中。这些赋形剂包括(但不限于)聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆类、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和纯水。
按需要和方便可加入张力调节剂。它们包括(但不限于)盐类，具体是氯钠、氯化钾、甘露糖醇和甘油，或任何其它适于眼科接受的张力调节剂。
各种缓冲剂和调节pH的方法都可以用，只要所得的制备物是眼科可接受的。因此，缓冲液包括乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。酸或碱都可以按需要用来调节这些配方的pH。
按类似的意向，用于本发明的眼科可接受的抗氧化剂包括(但不限于)焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化的羟基苯甲醚和丁基化的羟基甲苯。
其它的可包括在眼科制备品中的赋形剂组分是螯合剂。优选的螯合剂是edentate二钠，但是其它螯合剂也可以用来代替它或与它结合。
各成分通常按下列的量使用成分 量(％W/V)活性成分 约0.001-5防腐剂 0-0.10赋形剂 0-40张力调节剂 0-10缓冲液 0.01-10pH调节剂 Q.s.pH 4.5-7.5抗氧化剂 按需要表面活性剂 按需要纯水 按需要加入使总和达到100％本发明活性化合物的真实剂量取决于具体化合物以及要治疗的病症；合适剂量的选择完全在熟练工艺人员的知识范围内。
本发明的眼药制剂通常包装成适于对眼睛计量使用的形式，如装入带有滴管的容器中，以方便使用到眼上。适于以液滴方式使用的容器通常用合适的惰性、无毒塑料材料制作，一般容纳约0.5和约15ml之间的溶液。
特殊的无防腐剂溶液常配制在不可再封上的容器中，包含直至10个左右，优选约5个单位剂量，典型的单位剂量由1滴至约8滴，优选1滴至约3滴。一滴的体积通常是约20-35μl。
合成方法详述PGF2α(游离羧酸)向搅拌的在150ml水中的20g PGF2α或“三甲醇氨基甲烷盐”(51.9mmol)溶液加入浓盐酸，使溶液的pH调节至2。此溶液用3×200ml氯仿抽提并在真空中浓缩。游离的PGF2α羧酸主要以固体层出现在水相与有机相之间。由该层收集此固体，并与由浓的氯仿溶液用过滤得到的固体结合，结合在一起的固体用50％氯仿/甲醇洗涤。PGF2α甲酯(5Z，8α，9α，11α，13E，15S)-9，11，15-三羟基前列腺-5，13-二烯-1-甲基酯向搅拌的在50ml丙酮中的游离PGF2α羧酸(2.528g，7.13mmol)溶液加入3.2ml 1，8-二氮杂二环[5.4，0]十一-7-烯(21.39mmol)和1.33ml碘代甲烷(21.39mmol)。溶液搅拌过夜，用150ml乙酸乙酯稀释，以2×50ml 0.5m LiOH、1×50ml盐水洗涤，在真空中浓缩，产生标题所示的化合物纯甲酯(用1HNMR检验纯度)。
H1NMR(CDCl3)5.56-5.34(m，4H)，4.01(m，1H)，3.87(m，1H)，3.87(m，1H)，3.63(s，3H)，3.18(t，2H，J＝5.8Hz)，2.31-2.02(m，8H)，1.69-1.25(m，12H)，0.849(t，3H，J＝6.7Hz)。PGF2α1-乙醇酰胺(5Z，8α，9α，11α，13E，15S)-9，11，15-三羟基-N-(2-羟乙基)前列腺-5，13-二烯-1-酰胺向搅拌的在4.5ml无水甲醇中的PGF2α甲酯(235.4mg，0.639mmol)溶液加入771μl乙醇胺(12.78mmol)。装有此混合物的试管封口并在50℃加热过夜。取一个等分部分，在高真空下加热浓缩以除去过量的乙醇胺并用1HNMR分析。表明此反应为80％的完成度。溶液在高真空下在65℃浓缩1.5小时，然后用Kugehlrohr蒸馏在60℃下过夜以除去残留的乙醇胺。1HNMR和用5％甲醇/乙酸乙酯的TLC指示乙醇胺的去除。(甲酯Rf=0.41，PGF2α1-乙醇酰胺Rf＝0.04)。粗产品用5％甲醇/乙酸乙酯作急骤色层分离以回收剩留的未反应的起始物料，甲酯在级分4-8和50％中，在甲醇/乙酸乙酯中产生在级分11-18中的所要求的标题所示化合物。用15％的甲醇/乙酸乙酯进一步急骤色层分离级分11-18，产生无起始物料但在某些级分(级分7-10)仍为C15差向异构体沾污的标题所示化合物以及所要求的纯态产物(在级分11-20中)。标题所示化合物及其C15差向异构体的1H+13C NMR谱是相同的。理论产量＝254.0mg，实际产量＝205.6mg，81％。H1NMR(CD3OD)5.4-5.2(m，4H)，3.98(m，1H)，3.89(m，1H)，3.72(m，1H)，3.47(t，2H，J＝5.8Hz)，3.18(t，2H，J＝5.8Hz)，2.24-1.90(m，8H)，1.50-1.21(m，12H)，0.796(t，3H，J＝6.5Hz)。
权利要求
1.结构式如下的化合物 式中虚线表示没有键或有一个其条件为在式中没有两个相邻双键的键；波纹线附着基表示α(向下)或β(向上)构型，在附着于双键的波纹线处它们表示Z(顺式)或E(反式)构型；影线指示α构型，实心三角形指示β构型；m是0至5的整数；n是1至6的整数，条件是以该式表示的化合物不是PGF2α1-乙醇酰胺；q和r各自是0至6的整数；X是CH2、O或S，条件是，当X是O或S时，邻接于X的虚线表示没有键；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的环烷基，或者是以一或二个取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基则选自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6个碳；R1、R2、R3和R4各自表示氢、1至6碳的直链或支链烷酰基、苯甲酰基或1至6碳低级烷基；R5是氢或1至6碳的直链或支链烷基；以及R6是氢、1至4碳的直链或支链烷基或者是该化合物的药用盐，所说的化合物对哺乳动物的眼具有降低眼内压活性，但不通过FP前列腺素受体发挥其降眼压活性。
2.按权利要求1的一种化合物具有结构式
3.按权利要求2的化合物，其中碳10和11、8和12及17和18间的虚线表示没有键，而碳5和6间的虚线表示有一个键。
4.按权利要求2的化合物，其中R5是氢或1至3个碳的低级烷基。
5.按权利要求4的化合物，其中R5是氢。
6.按权利要求2的化合物，其中R6是氢或1至3个碳的低级烷基。
7.按权利要求6的化合物，其中R6是氢。
8.按权利要求2的化合物，其中n是2。
9.按权利要求2的化合物，其中OR1、OR2和OR3基的构型是α，5和6位间的虚线表示一个键，而5-6双键的构型是Z(顺式)。
10.结构式如下的化合物 式中R1、R2、R3和R4各自表示氢、1至6碳的直链或支链烷酰基、苯甲酰基或1至6碳的直链或支链烷基；n是1至6的整数；该化合物对降低哺乳动物眼的眼内压具有活性，但并不通过FP前列腺素受体发挥其降眼压活性，条件是，当n是2时，R1、R2、R3和R4基中至少一个不是氢。
11.一种分离出来的基本上纯的具有下式结构的化学物质
12.对降低需要用组合物治疗的哺乳动物眼的眼内压有效的药物组合物，该组合物包括作为其活性成分的有效量的一种或更多种下式结构化合物， 式中虚线表示没有键或有一个其条件为在式中没有两个相邻双键的键；波纹线附着基表示α(向下)或β(向上)构型，在附着于双键的波纹线处它们表示Z(顺式)或E(反式)构型；影线指示α构型，实心三角形指示β构型；m是0至5的整数；n是1至6的整数；q和r各自是0至6的整数；X是CH2、O或S，条件是，当X是O或S时，邻接于X的虚线表示没有键；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的环烷基，或者是以一或二个取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基则选自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6个碳；R1、R2、R3和R4各自表示氢、1至6碳的直链或支链烷酰基、苯甲酰基或1至6碳低级烷基；R5是氢或1至6碳的直链或支链烷基；R6是氢、1至4碳的直链或支链烷基或者是该化合物的药用盐，所说的化合物对哺乳动物的眼具有降低眼内压活性，但不通过FP前列腺素受体发挥其降眼压活性，以及药用赋形剂。
13.按权利要求12的药物组合物，其中活性化合物具有下式结构
14.按权利要求13的药物组合物，其中活性化合物的结构式中碳10和11、8和12及17和18间的虚线表示没有键，而碳5和6间虚线表示一个键。
15.按权利要求13的药物组合物，其中活性化合物的结构式中R5是氢或1至3碳的低级烷基。
16.按权利要求15的药物组合物，其中活性化合物的结构式中R5是氢。
17.按权利要求13的药物组合物，其中活性化合物的结构式中R6是氢或1至3碳的低级烷基。
18.按权利要求17的药物组合物，其中活性化合物的结构式中R6是氢。
19.按权利要求13的药物组合物，其中活性化合物的结构式中n是2。
20.按权利要求13的药物组合物，其中活性化合物的结构式中OR1、OR2和OR3基的构型是α，5和6位间的虚线表示一个键，而5-6双键的构型是Z(顺式)。
21.按权利要求13的药物组合物，其中活性化合物具有下式结构
22.按权利要求21的药物组合物，其中活性化合物具有下式结构
23.按权利要求12的药物组合物，适合于哺乳动物眼的局部用药。
24.按权利要求13的药物组合物，适合于哺乳动物眼的局部用药。
25.按权利要求21的药物组合物，适合于哺乳动物眼的局部用药。
26.按权利要求22的药物组合物，适合于哺乳动物眼的局部用药。
27.降低需要这样的治疗的哺乳动物眼的眼内压的方法，此方法包括对哺乳动物用一种药物组合物的步骤，该药物组合物包括药用赋形剂和作为其活性成分的有效量的一种或多种下式结构的化合物， 式中虚线表示没有键或有一个其条件为在式中没有两个相邻双键的键；波纹线附着基表示α(向下)或β(向上)构型，在附着于双键的波纹线处它们表示Z(顺式)或E(反式)构型；影线指示α构型，实心三角形指示β构型；m是0至5的整数；n是1至6的整数；q和r各自是0至6的整数；X是CH2、O或S，条件是，当X是O或S时，邻接于X的虚线表示没有键；R是CH3、苯基、呋喃基、噻吩基、3至8碳的环烷基，或者是以一或二个取代基取代的苯基、呋喃基或噻吩基，而取代基则选自F、Cl、Br，1至6碳的烷基，NO2，CN，COOH和COO烷基，其中烷基有1-6个碳；R1、R2、R3和R4各自表示氢、1至6碳的直链或支链烷酰基、苯甲酰基或1至6碳低级烷基；R5是氢或1至6碳的直链或支链烷基；R6是氢、1至4碳的直链或支链烷基或者是该化合物的药用盐，所说的化合物对哺乳动物的眼具有降低眼内压活性，但不通过FP前列腺素受体发挥其降眼压活性。
28.按权利要求27的治疗方法，其中活性化合物具有下式结构
29.按权利要求28的治疗方法，其中活性化合物具有下式结构
30.按权利要求29的治疗方法，其中活性化合物具有下式结构
31.按权利要求27的治疗方法，其中药物组合物适合于对眼局部用药，方法包括对哺乳动物眼局部地使用该组合物。
32.按权利要求28的治疗方法，其中药物组合物适合于对眼局部用药，方法包括对哺乳动物眼局部地使用该组合物。
33.按权利要求29的治疗方法，其中药物组合物适合于对眼局部用药，方法包括对哺乳动物眼局部地使用该组合物。
34.按权利要求30的治疗方法，其中药物组合物适合于对眼局部用药，方法包括对哺乳动物眼局部地使用该组合物。
全文摘要
式中符号如说明书中定义的式(1)化合物，用作降眼压药，但此类药不通过FP前列腺素受体发挥其作用。特别是具有式(I)的PGF
文档编号A61K31/557GK1420865SQ01807431
公开日2003年5月28日 申请日期2001年2月5日 优先权日2000年2月8日
发明者D·F·伍德瓦德, H·H·乌桑斯基, S·W·安德鲁斯, R·M·博克, J·陈, A·H·P·克劳斯, C·马胡 申请人:阿勒根公司