仙人掌提取物和由其分离的化合物在保护神经细胞中的应用的制作方法

专利名称：仙人掌提取物和由其分离的化合物在保护神经细胞中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及仙人掌(Opuntia ficus-indica)的乙酸乙酯提取物和由其分离的化合物在保护神经细胞中的应用。
背景技术：
当通过脑动脉或冠状动脉的血液流量低于阈值，例如由于血栓形成和动脉硬化的阻断作用而低于阈值时，所产生的局部缺血会损伤脑细胞或心脏细胞，从而由于细胞死亡而导致脑梗塞或心肌梗塞。脑局部缺血是在心脏骤停和局部缺血性中风中观察到的常见症状，并引起难于处理的脑神经元损伤，其可导致劳动力丧失、昏睡甚至死亡。
有关中枢神经系统疾病的病理生理学机理是多变而复杂的，但已经发现反应性氧物质例如自由基在中枢神经系统疾病例如缺血性中风、阿尔茨海默氏病和帕金森病中起重要作用。也就是说，已经有人提出，在急性和慢性神经变性疾病中，由氧化应力产生的各种ROS对某些神经细胞造成损伤。最近有人报道，由缺血性中风造成的脑损伤是由局部缺血和再灌注所产生的自由基引起的(Korosfetz &Moskowitz，Trends Neurosci.17227，1996)。
自由基也是在阿尔茨海默氏病中观察到的某些神经细胞损失的原因。阿尔茨海默氏病的典型临床表现之一是通过β-淀粉样(Aβ)蛋白质的聚集而形成的老年斑。聚集的β-淀粉样蛋白质引起过氧化氢在神经细胞中聚集，从而导致氧化和过氧化反应。此外，这些反应促进一氧化氮的产生，而由此产生的一氧化氮与超氧化物阴离子自由基，形成具有非常强的反应性的过亚硝酸盐，从而导致自由基毒性增加。
同样地，据信，是由氧化应力产生的羟基自由基一一种强的神经毒介质引起了帕金森病(Ebadi等人，Prog.Neurobiol.481，1996)。此外，有人提出，ROS在兴奋毒素神经元细胞死亡中起重要作用，而兴奋毒素神经元细胞死亡是由于在急性脑损伤和慢性神经变性疾病中过度释放的谷氨酸引起的(Choi，Neuron 1623，1988)。
因此，由氧化应力产生的ROS直接或间接地参与各种急性和神经变性疾病例如脑缺血、阿尔茨海默氏病、帕金森病，所以人们在积极研究抗氧化物质以预防和治疗这样的神经疾病。
本发明者们致力于探寻天然存在的具有抗氧化活性的物质，并且发现仙人掌(Linne)Mill提取物具有可以用来保护神经细胞的非常强的抗氧化活性。
仙人掌作为民间药物被广泛用于治疗烧伤、水肿、消化不良和支气管哮喘，并且已知仙人掌果实和茎的乙醇提取物在保护胃粘膜、降低血糖水平以及通过止痛和抗炎症作用来提高免疫力方面显示出了多种功效(Trejo-Gonzalez等人，J.Ethnopharmacol.5527-33，1996；Ahn，Illustrated book of Korean medical herbs Kyohaksa，497，1998；Galati等人，J.Ethnopharmacol.761-9，2001)。最近还有报道，仙人掌能够抑制涉及黑素合成的酪氨酸酶(Lee N.H.等人，J.Pharmacognosy 31412，2000)。
然而，还没有关于仙人掌茎、果实或加工过的果实的乙酸乙酯提取物，或者由其分离的化合物表现出保护神经细胞的抗氧化活性的报道，因此，本发明第一次公开了这样的提取物能够有效地用于预防和治疗慢性神经疾病例如局部缺血性中风和阿尔茨海默氏病，以及心脏缺血例如心肌梗塞。
发明概述因此，本发明的主要目的是提供表现出抗氧化活性的仙人掌提取物或由其分离的化合物在预防和治疗缺血性疾病、脑神经疾病或心血管系统疾病中的治疗应用。
按照本发明的一个方面，提供了可用于保护神经细胞的表现出抗氧化活性的仙人掌的乙酸乙酯提取物。
按照本发明的另一个方面，提供了从仙人掌的乙酸乙酯提取物中分离出的化合物及其制备方法。
按照本发明的另一个方面，提供了包含仙人掌的乙酸乙酯提取物或由其分离的化合物作为有效成分的药物组合物，所述药物组合物能够用于预防或治疗缺血性疾病、脑神经系统疾病或心血管系统疾病。
按照本发明的另一个方面，提供了仙人掌的乙酸乙酯提取物或由其分离的化合物在预防和治疗缺血性疾病、脑神经系统疾病或心血管系统疾病中的应用。
附图简述当结合参阅分别显示于以下的附图时，从本发明的下面描述中，本发明的上述和其它目的和特征将会变的显而易见附

图1从仙人掌果实中提取的各种级分对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的神经毒性的抑制作用，附图2从仙人掌果实中提取的各种级分对过氧化氢诱发的神经毒性的抑制作用，附图3从仙人掌茎中提取的各种级分对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的神经毒性的抑制作用，附图4从仙人掌茎中提取的各种级分对过氧化氢诱发的神经毒性的抑制作用，附图5从仙人掌的乙酸乙酯提取物中分离的化合物对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的神经毒性的抑制作用，附图6从仙人掌的乙酸乙酯提取物中分离的化合物对过氧化氢诱发的神经毒性的抑制作用，附图7从仙人掌的乙酸乙酯提取物中分离的化合物清除DPPH自由基的活性，附图8从仙人掌的乙酸乙酯提取物中分离的化合物清除超氧化物阴离子自由基的活性，附图9槲皮素(quercetin)、槲皮素3-甲基醚和二氢槲皮素对大脑皮层、纹状体的梗塞体积或总梗塞体积的影响，附图10槲皮素、槲皮素3-甲基醚和二氢槲皮素对校正的总梗塞体积的影响，附图11槲皮素、槲皮素3-甲基醚和二氢槲皮素对肿胀比率的影响，附图12槲皮素、槲皮素3-甲基醚和二氢槲皮素对神经恢复的影响。
发明详述本发明提供了用于预防和治疗缺血性疾病、脑疾病或心血管系统疾病的药物组合物，所述药物组合物包含仙人掌的乙酸乙酯提取物；或选自式(1)山柰酚、式(2)二氢槲皮素和式(3)槲皮素3-甲基醚的任一种化合物，以及它们的可药用盐、水合物、溶剂化物、异构体及其混合物。
<式1>
<式2>
<式3>
因为式1-3化合物可在其结构内可以具有不对称碳原子，所以它们可以以对映体、非对映体或含有外消旋体的其混合物的形式存在，因此，其混合物的这些异构体包含于本发明范围内。
本发明化合物也能够形成可药用盐。这些可药用盐包括但不限于用下列碱形成的盐无机碱例如碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾)，碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠、碳酸氢钾)，碱金属碳酸盐(例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙)以及有机碱例如伯、仲和叔胺氨基酸。
此外，本发明化合物可以以溶剂化物、特别是水合物的形式存在。水合作用可以在分离期间发生，或者经过一定时间通过其吸湿性而发生的。这样的盐和水合物包括于本发明范围内。
具有保护神经细胞活性的仙人掌提取物可以通过用乙酸乙酯提取仙人掌的果实、茎或蒸汽干燥的果实来制备，例如通过以下步骤制得将仙人掌的果实、茎或蒸汽干燥的果实精细切碎；在室温将每千克所述切碎的仙人掌在0.1-10L、优选0.5-7L C1-3醇例如甲醇和乙醇，或C1-3醇的水溶液中浸泡4-5天，以获得提取混合物；过滤该混合物，并从滤液中除去醇以获得醇提取物；将0.1-10L、优选1-4L水加到1kg所述醇提取物中；用0.1-5L、优选0.5-2L乙酸乙酯(EtOAc)提取所得水溶液以获得乙酸乙酯提取物。直接用乙酸乙酯提取仙人掌的果实、茎或蒸汽干燥的果实来获得类似提取物也是可能的。
本发明仙人掌的果实、茎或蒸汽干燥果实的乙酸乙酯提取物在以下方面显示了高的活性清除DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)自由基；抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的神经毒性；以及抑制过氧化氢诱发的神经毒性。仙人掌乙酸乙酯提取物的这种活性是独特的，因为其它的提取物例如仙人掌的C2HCl2和BuOH提取物基本上没有活性。
因此，仙人掌的乙酸乙酯提取物是有效的ROS清除剂，并且能够用于预防和治疗由脑疾病例如阿尔茨海默氏病病、中风和帕金森病引起的脑神经细胞损伤；以及通过防止由心脏缺血引起的心肌损伤来预防和治疗心肌梗塞。
通过进行使用硅胶、Sephadex LH-20、RP-18、聚酰胺、Toyoperl或XAD树脂柱的柱色谱纯化，可以从本发明仙人掌的乙酸乙酯提取物中分离出用于保护神经元的活性化合物。优选使用Sephadex LH-20、RP-18或硅胶柱。
作为结果，3-氧代-α-ionol β-D-葡糖苷、山柰酚、二氢山柰酚、山柰酚3-甲基醚、槲皮素、二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚从本发明仙人掌的乙酸乙酯提取物中被分离出来。在本发明中，3-氧代-α-ionolβ-D-葡糖苷、山柰酚3-甲基醚和槲皮素3-甲基醚是第一次从仙人掌中分离出来。
山柰酚、槲皮素、二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚有效抑制由过氧化氢以及黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的神经细胞损伤，并且显示了高的清除DPPH自由基的活性。对由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶或过氧化氢诱发的神经毒性表现出最高抑制活性的是槲皮素3-甲基醚，而槲皮素、二氢槲皮素和山柰酚也表现出了显著的活性。因此，就证实了在防止黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶或过氧化氢诱发的神经毒性的神经元损伤方面，仙人掌的乙酸乙酯提取物中起作用的有效成分是山柰酚、槲皮素、二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚。
此外，二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚是由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产生的超氧化物自由基的有效清除剂，并且有效抑制由NMDA引起的神经元损伤。槲皮素3-甲基醚在缺血性脑损伤动物模型中对于脑细胞保护具有特别的活性。因此，山柰酚、二氢槲皮素、槲皮素3-甲基醚或仙人掌的乙酸乙酯提取物可有利地用于预防和治疗由脑神经系统疾病例如中风、脑震荡、阿尔茨海默氏病和帕金森病引起的神经元损伤；由局部缺血引起的神经元细胞和组织(尤其是脑神经细胞和组织)损伤；由局部缺血例如缺血性心肌梗塞引起的心血管系统的细胞损伤，并且也能够用做神经保护剂或心脏保护剂。
按照本领域的常规方法，可以使用本发明组合物制备药物制剂。在这样的制备中，优选以胶囊、小药囊或其它容器的形式将有效组分与适宜的载体混合、稀释或包囊。因此，可以将本发明制剂制成片剂、丸剂、分散剂、小药囊、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆剂、气溶胶剂、软或硬明胶胶囊、注射用溶液或悬浮液、软膏剂、霜剂或洗剂。
用于本发明药物制剂的可药用载体、赋形剂和稀释剂包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。本发明制剂还可以包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、矫味剂、乳化剂或防腐剂。按照药物领域的常规方法，本发明药物组合物可以制备成在给药哺乳动物后提供迅速、连续或迟延释放有效组分的制剂。
本发明药物组合物可以口服给药或经胃肠外途径例如经皮、皮下、静脉内或肌内给药。
对于临床给药的目的，仙人掌的乙酸乙酯提取物或由其分离的山柰酚、二氢槲皮素或槲皮素3-甲基醚的典型日剂量为10-5,000mg/kg体重，优选50-1,000mg/kg体重，并且能够以单次剂量或以分开的剂量给药。特别是，当经由静脉内或肌内注射给药时，典型的日剂量可以为10-5,000mg/kg体重，优选为150-3,000mg/kg体重，然而，根据具体的疾病，该剂量可以高于或低于有效组分的日剂量。此外，应当理解，实际给药于具体患者的有效组分的量应当根据各种相关因素确定，包括给药的有效化合物的种类、个体患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食和排泄速度、所选择的给药途径、药物组合以及患者症状的严重程度。
此外，为了在治疗缺血性疾病中获得更好效果，本发明的仙人掌提取物或由其获得的化合物可以与一种或多种选自以前众所周知的神经保护剂的成分一起给药。可与本发明化合物一起给药的神经保护剂的实例是用于提高谷胱甘肽浓度的N-乙酰半胱氨酸、作为钙拮抗剂的尼莫地平、作为抗氧化剂的维生素C和E、作为血栓溶解剂的组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及其它脑神经和心血管保护剂。
包含本发明化合物的用于治疗缺血性疾病的制剂还可以包含用于预防和治疗由局部缺血引起的神经细胞和组织(尤其是脑神经细胞和大脑组织)损伤或由局部缺血引起的心血管系统细胞损伤的其它组分。
给出下面的实施例和试验实施例仅是为了举例说明，而非意图限制本发明的范围。
实施例参考实施例1测定DPPH自由基清除活性试验样本的抗氧化活性由它的供电子能力(EDA)来代表，而EDA则由改进的Blois(Nature 1811199，1958)方法测定。也就是说，把试验样本溶于99.9％乙醇，然后稀释至适宜的浓度。将10μl该溶液与190μl DPPH溶液(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼；溶于99.9％乙醇中)混合，搅动5秒钟，然后在37℃下反应30分钟，之后在515nm测定该混合物的吸收度。通过相对于对照吸收度的样本吸收度来评估EDA，并由其计算代表50％抑制活性的IC50。
参考实施例2测定超氧化物阴离子自由基清除活性为了测定清除由黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶(XOD)之间的反应产生的超氧化物阴离子自由基的活性，进行下面由Toda等人描述的方法(Planta，med.578，1991)将不同浓度的试验样本溶液分别与0.1mM黄嘌呤、0.1mM EDTA、50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)、25mM氮蓝四唑(NBT)、40mM Na2CO3和7×10-3单位XOD混合至200μl的最终浓度，然后在25℃反应20分钟。将6.6μl的6mM CuCl2加到反应混合物中以终止反应，然后在560nm测定该反应混合物的吸收度以确定甲簪(formazane)的量。通过相对于对照吸收度的样本吸收度来评估超氧化物阴离子自由基清除活性，并由其计算代表50％抑制活性的IC50。
参考实施例3大鼠大脑皮层神经元的原代培养物将从Sprague-Dswley大鼠胚胎大脑皮层中分离出的神经元细胞用Cho等人(Life sci.681567，2001)描述的方法进行培养。即将妊娠16-18天的Sprague-Dswley大鼠胚胎的大脑皮层分离出来，然后使用解剖学显微镜把脑膜除去。在含有25mM葡萄糖、5％FBS、5％马血清和2mM L-谷氨酰胺的培养基(MEM，Gibco BRL)中，通过研制法，用Pasteur移液管将由此获得的组织分离成单个细胞。将分离的细胞以4-5×105个细胞/孔的密度铺在预先包被聚-L-赖氨酸和昆布氨酸的24-孔培养板上，以达到4-5×105个细胞/孔的浓度，然后在37℃的培养器中于95％O2/5％CO2下进行培养。每周用新鲜的培养基更换一部分培养液两次，然后在铺板之后7到9天，将培养物用10μM阿糖胞苷处理24到72小时，以抑制非神经元细胞的生长。在铺板之后10到14天，将培养的细胞用于试验。
参考实施例4用氧化应力诱发神经原细胞损伤将培养的大脑皮层细胞用HEPES-控制盐水溶液(HCSS)洗涤三次，然后将其用包含黄嘌呤(0.5mM)和黄嘌呤氧化酶(10mU/ml)的不含血清的MEM(MEM含有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰胺)处理，以诱发由超氧化物阴离子自由基导致的细胞损伤。将处理的细胞用HCSS反复洗涤，然后在不含血清的没有黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶的MEM中，于95％O2/5％CO2、37℃下，培养20-24小时。通过如下方法诱发由过氧化氢引起的细胞损伤将培养的细胞洗涤，用含有100μM过氧化氢的HCCS处理5分钟，反复洗涤，用不含血清的MEM更换培养基，然后再培养20-24小时。将培养物用不同浓度的试验样本预先处理1小时，在试验样本存在下，用如上所述的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶或过氧化氢处理，然后再保持20-24小时。用参考实施例5中描述的方法测定细胞损伤的程度。
参考实施例5神经元细胞损伤的测定按照参考实施例4的方法处理的培养的神经细胞的损伤程度可以用相差显微镜进行形态学检测，或者通过测定释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)的活性来确定。数据计算为，在没有测定样本存在下，在暴露于各自的氧化损伤的培养基中的对照LDH活性的百分比。根据相对于未改变的对照物的LDH释放量来计算试验样本对氧化神经细胞损伤的抑制活性。将测定重复二到四次，通过使用Prism(Graphed软件公司，USA)非线性回归分析平均值来计算代表50％抑制浓度的IC50。
参考实施例6用于神经毒性试验的大鼠脑海马细胞和皮层细胞的培养使用显微镜，从怀孕的SD大鼠的17天大的胚胎的大脑组织中提取海马和皮层。用移液管将提取的海马和皮层各自分离成离散的单一细胞，然后通过离心把由此得到的细胞接种到聚-L-赖氨酸包被的96孔培养板中。海马细胞以2.5×104个细胞/孔的浓度接种，皮层细胞以5×104个细胞/孔的浓度接种。把含有2％B-27补充营养物、25M谷氨酸和0.5mM谷氨酰胺的200μl Neurobasal培养基(Life technologies)加到每个孔中，然后将该培养板在37℃培养。培养72小时后，将该培养基用相同但缺少谷氨酸的培养基更换，然后进一步培养细胞。7到10天后进行细胞毒性试验。
参考实施例7防止脑细胞受由NMDA导致的神经毒性损伤的活性在有或没有固定量的试验样本存在下，将在参考实施例6中制备的培养细胞用100μM NMDA(Signa)处理2小时，以诱发大脑细胞损伤。24小时后，用LDH试剂盒(Boehringer Mannheim)测定释放到培养液中的LDH的量。
参考实施例8防止脑细胞受由生长因子的去除导致的神经元损伤的活性将在参考实施例6中制备的培养细胞在含有2％B27补充营养物的NMDA培养基中培养，然后用相同但没有B27补充营养物的NMDA培养基更换培养液，以诱发由营养不足导致的细胞死亡。24小时后，用LDH试剂盒(Boehringer Mannheim)测定由细胞坏死所释放的LDH的量来定量细胞死亡的程度。
参考实施例9制备由中间脑动脉闭塞(MACO)和再灌注引起的短暂病灶性脑缺血损伤的大鼠模型将体重250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Daehan实验动物中心，Eumsung)用作实验动物。用使用70％一氧化氮(N2O)和30％氧气(O2)作为载体气体的1.5％异氟烷(Forane，Choong WaePharmaceutical Co.)将每个实验动物麻醉，然后用由Nagasawa和Kogure(Stroke 201037，1989)描述的方法进行手术操作，同时用加热垫和加热灯将实验动物的体温保持在大约37±0.5℃左右。
沿着麻醉动物的脖颈中部把颈切开，然后小心地从中分离出右颈总动脉、内颈动脉和外颈动脉，同时注意不要损伤迷走神经。将共同颈动脉和外颈动脉结扎，把一根17mm长的探针从内和外颈动脉的分叉点处插入内颈动脉，然后在插入部位的正上方结扎，以隔断大脑中动脉的底部。通过如下方法预先制备探针通过加热将一根4-0尼龙缝线(Nitcho Kogyo Co.，Ltd.，Japan)的一端制成球形，并切割成17mm的长度(该长度不包括球形端)，然后把另一端大约7-9mm长的部分浸入硅酮(Bayer Dental，Xantopren)和硬化剂(Optosil-Xantopren Activator，Bayer Dental)的混合物中，以形成具有0.3-0.4mm厚度的包被。将该包衣端插到外颈动脉中以阻断通过此处的血流。在诱发大脑局部缺血大约25到30分钟后，测定神经缺陷，并且把显示神经缺陷症状的实验动物包括在局部缺血组。当提起大鼠的尾巴将其悬于空中时，通过观察其左前臂是否弯曲，或者其身体是否自发地向左转，来判定神经缺陷。大脑中动脉被隔断120分钟后，在该动物由于异氟烷而处于麻醉状态的同时，通过切开缝合部位，然后把探针的球状端拉出大约10mm长，以使其再灌注，来制备短暂病灶性脑缺血大鼠模型。然后把手术部位缝合，一天后测定神经缺陷。将脑组织从动物中取出并进行组织学染色。
诱发局部缺血30分钟后，腹膜内给药0.9％盐水(载体，1ml/kg)或10mg/kg槲皮素-3甲基醚或二氢槲皮素。
实施例1仙人掌果实提取物的制备及其保护神经细胞的活性把新鲜的仙人掌果实(产自韩国Cheju岛，在Kyeongdong市场上购得)精细切碎，并除去种子。室温下，将7.8kg切碎的果实在40L甲醇中浸泡4到5天，然后过滤。将这样的提取进行两次以上，然后，把甲醇溶液合并在一起，在40℃用旋转蒸发器浓缩以获得甲醇提取物。然后将498g仙人掌果实的甲醇提取物溶解入1L水中，并依次用二氯甲烷(CH2Cl2，600ml×3)、乙酸乙酯(EtOAC，600ml×3)和丁醇(BuOH，600ml×3)提取该所得水溶液。从相应的有机提取物和最终水相中获得若干不同的溶剂级份。按照参考实施例1-5中描述的方法，分别对DPPH自由基清除活性以及抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或过氧化氢诱发的神经毒性进行测定。
如附图1、2和表1所示，仙人掌果实的二氯甲烷(GD)级份、丁醇级份(GB)和水级份(GH)显示了DPPH自由基清除活性或对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或过氧化氢诱发的神经毒性的抑制作用。另一方面，乙酸乙酯级份(GE)分别在IC5060.0μg/ml、IC5067.7μg/ml和IC50115.9μg/ml能够有效地清除DPPH自由基，并显著地抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或过氧化氢诱发的神经毒性。这些结果证实，仙人掌果实的乙酸乙酯提取物在大脑皮层神经元中表现出显著的神经保护作用，因此，能够用于治疗中风或阿尔茨海默氏病。
实施例2仙人掌加工过的果实提取物的制备及其保护神经细胞的活性在室温将15kg通过蒸汽、干燥和粉碎而获得的仙人掌的加工过的果实(产自韩国Cheju岛，在Kyeongdong市场购买)在20L甲醇中浸泡4到5天，然后过滤。在40℃将甲醇溶液下用旋转蒸发器浓缩以获得甲醇浓缩物。把412g甲醇提取物溶解入1.5L水中，然后依次用二氯甲烷(CH2Cl2，800ml×3)、乙酸乙酯(EtOAc，800ml×3)和丁醇(BuOH，800ml×3)提取该水溶液，以获得各种溶剂级份。按照参考实施例1-5中描述的方法，分别对DPPH自由基清除活性，以及抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或过氧化氢诱发的神经毒性进行测定。
除了水级份(SH)以外，所有得自仙人掌加工过的果实的级份都具有活性(表1)。在各种级份中，乙酸乙酯级份(SE)清除DPPH自由基最有效，并抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或过氧化氢诱发的神经毒性。各自的IC50为58.0μg/ml、22.2μg/ml和21.2μg/ml。这些结果证实，仙人掌加工过的果实的乙酸乙酯提取物在大脑皮层神经元中表现出了显著的神经保护作用，因此能够用于治疗中风或阿尔茨海默氏病。
实施例3仙人掌茎的提取物的制备及其保护神经细胞的活性在室温下，把36.2kg新鲜的仙人掌茎(产自韩国Cheju岛，在Kyeongdong市场上购得)在20L甲醇中浸泡4到5天，然后过滤。将该提取重复两次以上，然后在40℃将合并在一起的甲醇溶液用旋转蒸发器浓缩以获得甲醇浓缩物。把819.9g甲醇提取物溶解入1L水中，然后依次用二氯甲烷(CH2Cl2，600ml×3)、乙酸乙酯(EtOAc，800ml×3)和丁醇(BuOH，800ml×3)提取该水溶液，以获得各种溶剂级份。按照参考实施例1-5中描述的方法，在每一级份中，分别对DPPH自由基清除活性，以及抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或过氧化氢诱发的神经毒性进行测定。
如附图3、4和表1所示，仙人掌茎的二氯甲烷级份(FD)、丁醇级份(FB)和水级份完全没有显示出DPPH自由基清除活性和抑制由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或由过氧化氢诱发的神经毒性。从另一方面，乙酸乙酯级份(FE)显著地清除DPPH自由基，并且有效地抑制由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或由过氧化氢诱发的神经毒性，IC50分别为60.0μg/ml、15.2μg/m l和17.5μg/ml。得自茎的乙酸乙酯级份(FE)在抑制由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或由过氧化氢诱发的神经毒性方面，与得自加工过的果实的乙酸乙酯级份相似，并且优于得自果实的乙酸乙酯级份(GE)。这些结果显示，仙人掌茎或加工过的果实的乙酸乙酯提取物在大脑皮层神经元中表现出显著有效的抑制神经保护作用，因此能够用于治疗脑神经系统疾病例如中风、脑震荡、阿尔茨海默氏病或帕金森病。
实施例1-3中获得的每一提取物级份的DPPH自由基清除活性，以及抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的或过氧化氢诱发的神经毒性列在表1中。
表1.
实施例4从仙人掌的乙酸乙酯提取物中分离对于神经细胞表现出神经保护活性的化合物由于仙人掌的果实、加工过的果实和茎的乙酸乙酯提取物对于神经细胞显示出高的保护活性，如下所述，分离具有这样的活性的化合物。
<4-1>从仙人掌茎的乙酸乙酯提取物中分离出对神经细胞具有保护活性的化合物使用甲醇作为展开溶剂，以Sephadex LH-20(目录号LH-20-100，Sigma)作为固定相，对4.98g仙人掌的乙酸乙酯提取物进行柱色谱(4×5cm)纯化。用正相硅胶TLC(使用二氯甲烷∶甲醇＝5∶1作为展开剂)和反相硅胶TLC(使用水∶甲醇＝40∶60作为展开剂)分析级份后，收集具有类似极性的化合物以获得17个亚级份(亚级份1-17)。对具有较低极性的亚级份12进行反相柱色谱(LiChropreprp-18，40-63μm，2.5×35cm，目录号13900，Merck)纯化。用含水甲醇进行柱色谱纯化，其中甲醇含量从40％逐渐增加至60％，然后将洗脱液按照极性分成12个亚级份(亚级份12A至12L)。使用含水甲醇作为展开剂，对亚级份12B进行Sephadex LH-20柱色谱(2.5×35cm)纯化，获得了3-氧代-α-ionol β-D-葡糖苷(90mg)。从级份12E中分离出纯净的二氢山柰酚(30.7mg)。使用含水甲醇作为展开剂，对亚级份12C进行Sephadex LH-20柱色谱(2.5×35cm)纯化，获得二氢槲皮素(77.5mg)。并且依次地，在相同的条件下对亚级份12I进行Sephadex LH-20柱色谱纯化，使用50％的甲醇对其进行反相柱色谱纯化(LiChroprepRP-18，40-63μm，2.5×35cm，目录号13900，Merck)，获得槲皮素3-甲基醚(59.3mg)。使用甲醇作为展开剂，对亚级份12K进行Sephadex LH-20柱色谱纯化，并用制备RP-18 TLC(10×10cm×0.25cm，目录号15423，Merck，50％MeOH)进行纯化，获得山柰酚3-甲基醚(5.2mg)。
此外，对具有较低极性的亚级份15进行Sephadex LH-20柱色谱(2.0×30cm，甲醇)和制备RP-18 TLC(10×10cm×0.25cm，目录号15423，Merck，60％MeOH)纯化，获得了山柰酚(10mg)和槲皮素(10mg)。
<4-2>从仙人掌果实和加工过的果实中的乙酸乙酯提取物中分离出对神经细胞具有保护活性的化合物对1.82g仙人掌果实的乙酸乙酯提取物进行Sephadex LH-20柱色谱(4.0×26.5cm，甲醇)纯化。将获得的级份进行正相硅胶TLC和反相硅胶TLC纯化，同时改变展开剂的极性。收集具有类似极性的化合物，获得了13个亚级份(亚级份1’-13’)。从亚级份11’中分离出2.4mg山柰酚，从亚级份12’中分离出3.6mg槲皮素。使用硅胶，对亚级份8’进行柱色谱(2×30cm)纯化。当用二氯甲烷和甲醇的混合物(20/1)洗脱而同时逐渐增加极性时，获得了二氢山柰酚(6.1mg)。使用硅胶，对亚级份9’进行色谱纯化(1×18.5cm)。当用二氯甲烷和甲醇的混合物(20/1)洗脱而同时逐渐增加极性时，获得了二氢槲皮素(2.2mg)、山柰酚3-甲基醚(0.6mg)和槲皮素3-甲基醚(3.0mg)。将仙人掌加工过的果实的乙酸乙酯提取物进行相同的分离步骤，获得与仙人掌果实的乙酸乙酯提取物所得到的结果相同的结果。
实施例5对神经细胞具有保护活性的化合物的结构分析在Bruker 300光谱仪上记录NMR光谱。用通常的脉冲序列获得1H-1H COSY、HMQC和HMBC NMR。1H-NMR(300MHz)、13C-NMR(75MHz)和HMBC的相关光谱数据显示于表2和3。
表2.
1H信号(δ)*
表3.
13C信号
以上结果的分析显示，每一化合物的相应结构与先前所报道的是完全一样的山柰酚(Okuyama等人，Chem.Pharm.Bull.263701，1978)；槲皮素(Grande等人，Planta Medica.51414，1985)；二氢山柰酚(Shen等人，Phytochemistry 24155，1985)；二氢槲皮素(Nonaka等人，Chem.Pharm.Bull.351105，1987)；山柰酚3-甲基醚(Grande等人，Planta Medica 51414，1985)；槲皮素3-甲基醚(Barbera等人，Phytochemistry 252357，1986)；以及3-氧代-α-ionolβ-D-葡糖苷(Pabst等人，Phytochemistry 311649，1992)。
实施例6从仙人掌果实、加工过的果实和茎分离出的化合物的抗氧化和神经保护活性物用参考实施例1-8中描述的方法，分别评价DPPH自由基清除活性、超氧化物阴离子自由基清除活性，以及在培养的神经元中抑制由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶、过氧化氢、NMDA或生长因子的去除诱发的神经毒性的活性。
发现槲皮素、二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚显示出有效的DPPH自由基清除活性，二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚显示出通过黄嘌呤氧化酶系统有效地清除来自黄嘌呤的超氧化物阴离子自由基的活性(表4)。如表5以及附图5和6所示，已经证明了山柰酚、槲皮素、二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚可以很强地抑制由过氧化氢或黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶诱发的神经毒性。此外，结果表明二氢槲皮素和槲皮素3-甲基醚能抑制由NMDA诱发的神经毒性，特别是，槲皮素3-甲基醚还抑制了由生长因子的去除(withdrawal)而诱发的神经毒性。
表4.
表5.
实施例7槲皮素3-甲基醚的体内神经保护活性用TTC(2，3，5-三苯基四唑氯化物)染色法(Bederson等人，Stroke171304，1986)测定由短暂病灶性脑缺血引起的脑损伤。将大脑中动脉闭塞一天后，用铡除刀将鼠处死，然后从中取出脑。使用脑基质(ASIInstruments，Warren，MI，USA)，从距离额极1mm的点开始，将取出的脑依次切割至2mm厚度来制备脑冠状切片。在37℃，将每一切片用2％的TTC在0.9％的盐水溶液中处理并培养60分钟以便染色。将用TTC染色的每一切片用磷酸盐缓冲的福尔马林溶液固定，并用装备了CCD照相机的电脑获得其反侧影象。使用影象分析软件(Optimas，Edmonds，WA，USA)来测定没有发生深红色染色的大脑皮层和纹状体的梗塞面积(cm2)，然后乘以切片的厚度来计算梗塞的体积(mm3)。最后，计算全部梗塞体积作为大脑皮层和纹状体的梗塞总量。在这个时候，如下计算校正的梗塞以便对肿胀作校正通过从左大脑半球(对侧的非局部缺血侧)的总面积中扣除右大脑半球(同侧的局部缺血侧)的正常组织面积，计算每一切片的校正的总梗塞面积，然后按照上面所述的相同方法，从校正的总梗塞面积计算校正的总梗塞体积。
另外，用下面的公式计算由局部缺血诱发的大脑半球的肿胀率。
A所有冠状切片中同侧缺血脑半球的体积(mm3)B所有冠状切片中对侧正常脑半球的体积(mm3)表6.
实施例8槲皮素3-甲基醚的神经恢复作用如下所述，使用测量神经评分的方法(Relton等人，Stroke 281403，1997)，测定槲皮素3-甲基醚在按照实施例7的方法治疗的大鼠中的神经恢复作用。
检测前肢弯曲(当提起大鼠的尾巴将其完全悬在空中时)、前肢弯曲的持续时间(在10秒期间前肢弯曲的时间)和运动的对称性(当使大鼠仅用前肢行走的同时通过提起尾巴将其后肢悬在空中时)，将观察到的分数概括于表7中。
表7.
通过把表7显示的分数加起来，将每一组的最终神经分数显示于表8(每一试验分数用平均值±标准误差的形式表示)，并且还将其描绘于附图12中。10分表示正常(无神经缺陷)，分数越低，神经缺陷的程度就越大。
表8
如表8和图12所示，用槲皮素3-甲基醚治疗的组与对照组比较，表现出显著较高的神经分数，证明槲皮素3-甲基醚发挥了神经恢复作用。
尽管对本发明的实施方案进行了描述和举例说明，但很明显，在不背离本发明的实质的前提下，可以对其做出各种变化和修改，其应当仅由权利要求书来限制。
权利要求
1.仙人掌的乙酸乙酯提取物在预防和治疗脑疾病、缺血性疾病和心血管系统疾病中的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述仙人掌的乙酸乙酯提取物包含山柰酚、二氢槲皮素或槲皮素3-甲基醚作为有效成分。
3.权利要求1的应用，其中所述仙人掌的乙酸乙酯提取物是仙人掌茎、果实或加工过的果实的乙酸乙酯提取物。
4.权利要求3的应用，其中所述仙人掌的乙酸乙酯提取物是通过包括下列步骤的方法获得的1)在室温下，将仙人掌的茎、果实或加工过的果实在0.1-10L的醇类溶剂中浸泡4-5天，以获得提取混合物，2)过滤该提取混合物，然后从滤液中除去醇以获得醇提取物，和3)将0.1-10L水加到醇提取物中，用0.5-2L乙酸乙酯(EtOAc)提取生成的水溶液。
5.权利要求4的应用，其中所述醇类溶剂是C1-3醇或C1-3醇的水溶液。
6.权利要求1的应用，其中所述疾病是中风、脑震荡、阿尔茨海默氏病、帕金森病、心肌梗塞或脑梗塞。
7.选自下列的化合物在预防和治疗脑疾病、缺血性疾病和心血管系统疾病中的应用山柰酚、二氢槲皮素、槲皮素3-甲基醚、它们的可药用盐、水合物、溶剂化物、立体异构体及其混合物。
8.权利要求7的应用，其中所述疾病是中风、脑震荡、阿尔茨海默氏病、帕金森病、心肌梗塞或脑梗塞。
全文摘要
本发明涉及仙人掌的乙酸乙酯提取物和由其分离的化合物在预防和治疗脑疾病例如阿尔茨海默氏病、中风和帕金森病，由局部缺血引起的细胞和组织损伤，或心血管系统疾病例如心肌梗塞中的应用。
文档编号A61P25/28GK1596110SQ02823663
公开日2005年3月16日 申请日期2002年10月29日 优先权日2001年10月29日
发明者李龙燮, 朴虎君, 秦昶培, 金亨子, 赵贞淑, 朴美贞, 宋仑宣 申请人:韩国科学技术研究院