银杏叶提取物注射液及其制备方法

专利名称：银杏叶提取物注射液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中药注射液及其制备方法，尤其是涉及银杏叶提取物注射液及其制备方法。
目前的研究表明银杏叶提取物中有效成分为银杏总黄酮苷、白果内酯及银杏内酯。银杏叶提取物的固体制剂包括银杏叶片、银杏叶胶囊、银杏叶颗粒剂等。它们均对制剂中银杏总黄酮苷、白果内酯及银杏内酯的含量做了规定。由于白果内酯很不稳定，给注射液的制备带来一定的难度。德国舒培大药厂研制上市了商品名为Ginaton(金纳多)的银杏叶注射液，每支注射液还有银杏叶提取物17.5mg，标定含银杏总黄酮4.2mg，未对白果内酯及银杏内酯作出规定。中国专利CN1162474SA中也公开了一种银杏叶注射液及其制备方法，但未对制剂质量作出明确的规定。
本发明的构思如下(1)由于银杏内酯不溶于水，若要使制得的银杏叶提取物注射液中含有上述成分，需要选用合适的溶媒；(2)由于白果内酯不稳定，需要选用合适的助剂增加其稳定性；(3)由于银杏总黄酮苷易被氧化，需要使用合适的抗氧剂；(4)经检查可知，银杏叶提取物中含有鞣质，其显著影响注射液的澄明度并可产生刺激性，因此在制备注射液时必须除尽鞣质。
本发明的技术方案如下一种银杏叶提取物注射液，由含有有效成分的银杏叶提取物、pH值调节剂、抗氧剂及医学上可接受的溶媒组成。
本发明的注射液各组份含量如下银杏总黄酮苷24％～60％，占银杏叶提取物的重量比，银杏内酯6％～15％，占银杏叶提取物的重量比，白果酸0～2ppm，注射溶媒醇水体积比(0.1～0.4)∶1。
由于银杏叶提取物中含有银杏内酯等脂溶性成分，单独以注射用水作为溶媒，银杏内酯等不能溶解，故选用一定比例的醇水混合物作为溶煤。醇的比例要合适，偏高会带来溶血、刺激性等副反应，偏低不能溶解银杏内酯等脂溶性成分。本发明所选用的醇水比例为0.1～0.4∶1(体积比)。所使用的醇例如乙醇、1，2-丙二醇等，也可以是醇的混合物，如乙醇和1，2-丙二醇的混合物等。
银杏总黄酮苷和白果内酯易氧化，故在注射剂的处方中使用抗氧剂。本发明所选用的抗氧剂例如亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、半胱氨酸等。
注射剂必须满足一定的pH值，中药注射剂的质量要求中将pH值限定为4.0～9.0。由于银杏叶提取物中还有许多未知成分，为保持pH值不变及提高该注射剂的稳定性，本发明使用了pH值调节剂。本发明所选用的pH值调节剂例如醋酸-醋酸钠、枸橼酸-枸橼酸钠、乳酸等。
银杏叶提取物注射液的制备方法如下(1)按处方量的120％取银杏叶提取物，加90％的乙醇溶解；(2)边搅边缓缓加入明胶溶液至不再产生沉淀为止，静置，无菌过滤；(3)滤液进行鞣质检查合格后挥至无乙醇味；(4)另取pH值调节剂、抗氧剂，用注射用水溶解，抗氧剂的用量是0.05％～0.2％，溶液体积百分比，加至上述溶液中，调节pH值在3.5～7.5之间；(4)加0.1～0.4(体积比)的醇，加注射用水至全量。(5)加入0.5‰～1.5‰溶液体积百分比的针用活性炭，60℃下砂芯循环，脱炭，过滤。(6)滤液检查合格后，灌装，充氮气，熔封。(7)流通蒸气灭菌，即得。
本发明制备方法中较好的条件是所使用的醇是下述中的任一种或它们的混合物的任一种乙醇、1，2-丙二醇、甘油、聚乙二醇。
所使用的抗氧剂是下述中的任一种亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、半胱氨酸、蛋氨酸、维生素C或硫脲。
所使用的pH值调节剂是下述中的任一种醋酸-醋酸钠、枸橼酸-枸橼酸钠、乳酸、酒石酸-酒石酸钠、磷酸盐体系如磷酸氢二钠(钾)--磷酸二氢钠(钾)、碳酸盐体系如碳酸氢钠-碳酸钠，磷酸氢二钠-枸橼酸等缓冲液。
本发明的制备方法中使用明胶是为了除去鞣质。除鞣质时，常用的有改良明胶法、醇溶液调pH法及聚酰胺法。由于聚酰胺吸附本品的指标成分总黄酮醇苷，故不能使用。利用改良明胶法和醇溶液调pH法除去本品所含鞣质，结果表明醇溶液调pH法不能有效地除去本品中的鞣质且影响本品指标成分白果内酯的稳定性，而改良明胶法可有效除去鞣质且对总黄酮醇苷的吸附较小，因此选用改良明胶法除去鞣质。
在改良明胶法中，明胶常用浓度为2％～5％。
本发明中较好的pH值调节在4.0～4.5之间。
在使用流通蒸气法进行灭菌时，优选的条件是110～115℃热压灭菌20～30min。温度高或时间长会影响白果内酯的稳定性；而温度低或时间短则会造成灭菌不完全。
本发明的注射液提高了银杏叶提取物中白果内酯的稳定性，提供了一种含有银杏总黄酮苷、白果内酯及银杏内酯的银杏叶提取物注射液，提高了银杏叶提取物中白果内酯的稳定性，并且在制剂的放置过程中白果内酯这一成分仍稳定。
本发明注射液的药理实验结果如下药效学试验1、银杏叶提取物注射液对大鼠局部脑缺血的保护作用利用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型观察银杏叶提取物注射液对局灶性脑缺血性损伤的影响，并与阳性药物Ginaton注射液进行比较。成年雄性SD大鼠60只，体重251.85±10.34g，随机分为6组，每组10只，分别为模型对照组、溶媒处理组、阳性对照组、银杏叶提取物注射液大、中、小剂量组，依次经尾静脉注射生理盐水、注射用溶媒、Ginaton 15mg/kg、银杏叶提取物注射液30、15、7.5mg/kg，于缺血即刻及缺血后2小时各注射一次。缺血后8及24小时参考Longa等的方法对大鼠神经功能缺陷情况进行评分，末次评分后腹腔注射过量水合氯醛处死动物，迅速取脑测定脑组织肿胀程度及脑梗死范围。结果显示，银杏叶提取物注射液中、小剂量组大鼠缺血后24小时神经功能缺陷与模型对照组相比有明显改善(P＜0.05)，与阳性对照组相比无明显差别(P＞0.05)；银杏叶提取物注射液各剂量组大鼠脑组织肿胀程度及脑梗死范围与模型对照组相比均有明显改善(P＜0.05)，与阳性对照组相比无明显差别(P＞0.05)。试验结果提示银杏叶提取物注射液注射液具有改善局灶性脑缺血损伤的作用，且其作用与同剂量Ginaton注射液相比无明显差别。
2、银杏叶提取物注射液对犬脑血流量和血压的影响本实验观察了银杏叶提取物注射液和其溶媒对犬脑血流量、收缩压、舒张压的影响。犬8条，雌雄兼用，体重11.2±1.8kg。银杏叶提取物注射液和其溶媒分别设3个剂量组，银杏叶提取物注射液1.25、2.5、5.0mg/kg；及与上述剂量相当容量的溶媒0.025、0.05、0.1ml/kg，作为溶剂对照组。每次给药前及给药后1，3，5，10，15，20，30分钟分别测定犬的脑血流量、收缩压和舒张压。实验时先序贯静脉注射三个剂量溶媒，溶媒给药结束，待脑血流量和血压基本恢复正常后，再给银杏叶提取物注射液。结果显示静脉注射溶媒0.025、0.05、0.1ml/kg后，与给药前相比较，对脑血流量、收缩压、舒张压无明显影响。静脉注射银杏叶提取物注射液1.25mg/kg，对脑血流量无明显作用，静脉注射银杏叶提取物注射液2.5、5.0mg/kg，1～5分钟明显增加脑血流量(P＜0.05，P＜0.01)，与相应的溶媒组比较，有显著性差异(P＜0.05，P＜0.05)，10分钟后基本恢复。静脉注射三个剂量的银杏叶提取物注射液后，在1～5分钟收缩压和舒张压都有不同程度的降低，10分钟后基本恢复。上述结果提示2.5mg/kg和5.0mg/kg剂量组的银杏叶提取物注射液具有明显增加犬脑血流量的作用。
3、银杏叶提取物注射液及其溶媒对兔脑血流量和血压的影响本实验观察了银杏叶提取物注射液和其溶媒对兔脑血流量、收缩压、舒张压的影响。兔8只，雌雄兼用，体重2.6±0.2kg。银杏叶提取物注射液和其溶媒分别设3个剂量组，为2.5、5.0、10.0mg/kg；与上述相当容量的溶媒为0.05、0.1、0.2ml/kg，作为溶剂对照组。每次给药前及给药后1，3，5，10，15，20，30分钟分别测定兔的脑血流量、收缩压和舒张压。溶媒记录时间为1，5，10分钟。实验时先序贯静脉注射三个剂量的溶媒，溶媒给药结束后，脑血流量和血压基本恢复正常后，再给银杏叶提取物注射液。用同样的实验方法观察了阳性对照药-金纳多注射液对兔脑血流量、收缩压、舒张压的影响。兔8只，雌雄兼用，体重2.5±0.17kg。共设三个剂量组2.5、5.0、10.0mg/kg。实验时先序贯静脉注射三个剂量组的金纳多注射液，每次给药前及给药后1，3，5，10，15，20，30分钟分别测定兔的脑血流量、收缩压和舒张压。实验结果显示静脉注射溶媒0.05、0.1、0.2ml/kg后，脑血流量、收缩压、舒张压均无明显改变。静脉注射银杏叶提取物注射液2.5、5.0、10.0mg/kg后，脑血流量即刻增加，其中2.5mg/kg组作用最大，在15分钟时脑血流量的增加，与相应溶媒相比差异显著。三个剂量组的银杏叶提取物注射液对收缩压和舒张压都无明显影响。静脉注射金纳多注射液2.5、5.0、10.0mg/kg，有增加脑血流量的作用，其中10.0mg/kg组与给药前相比差别著性(p＜0.05)。三个剂量组的金纳多对收缩压和舒张压都无明显影响。银杏叶提取物注射液2.5mg/kg与金纳多10.0mg/kg的作用比较，两组间T检验显示无明显差异，提示两组药物的作用强度相近。
以上结果提示，2.5mg/kg剂量组银杏叶提取物注射液具有明显增加兔脑血流量作用，并且其作用强度与金纳多注射液10.0mg/kg剂量组的作用相近。
4、银杏叶提取物注射液对离体大鼠左心室乳头肌的作用观察银杏叶提取物注射液对离体大鼠左心室乳头肌的作用。大鼠击头处死后，迅速取出心脏，打开左心室，暴露出左室乳头肌。用0000号丝线结扎前乳头肌腱索端后剪下，固定于恒温浴槽内，静止张力1g。平衡30分钟(每隔15分钟换一次营养液)后开始电刺激，待其收缩幅度稳定后记录用药前收缩曲线，然后给药，记录用药后10分钟内的收缩曲线，计算心室乳头肌收缩的变化百分率。结果显示25ml的浴槽内累积浓度给予5％银杏叶提取物注射液0.125～1ml(浴槽内银杏叶提取物的终浓度为0.5～2mg/ml)，可浓度依赖性增加乳头肌的收缩力；而给予相同容量的溶媒，则浓度依赖性减弱乳头肌的收缩力。银杏叶提取物注射液(含溶媒)增加乳头肌收缩的EC50为10.23mg/ml，95％可信限为1.89～55.32mg/ml；在排除溶媒作用后银杏叶提取物注射液增加乳头肌收缩的EC50为0.94mg/ml，95％可信限为0.49～1.83mg/ml，两者差别显著(p＜0.05)。
一般药理研究试验观察了银杏叶提取物注射液和其溶媒对小鼠自发活动、协调运动的影响及对犬心率、心电参数、血压、呼吸的影响。1、银杏叶提取物注射液静脉给药对小鼠自发活动的影响昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重19.37±0.89g，分为5组，每组12只。设3个用药组和2个对照组(生理盐水和溶媒)。用药组剂量分别为10.5、21和42mg.kg-1，对照组给予等容量生理盐水或溶媒。实验小鼠均连续给药一周，并于给药前和给药的第1，5，10分钟测定各组小鼠的自发活动波，连续测定15秒。结果显示与生理盐水组比较，静脉注射溶媒后可短时间明显抑制小鼠的自发活动，10分钟后作用趋于消失，银杏叶提取物注射液不同剂量组小鼠给药后1和5分钟的自发活动与生理盐水组比较亦有明显减少，但与溶媒组相似，无显著差异，提示该抑制作用可能与制剂中的溶媒有关。2、银杏叶提取物注射液静脉给药对小鼠协调运动的影响应用爬杆法观察静脉注射银杏叶提取物注射液对小鼠协调运动的影响。昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重19.96±0.98g，随机分成5组，每组12只。对照组静脉注射等容量的生理盐水或溶媒，用药组分别静脉注射银杏叶提取物注射液10.5、21及42mg·kg-1，在给药后1、10、20及30分钟测定小鼠协调运动能力，协调运动能力以0-3级来表示，数据用X±SD表示，采用等级检验法进行分析处理(各组与对照组比较)。结果可见，给药后1分钟，生理盐水组小鼠与用药前相同，均为0级；溶媒对照组、小、中、大剂量银杏叶提取物注射液组部分小鼠呈1.5-2级，与生理盐水组比较，协调运动能力明显受抑(p＜0.01)，用药组与溶媒组之间无显著差异(p＞0.05)；而10分钟至30分钟各时间点各组小鼠协调运动能力恢复正常与生理盐水组比较无显著差别(P＞0.05)。3、银杏叶提取物注射液静脉给药对犬心率、心电参数、血压、呼吸的影响犬8条，雌雄兼用，体重11.2±1.8kg。银杏叶提取物注射液设3个剂量组，分别为1.25，2.5，5.0mg/kg；与上述剂量相当容量的溶媒为0.025、0.05、0.01ml/kg，作为溶剂对照。静脉给药，每次给药前及给药后1，3，5，10，15，20，30分钟分别测定犬收缩压、舒张压、平均动脉压、心率、心电参数及呼吸变化。实验时先序贯静脉注射三个剂量溶媒，溶媒给药结束后，待各实验参数基本恢复正常后，再给银杏叶提取物注射液。结果显示三个剂量组的溶媒，其各个时间段与给药前相比较，对犬收缩压，舒张压，平均动脉压、呼吸及心率、心电参数均无明显改变。三个剂量组的银杏叶提取物注射液对犬的收缩压、舒张压、平均动脉压、心率与用药前相比较，在给药后1～5分钟收缩压，舒张压，平均动脉压降低，并伴有心率减慢，与给药前比较，差别显著，与溶媒比较，也有显著差异，其中2.5mg/kg的作用较强，这种血压和心率变化在30分钟内基本恢复。银杏叶提取物注射液和溶媒对犬呼吸频率无明显影响。实验结果表明银杏叶提取物注射液在给药后有短暂的收缩压、舒张压降低和心率减慢的作用。
急性毒性试验小鼠单次静脉注射银杏叶提取物注射液17.5ml/kg(银杏叶提取物875mg/kg，此剂量为小鼠有效剂量的100倍)，观察其对小鼠的急性毒性反应。结果如下银杏叶提取物组小鼠中，除了1只雄鼠在用药后10分钟死亡外，其余小鼠在用药后10分钟内精神萎靡，平卧不动，20分钟后逐渐恢复，观察7天未见死亡。雄鼠LD50＞875mg/kg；雌鼠LD50＞875mg/kg。雌雄小鼠间无明显差别。
安全性试验包括静脉注射血管刺激性试验、局部刺激性、溶血试验和过敏试验。结果表明银杏叶提取物注射液没有血管刺激性和局部刺激性，不会引起溶血和过敏。
长期毒性试验1、犬长期毒性试验观察连续12周静脉注射银杏叶提取物注射液，对犬产生的毒性反应。Beagle犬17只，随机分为4组，即大剂量组、溶媒组、小剂量组各5只(雌2，雄3)，对照组2只(雌2)，其中大剂量组和小剂量组静脉注射银杏叶提取物注射液，以银杏叶提取物计算分别为95mg·kg-1(1.9ml·kg-1)，9.5mg·kg-1(0.19ml·kg-1)，溶媒组静脉注射溶媒1.9ml·kg-1，对照组静脉注射生理盐水1.9ml·kg-1，每日1次，每周给药6天，总共给药12周。用药期间观察犬的体重及其他一般状况，用药前及用药后每4周进行一次血液学、血液生化、心电图、尿常规检查，实验结束后进行血液学、血液生化、心电图、尿常规检查。然后每组留1只犬，其余动物处死，测定脏器系数、并进行病理学检查。未处死犬停药后继续观察3周后处死，重复上述检测。试验结果显示，试验过程中各组动物间摄食量及体重改变无明显差异。各组动物血液及血液生化学指标均未见明显改变。病理检查显示，大剂量组、小剂量组、溶媒组犬各器官均未见有与药物相关的毒性反应。
2、大鼠长期毒性试验观察连续12周腹腔注射银杏叶提取物注射液，对大鼠产生的毒性反应。SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为3组，每组20只，分别为对照组、小剂量组和大剂量组，其中大剂量组和小剂量组腹腔注射银杏叶提取物注射液，剂量分别为750，75mg·kg-1(以银杏叶提取物计算)，对照组腹腔注射溶媒(15ml·kg-1)，每日1次，每周给药6天，停1天，总共给药12周。用药期间观察大鼠体重及其他一般状况，实验结束后处死2/3动物进行血液学、血液生化、病理学、脏器系数等检查；其余1/3动物停药后继续观察4.5周，然后处死，重复上述检测。试验结果显示，试验过程中各组动物间摄食量及体重改变无明显差异，用药期间，大剂量组动物在用药11周有2只大鼠死亡，小剂量组未见动物死亡。各组动物血液及血液生化学指标均未见明显改变。病理检查显示，大剂量组的病理改变与腹腔注射引起的局部炎症反应有关，如改变给药途径可避免。
本发明的注射液提供了一种含有银杏总黄酮苷、白果内酯及银杏内酯的银杏叶提取物注射液。经药效学试验和药理研究证明该注射液具有良好的改善心血管功能作用，而毒性试验表明未见毒性反应。本发明方法原料来源广泛，操作过程简单，工艺上容易实现，更主要的是本发明提高了产品中白果内酯的含量和稳定性，并且在制剂存放中白果内酯仍显稳定，使本发明产品药效显著提高。
权利要求
1.一种银杏叶提取物注射液，含有银杏叶提取物的有效成分及医学上可接受的溶媒，其特征是各组份含量是银杏总黄酮苷24％～60％，占银杏叶提取物的重量比银杏内酯6％～15％，占银杏叶提取物的重量比白果酸0～2ppm注射溶媒醇水体积比0.1～0.4∶1。
2.根据权利要求1所述的银杏叶提取物注射液，其特征是按如下步骤制备(1)取银杏叶提取物，加乙醇溶解；(2)边搅边缓缓加入明胶溶液至不再产生沉淀为止，静置，无菌过滤；(3)滤液进行鞣质检查合格后挥至无乙醇味；(4)另取pH值调节剂、抗氧剂，用注射用水溶解，加至上述溶液中，pH值调节在3.5～7.5之间，抗氧剂的用量是0.05％～0.2％的溶液体积百分比；(5)加0.1～0.4体积比的醇，加注射用水至全量；(6)加入0.5‰～1.5‰溶液体积百分比的针用活性炭，砂芯循环，脱炭，过滤；(7)滤液检查合格后，灌装，充氮气，熔封；(8)流通蒸气灭菌，即得。
3.根据权利要求2所述的银杏叶提取物注射液，其特征是所使用的醇是下述中的任一种或它们的混合物的任一种乙醇、1，2-丙二醇、甘油、聚乙二醇。
4.根据权利要求2所述的银杏叶提取物注射液，其特征是所使用的抗氧剂是下述中的任一种亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、半胱氨酸、蛋氨酸、维生素C、硫脲。
5.根据权利要求2所述的银杏叶提取物注射液，其特征是所使用的pH值调节剂是下述中的任一种醋酸-醋酸钠、枸橼酸-枸橼酸钠、乳酸、酒石酸-酒石酸钠、磷酸盐体系、碳酸盐体系、磷酸氢二钠-枸橼酸缓冲液。
6.根据权利要求2所述的银杏叶提取物注射液，其特征是所使用的明胶溶液的浓度为2％～5％。
7.根据权利要求2所述的银杏叶提取物注射液，其特征是pH值调节在4.0～4.5之间。
8.根据权利要求2所述的银杏叶提取物注射液，其特征是110～115℃热压灭菌20～30min。
全文摘要
本发明公开了一种银杏叶提取物注射液及其制备方法。现有技术存在注射液中有效成分如银杏内酯含量低，且不稳定之不足。本发明的注射液由含有有效成分的银杏叶提取物、pH值调节剂、抗氧剂及医学上可接受的溶媒组成。在制备时，使用明胶除去鞣质，加入pH值调节剂及抗氧剂，并使用一定比例的醇水混合物作为溶媒。本发明的处方及制备方法可获得含有银杏总黄酮苷、白果内酯及银杏内酯的银杏叶提取物注射液，且制剂稳定。
文档编号A61K31/7048GK1430968SQ0311528
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者印春华, 唐翠, 魏秀莉 申请人:复旦大学