含有p43蛋白和紫杉醇的治疗癌症的药用性合成物以及应用其的治疗方法和用途的制作方法

专利名称：含有p43蛋白和紫杉醇的治疗癌症的药用性合成物以及应用其的治疗方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有药用性合成物P43蛋白和紫杉醇的、治疗癌症的药用性合成物，使用该合成物的治疗方法及其应用。特别是，本发明涉及药用性合成物以及使用它的治疗方法及其应用，其中同时，或单独或者顺序使用P43蛋白和紫杉醇，以获得一种增强的抗癌效果。
背景技术：
近年来，癌症的治疗多采用外科手术、放射疗法和化学疗法。其中，化学疗法是应用一种抗癌药物来治疗癌症。由于应用氨甲喋呤治疗绒毛膜癌的疗效很理想，致使化学疗法的应用非常广泛。目前，有大约60多种不同的抗癌药物应用于临床。因为获得了致癌因素和癌细胞特征的大量信息，使得人们在研制开发抗癌新药上进行了积极的探索。
强力霉素和顺铂，均是在二十世纪七十年代开发研制的两种最常见的抗癌药物。而近年来所出现的更多的抗癌药物包括紫杉醇、泰索帝(docetaxel)、fludarabine、cladribine和异长春花碱，并且已有报道，在抗癌的效果和应用范围上，这些抗癌药物好于以前所应用的抗癌药物。
紫杉醇是目前研究最多的一种抗癌药物，它包含有一个taxane的变型合成物，该合成物可从紫杉属植株的茎干中分离出来。紫杉醇由于能够在细胞分裂期抑制纺锤体的功能，而在治疗白血病和癌症上具有公认的疗效。更为众所周知的是，紫杉醇在治疗卵巢癌的患者上，有至少30％的治愈率；在治疗乳腺癌的患者上，有至少50％的治愈率；并且在治疗肺癌的患者上，有至少20％的治愈率(参见E.K.Rowinsky等.，J.Natl.Cancer Inst.，821247-1259，1990)。
然而，上述抗癌药物都有一个缺陷，即当这些药物在一段时间内长期反复应用时，或在癌症复发使得癌细胞对抗癌药物产生了抵抗力时，它们的抗癌的治疗效果便会消失。此外，大多数的抗癌药物发挥其抗癌作用是通过抑制细胞内的核酸的合成，或者是通过直接粘附于核酸并对其功能造成损害来进行的。如此，抗癌药物不仅仅选择性地对癌细胞造成损伤，而且还损伤到了正常的细胞，特别是那些进行细胞分化的组织细胞。因此，应用这些抗癌药物有一定的危险性，其存在的副作用诸如对骨髓功能的损害、对胃肠道粘膜的损伤、以及脱发等等。
为了克服上述与对抗癌药物产生耐药性相关的问题，首选的方法是运用单独一种抗癌药物的组合化学疗法，该治疗方法中包括应用具有不同作用机制的、相互之间没有交叉耐药性的、不同种类的药物组合方案。另外的一种对抗抗癌药物副作用的方法是，开发研制一种不具有副作用的新的抗癌药物，或者是以最小的有效剂量应用那些现有的抗癌药物。
国际专利第0152882号公开了一种治疗癌症的方法，即联合应用temozolomide和α-干扰素于一个患者。国际专利第0234244号则公开了一种药用性合成物用于治疗癌症，该合成物包含有喜树碱和1，2-二苯乙烯的衍生物。美国专利第0152882号公开了一种治疗癌症的方法，该方法联合应用了众所周知的抗癌药物edatrexate和taxane。
在此其间，本发明人在国际专利第0195927号和韩国专利申请第2001-112108号中描述了作为一种抗癌药物和抗血管生成剂的P43蛋白的新用途。
与之相关的是，在开发研制了新型的抗癌药物同时，本专利的发明者发现，与分别应用上述的P43蛋白或者紫杉醇相比较，P43蛋白和紫杉醇的联合应用，有着非常好的疗效。结果，本发明完成了，因此得到了具有增强的抗癌活性、包含P43蛋白和紫杉醇的新的药用性合成物，和应用该合成物治疗癌症的方法。
发明的详细描述本发明的目的是提供了一种包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物，它能应用于癌症的治疗。
本发明中的另一个目的是提供一种治疗癌症的方法，它包括将包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物应用于患者。
本发明的另一个更进一步的目的是提供一种P43蛋白和紫杉醇的用途，它能用于制备药用性合成物，以应用于患者来治疗癌症。
附图的简要描述

图1所示的是移植以人肺癌细胞系NCI-H460的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的存活率的变化情况。
图2所示的是移植以人肺癌细胞系NCI-H460的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的体重的变化情况(*表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.05；**表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.01)。
图3所示的是移植以人肺癌细胞系NCI-H460的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的绝对肿瘤大小的变化情况(*表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.05；**表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.01)。
图4所示的是移植以人肺癌细胞系NCI-H460的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的相对肿瘤大小的变化情况(*表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.05；**表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.01)。
图5所示的是移植以人肺癌细胞系NCI-H460的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的肿瘤重量的变化情况(A阴性对照组；B应用p43蛋白25毫克/千克体重组；C应用p43蛋白50毫克/千克体重组；D联合应用p43蛋白25毫克/千克体重和紫杉酚5毫克/千克体重组；E联合应用p43蛋白50毫克/千克体重和紫杉酚5毫克/千克体重组)。
图6所示的是移植以人胃癌细胞系NUGC-3的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的存活率的变化情况。
图7所示的是移植以人胃癌细胞系NUGC-3的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的体重的变化情况(*表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.05；**表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.01)。
图8所示的是移植以人胃癌细胞系NUGC-3的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的绝对肿瘤大小的变化情况(*表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.05；**表示所获得的数据与阴性对照组相比可见显著性差异，p＜0.01；a在实验的第14天有5只阴性对照组的实验动物死亡)。
图9所示的是移植以人胃癌细胞系NUGC-3的裸鼠，在单独或者联合应用P43蛋白和紫杉醇之后的相对肿瘤大小的变化情况。
本发明的最佳实施例由此，本发明提供了一种包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物，它能应用于癌症的治疗。
本发明进一步提供了一种治疗癌症的方法，它包括将包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物应用于患者。
本发明的另一个更进一步地提供一种P43蛋白和紫杉醇的用途，它能用于制备药用性合成物，以应用于患者来治疗癌症。
这里所用的专业术语“有效剂量”意思是指所应用的合成物的剂量，在治疗哺乳动物的癌症时是有效的。这种包含有P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物，通过联合应用上述的药物，在治疗癌症时有协同作用效果。
在上述专业术语“协同”的意思是，当两种合成物联合应用时所产生的治疗效果，比这两种合成物分别分别应用时的治疗效果之和还要好(Chou和Talalay，Adv.Enzyme.Regul.，2227-55，1984)。
专业术语“联合应用”(或者称“组合应用”)的意思是一种合成物或者是一种成分与其它的成分一起应用于同一实验动物。共同应用每一种药物成分或者是合成物的意思是为了获得想得到的治疗效果，每一种成分可以同时，或者顺序、以一定的时间间隔依次加以应用。
以下是对本发明的详细描述。
该药用性合成物，用于癌症的治疗，特征是它包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇。
在本发明中的药用性合成物所含有的P43蛋白，已由本发明者此前所提出申请的国际专利公开号第0195927号和韩国专利申请公开第2001-112108号中加以公开。上述两份文件在此处由申请者合并成为一体。
本发明中的药用性合成物所含有的P43蛋白，指的是天然的或者是重组的P43蛋白，或者是带有充分地、同等生物活性的蛋白。该蛋白所具有的充分地、同等生物活性包括天然的或者是重组的P43蛋白的功能性的等价物和功能性的衍生物。
上述“功能性的等价物”代表的是P43蛋白的氨基酸序列的修饰突变，即天然的P43蛋白的全部或者是一部分的氨基酸序列被替换，或者是一部分的氨基酸序列被删除或者出现了添加，但重组的P43蛋白的生物学效应与天然的P43蛋白具有充分的等效性。“功能性的衍生物”代表的是具有增强的或者降低的物理或者是化学蛋白质特性的经修饰的P43蛋白，并且与天然的P43蛋白具有充分的等效的生物学活性。
本发明中的P43蛋白可以从哺乳动物，最好从人机体中获得。更加适宜地是，这种蛋白质带有正如此前所描述的众所周知的序列(国际专利公开第0195927号和韩国专利申请公开第2001-112108号中)。
在本发明中所应用的P43蛋白，可以运用基因工程技术，依照上面所提及已知的氨基酸序列加以合成(参见Park等.，J.Biol.Chem..274166673-166676，1999)。例如，上述的P43蛋白可以根据国际专利公开第0195927号和韩国专利申请公开第2001-112108号中所描述的基因工程技术加以制备。
本发明中的药用性合成物所包含的紫杉醇，作为一种抗癌药物是众所周知的。本发明中的药用性合成物所包含的紫杉醇，包括一种天然来源提取物，和根据美国专利第5,440,056号的化学合成的合成物，及其衍生物。紫杉醇的化学结构式也是众所周知的(Kingston等，Studies inorganic Chemistry，26219-235，1986).
紫杉醇可以通过已知的化学合成方法、提取方法以及通过采用可产生紫杉醇的细胞系的培养方法加以制备。另外，作为药物的应用方案，紫杉醇具有商业上的可利用性。作为包含有紫杉醇的一个药物使用方案的实例，应提及的是已制成的、并由美国Bristol-MyersSquibb公司经销的泰素(TXAOL)。在本发明中的例证中，我们应用了韩国Samyang Genenx公司商业出品的GENEXOL。
对本发明的药用性合成物，P43蛋白和紫杉醇可以按配方制造形成一种单一的合成物，或者一种各自的合成物。
对于本发明的包含有P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物，其中的每一种成分均可以同时、分别或按顺序应用。例如，当本发明的药用性合成物中的每一种成分存在于一个单一的合成物中时，其中所有的成分可能是同时加以应用。另一方面，如果这些药用性合成物并不是存在于一个单一的合成物中时，其中的一种成分可以先前或者随后服用，也可以和/或者与另一种成分一起加以应用。本发明的药用性合成物的应用顺序，也就是说，不管是谁在前在后应用、同时、分别或者按顺序加以应用，均由医生或者是该领域的专家来决定。应用顺序的变化大多依赖于经慎重考虑过的多种因素。
更适宜地是，因为没有按照配方制入一个单独应用单位中的药用性合成物，便会使得先行应用了P43蛋白，事隔一段时间以后才应用该合成物中的另一种成分，也就是紫杉醇。更为适宜地是，从开始服药的第一天起，每天应用P43蛋白，而紫杉醇则在服药的第一天随即开始应用，并且在每隔2-3天之后才开始连续应用。例如，P43蛋白每天一次开始应用，而紫杉醇则应用5次，即在开始用药后的第一天、2天、5天、8天和11天应用。
本发明的药用性合成物可以依照此前所描述的用药顺序，进行全身性应用或者是局部应用。对于用药途径，可以考虑口服或者非肠道应用。非肠道应用的例子包括静脉内注射应用、皮下注射应用、腹膜内注射应用、体外应用、直肠内应用、皮内应用、鼻腔内应用、气管内应用或者支气管内应用，以及肺内吸入应用。一种较理想的应用方式是非肠道应用，更为理想的方式为腹膜内应用或者是皮内应用。
另外，由于本发明的药用性合成物是按照以上所描述的应用方式加以服用的，因此，该合成物需要通过更进一步地包含有一种药用性的合适的载体，来达到按照一个适当的组成配制而成。这种药用性的合适的载体包含有一种无活性的稀释剂、一种填充剂、水、或者不同种类的有机溶剂。如果需要的话，本发明中的药用性合成物还可以包含有另外的成分，例如调味剂、粘合剂和赋形剂等等。
本发明的药用性合成物可以包含有一种为口服应用所需的载体，例如，乳糖、淀粉、纤维素的衍生物、硬脂酸镁、和硬脂酸等等。为了口服应用，其活性成分可以与赋形剂相混合，并且制备形成不同的样式，例如小片剂、横向片剂、锭形片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆和糯米纸囊剂等等。
此外，本发明中的药用性合成物可以包含有一种因为非肠道应用所需的载体，例如，水、适当的油剂、盐水、葡萄糖溶液和乙二醇溶液等等。为了非肠道应用所需的另外的载体，可以包括有一种稳定剂和一种防腐剂。合适的稳定剂包括有一种抗氧化剂，诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或者是抗坏血酸。适当的防腐剂包括有氯下烷铵、甲基-或者丙烷基-对羟基苯甲酸酯、以及丙酮氯仿。以下所提供的是有关一种另外附加的药用性载体的资料，它来自Remington PharmaceuticalScience，19thed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995。
更为适宜地是，本发明的药用性合成物可以按配方制成非肠道应用的合成物，例如，一种注射剂型。这种注射剂型可以依照已知的技术、使用合适的分散剂、湿润剂和乳化剂加以制备。例如，其中的每一种成分均可溶解于盐水或者缓冲液中，并且可以按照配方制成注射用剂型。
更为特别地是，在本发明的药用性合成物中所包含的紫杉醇，如同美国专利第5,478,860号中所描述的，可以被制成一种油状的微滴乳状液，这种乳状液的液体中包含有橄榄油或者向日葵油，而且PEG-连接液与紫杉醇相混合。另外，如同国际专利第9318757号中所描述的，紫杉醇可以包裹入脂质体中。进一步而言，如同美国专利第5,424,073号中所描述的，紫杉醇还可以依照配方加入增溶剂，例如无水乙醇和聚乙氧基蓖麻油，或者制备成适合于口服应用或者注射应用的剂型。
在本发明中的药用性合成物中所包含的P43蛋白，可以按照配方制成普通的蛋白剂型。例如，在P43蛋白被冷冻干燥以后，可以溶解入缓冲液中，从而获得了依照液体形式的剂型。另外，这种液体形式的剂型又进一步包含有上面所描述的稳定剂而加以制备。然而，只要保留本发明的治疗效果，药物配方的形式、应用的方式以及使用的方法，都应不受限制。
应用本发明的药用性合成物，可以观察到对肿瘤生长的抑制效应，即以每天25～50毫克/千克体重的剂量、每天一次应用P43蛋白，并且在用药的第一天即开始应用紫杉醇，以及此后的2天、5天、8天和11天，以5毫克/千克体重的剂量应用紫杉醇，这是经过仔细考虑的能够抑制癌细胞生长的一个最小剂量。因此，P43蛋白的应用可以是每天一次，或者是每天数次，所应用剂量可以从大约10毫克/千克体重至大约50毫克/千克体重；紫杉醇的应用在第一天时可以是每天应用一次，或者是每天应用数次，在第一天应用以后，每隔两到三天，可以应用一次或者数次，所应用剂量大约为1毫克/千克体重。更为适宜地是，上述的P43蛋白的应用是每天一次，所应用剂量可以从大约25毫克/千克体重至大约50毫克/千克体重，而紫杉醇的应用在第一天时应用一次，在第一天应用以后，每隔两到三天后，以一天应用一次的方式，所应用的剂量为5毫克/千克体重。
但是，药物应用的最终剂量和服药的次数可以在一定的允许范围内进行调整，这是鉴于药物剂型的特征、药物应用的方法和方式、患者的基本情况、患者的年龄、患者的体重、患者的性别、并发症的属性以及疾病的严重程度等等临床因素所决定的。
与此同时，当应用两种药物成分联合治疗癌症时，每一种药物成分实际应用的剂量，可以仅仅是它们在各自应用时的70％-80％，这是因为它们之间所存在的协同效应。因此，通过应用由存活有机体获得的带有P43蛋白的紫杉醇，在考虑到它常常所产生的副作用后，应用的应是紫杉醇的最小有效剂量，然而，它们的抗癌治疗效果却是协同增强的。
正如此前所描述的那样，本发明的药用性合成物在对付异常细胞，诸如癌细胞的生长上是非常有效的。癌的例子包括实体性癌，例如肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、骨癌、脾癌、皮肤癌、胰头(cephalic)癌、子宫颈癌、皮肤或者眼内的恶性黑色素瘤、子宫肉瘤、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、结肠癌、乳腺癌、输卵管肿瘤、子宫内膜肿瘤、子宫颈肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、疏松结缔组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或者急性的白血病、淋巴细胞性的淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞肾肿瘤、肾性骨肉瘤、中枢神经系统肿瘤、原发性的中枢神经系统淋巴瘤、骨髓肿瘤、脑干神经胶质细胞瘤、和脑垂体腺瘤，以及这些肿瘤中所并发的多于一种的癌症。
为了证实本发明的药用性合成物的抗癌活性，研究中运用了异种移植肿瘤模型。如同一项在体实验中所显示的，异种移植肿瘤模型通常应用于新型的抗癌药物的研制。而通常是采用裸鼠来进行实验的。在本发明中，一种不带有特殊病原体的裸鼠体内，分别种植了人肺癌细胞系或者是人胃癌细胞系。在或者是分别应用，或者是联合应用了P43蛋白和紫杉醇以后，测定了治疗组裸鼠的存活率、体重以及肿瘤的大小，并且确定每一只鼠的抗癌活性。结果发现对于种植了人肺癌细胞系的裸鼠，通过联合应用P43和紫杉醇的裸鼠，与单一应用药物的动物相比较，其肿瘤的生长明显受到很大程度地抑制。此外，对于种植了人胃癌细胞系的裸鼠，通过联合应用P43和紫杉醇的裸鼠，与单一应用药物的动物相比较，其肿瘤的生长明显受到很大地抑制，并且通过采用联合应用治疗，这些裸鼠的存活率出现了显著意义上的增加。尤其是对于那些种植了人胃癌细胞系的实验动物来说，通过联合应用P43和紫杉醇，与单一应用药物的动物相比较，裸鼠的存活率出现四倍以上的增加。
本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括给需要这种治疗的患者，应用包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物。
应特别指出地是，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法是指给一个患者应用包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物，其中的药用成分按一定的配方制成单一或分别的药用性合成物。
更加应特别指出地是，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括应用包含有P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物的方法，它可以同时、分别，或者持续对一个患者应用。
更加应特别指出地还有，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括在药物治疗的第一天开始，每天应用P43蛋白，并且在第一天首次应用紫杉醇，并自第一天起，每隔两到三天保持加以应用。
此外，本发明提供了一种治疗癌症的方法还包括，P43蛋白的应用可以是每天一次，或者是每天数次，所应用剂量可以从大约10毫克/千克体重至大约50毫克/千克体重；并且紫杉醇的应用在第一天时可以是每天应用一次，或者是应用数次，所应用剂量大约为1毫克/干克体重至10毫克/千克体重，在第一天应用以后，每隔两到三天，可以应用一次或者数次。更为理想地是，上述的P43蛋白的应用是每天一次，所应用剂量可以从大约25毫克/千克体重至大约50毫克/千克体重，而紫杉醇的应用在第一天时首次应用一次，在第一天应用以后，每隔两到三天后，以一天应用一次的方式，所应用的剂量为5毫克/千克体重。
另外，本发明提供了一种治疗癌症的方法包括，患者可以通过口服或者是非肠道应用这种药用性合成物。口服和非肠道应用的实例与上面所描述的相同。
本发明提供了一种治疗癌症的方法还包括，应用包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用合成物应用于一个患者，以及作为一种附加的成分，应用药用性的适宜的载体。这种药用性的适宜的载体与上面所描述的相同。
上述“患者”是指，一种被诊断为有着异常细胞生长，例如癌细胞生长的人。而癌的种类与上面所描述的那些相同。在本发明中需要特别指出的是，术语“患者”是指诊断患有肺癌和胃癌的人。
在本发明中还提供了一种为制备用于治疗癌症的药用性合成物中的P43蛋白和紫杉醇的用途，其中这两种成分是联合加以应用的。
较为特殊的是，在本发明中还提供了一种为制备用于治疗癌症的药用性合成物中的P43蛋白和紫杉醇的应用方法，其中上述的这两种成分按照一定的配方制成单一的一种合成物或者是一种各自的合成物。
更为特殊的是，在本发明中还提供了一种为制备用于治疗癌症的药用性合成物中的P43蛋白和紫杉醇的应用方法，其中这两种成分可以是同时、分别、或顺序应用的。
更为特殊的还有，在本发明中还提供了一种为制备用于治疗癌症的药用性合成物中的P43蛋白和紫杉醇的应用方法，其中P43蛋白在开始用药的第一天开始每天一次加以应用，而紫杉醇的应用则是在用药的第一天首次应用，此后保持每隔两到三天加以应用。
此外，在本发明中还提供了一种为制备用于治疗癌症的药用性合成物中的P43蛋白和紫杉醇的应用方法，其中的P43蛋白的应用可以是每天一次，或者是每天数次，所应用剂量可以从大约10毫克/千克体重至大约50毫克/千克体重；并且紫杉醇的应用在第一天时可以是每天应用一次，或者是应用数次，所应用剂量大约为1毫克/千克体重至10毫克/千克体重，在第一天应用以后，每隔两到三天，可以应用一次或者数次。更为理想地是，上述的P43蛋白的应用是每天一次，所应用剂量可以从大约25毫克/千克体重至大约50毫克/千克体重，而紫杉醇的应用在第一天时首次应用一次，在第一天应用以后，每隔两到三天后，以一天应用一次的方式，所应用的剂量为5毫克/千克体重。
另外，在本发明中还提供了一种为制备用于治疗癌症的药用性合成物中的P43蛋白和紫杉醇的应用方法，其中的药用性合成物可以通过口服应用或者是非肠道应用。口服和非肠道应用的实例与上面所描述的相同。
另外，在本发明中还提供了一种为制备用于治疗癌症的药用性合成物中的P43蛋白和紫杉醇的应用方法，其中的药用性合成物包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇，并且进一步包含有药用性的适宜的载体。
癌症的种类与上面所描述的那些癌症是相同的。在本发明中，需特别指出的是，癌症可以是一种肺癌或者是一种胃癌。
以下的例证是本发明的最好体现，然而，我们决没有限制本发明应用范围的意图。
例证1在肺癌异种种植瘤小鼠模型中，通过单一应用或者联合应用P43蛋白和紫杉醇，观察其抗癌活性1-1)实验动物的检疫、环境适应以及饲养在本发明中，实验动物选用的是源于BALB/C小鼠并且不带有特殊病原体的裸鼠(5周龄，Daehan Biolink公司提供)。在获得了上述这些动物之后，肉眼检查它们的外部特征。这些动物被放置在动物室7天，并在动物室进行了一系列的实验。在检查了动物的一般情况后，只有健康的动物才被挑选出来用于进行实验研究。上述的动物放置在动物饲养室，饲养室内的环境维持在23±3℃的温度、50±15％的相对湿度、12个小时的光照时间(从上午8时至下午8时)、通风次数为每小时10～20次、以及光照强度为150～300勒克斯。在环境适应期间和检疫期，10只动物分别放置在各自的饲养盒中(宽260毫米×长420毫米×高180毫米)。在应用实验合成物以及其后的观察期间，四只或者是更少的动物放置于饲养盒中(宽200毫米×长260毫米×高130毫米)。给动物喂食固体饲料，该饲料经射线加以消毒(DaehanBiolink)，实验动物均为自由进食。
1-2)给实验动物种植癌细胞依照上述的1-1)步骤处理过的每一只裸鼠种植人肺癌细胞系NCI-H460，该NCI-H460细胞系韩国生物科学和生物学研究所的癌细胞系库中获得，在本发明中是作为人肺癌细胞系加以应用的。
如同上面描述的所获得的癌细胞系在二氧化碳培养箱(Forma，美国制造)中进行孵育，其中的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％。
RPMI-1640加入到胎牛血清(FBS，GibcoBRL公司，16000-044)中所形成的终浓度为10％，并且添加入10％的青霉素-链霉素溶液(GibcoBRL公司，15140-122)，制成所应用的培养基。为了有利于上述癌细胞种植于小鼠体内，从培养基中分离出来的癌细胞贮存于较冷的温度下。在癌细胞培养的最后一天，收集所有的细胞并且进行计数。然后，应用磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞的浓度调整到每毫升3×107个。经过调整的细胞培养溶液行皮下注射给50只挑选出的健康小鼠，以每只小鼠3毫升的剂量注射到右侧肩部和胸壁之间的腋窝区域。
1-3)单一应用或者联合应用P43蛋白和紫杉醇通过测量种植了肺癌细胞的裸鼠的癌症大小和体重，组成实验组动物，其中的肺癌细胞如同上面的1-2)步骤中所描述的细胞系。首先，对种植癌细胞的裸鼠中所发现的肿瘤大小进行测量并分成不同的等级。应用游标卡尺对癌细胞所致的肿瘤大小进行准确的宽度、长度和厚度测量。同时测量动物的体重。按上述测量的数据所估算的肿瘤大小，将实验动物排序。在这些实验动物中，挑选出与肿瘤大小的平均值相近似的四十只动物，并应用计算机将其分配入一个独立的组群，以致于肿瘤的大小在每一组中均能够均匀地分布。
如同上面所描述的每一组动物，或者是分别应用P43蛋白治疗，或者是与紫杉醇联合应用进行治疗。应特别指出的是，以25毫克/千克体重的剂量分别应用P43蛋白治疗组(低剂量p43蛋白治疗组)、以50毫克/千克体重的剂量分别应用P43蛋自治疗组(高剂量p43蛋白治疗组)、以25毫克/千克体重的剂量应用P43蛋白并联合5毫克/千克体重剂量的紫杉醇(GENEXOL，Samyang Genex公司)治疗组(低剂量p43蛋白与紫杉醇联合治疗组)、或者是以50毫克/千克体重的剂量应用P43蛋白并联合5毫克/千克体重剂量的紫杉醇治疗组(高剂量p43蛋白与紫杉醇联合治疗组)。在阴性对照组中，应用了包含有20％丙三醇(Sigma公司)的磷酸盐缓冲液(PBS)。药物应用的方法包括利用腹部皮肤固定的方法固定小鼠，并且采用腹膜腔内注射的方式，给小鼠应用实验合成物。至于药物应用的次数和周期，P43蛋白是每天应用一次，一共应用28天；紫杉醇则一共应用5次，也就是在可是用药的第一天、以及此后的2天、5天、8天和11天加以应用。实验动物的分组和药物应用剂量总结于下面的表中。
表1动物实验分组以及药物应用的剂量

V.C.1×包含有20％丙三醇的PBS溶液(磷酸盐缓冲液)1-4)通过单一应用或联合应用P43蛋白和紫杉醇治疗后，观察实验动物的一般症状和死亡率在应用P43蛋白和紫杉醇治疗之前和之后，每天观察实验动物的一般症状和死亡率。观察工作在应用药物终止后7天完成。
实验结果显示对与应用P43蛋白和紫杉醇治疗有关的实验动物的一般症状的观察，结果是没有明显的改变。然而，在这些动物死亡之前，因为实验动物的健康问题，可出现肿瘤的坏死和动物的体温下降。此外，如同图1所示，与应用P43蛋白和紫杉醇相关的死亡率没有在显著性意义上的明显改变。
1-5)通过单一应用或联合应用P43蛋白和紫杉醇治疗后，对实验动物的体重、肿瘤大小和肿瘤重量变化的测量在治疗开始的当天对上述的步骤1-3)的所有动物进行体重的测量，治疗期间每周测量2次，治疗后观察期间每周测量一次。在治疗开始的当天测量肿瘤大小，然后治疗期间每隔一天测量一次。应用游标卡尺测量肿瘤的宽度、长度和厚度，应用下面描述的公式计算肿瘤的体积。另外，通过在治疗前用肿瘤大小区分每隔一天测量的肿瘤大小来计算相对的肿瘤大小中的变化，以百分数表示。肿瘤的重量是在实验结束以后，在小鼠的尸体解剖时测量的。在计算得出每一组中动物的体重、肿瘤的大小以及肿瘤重量的平均值和标准差以后，采用学生-t检验来确定它们之间的统计学意义。
{宽度(毫米)×长度(毫米)×厚度(毫米)}/2＝肿瘤大小(毫米3)正如图2所显示的，除了阴性对照组的动物以外，一直到用药的第三天，这些实验动物的体重是以一种剂量依赖性方式下降的。与阴性对照组的动物相比较，实验组的动物体重下降率如下应用低剂量P43蛋白的治疗组，动物体重的下降率为87％；应用高剂量P43蛋白的治疗组，动物体重的下降率为84％；应用低剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组，动物体重的下降率为84％；以及应用高剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组，动物体重的下降率为81％。在开始用药的3天以后，则观察到了正常的动物体重增加。尽管如此，实验组的所有动物的体重仍然低于阴性对照组的动物体重。
同时，图3和图4显示的是肿瘤大小的改变。在用药结束时，也就是在第28天，阴性对照组和各个实验组动物的肿瘤生长率如下阴性对照组的肿瘤生长率为5192％；应用低剂量P43蛋白的治疗组，肿瘤的生长率为4231％；应用高剂量P43蛋白的治疗组，肿瘤的生长率为4947％；应用低剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组，肿瘤的生长率为3629％；以及应用高剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组，肿瘤的生长率为3301％。这样的实验结果显示与阴性对照组动物的肿瘤生长率相比较，应用低剂量P43蛋白的治疗组、应用高剂量P43蛋白的治疗组、应用低剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组、以及应用高剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组动物的肿瘤生长受到抑制，分别为19％、5％、30％、36％。应用下面的方程式，进一步计算出与阴性对照组相比较的各个实验组动物的肿瘤生长抑制率。
(阴性对照组的相对肿瘤生长率-实验组的相对肿瘤生长率)×100/阴性对照组的相对肿瘤生长率因此，实验发现，与单一应用P43蛋白治疗相比较，应用紫杉醇和P43蛋白的联合治疗可以更有效抑制肿瘤的生长。而且，从用药的第8天到用药结束时，单一应用P43蛋白治疗的实验组动物肿瘤大小，看上去小于对照组动物的肿瘤大小。另一方面，对于应用P43蛋白和紫杉醇联合治疗的实验组动物，从开始用药的第4天或者第6天，肿瘤的大小便开始下降，与对照组动物的肿瘤大小相比较，具有显著地统计学意义。因此，在一段相对较短的时期内，应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗，可以明显抑制肿瘤的生长是显而易见的。即使是单纯应用P43蛋白治疗的实验组动物，与对照组相比较，在整个实验期间，肿瘤的大小看上去也是减小的。
表2和图5代表的是动物肿瘤重量改变的实验结果。这些实验结果显示与对照组相比较，按一种剂量依赖方式，两个实验组动物的肿瘤重量均是下降的，也就是，单纯应用P43蛋白治疗组(G1应用低剂量P43蛋白的治疗组；G2应用高剂量P43蛋白的治疗组)和应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组(G3应用低剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组；G4应用高剂量P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组)。对于应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组动物而言，肿瘤的重量有着更加明显的降低。
表2单一应用P43蛋白组或者联合应用P43蛋白和紫杉醇组的种植瘤的重量变化

-动物死亡V.C.1×包含有20％丙三醇的PBS溶液(磷酸盐缓冲液)与单纯应用P43蛋白的治疗组动物相比较，应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组动物具有较小的体重增长率，这种基于实际的实验结果的原因，是由于在应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组动物的肿瘤重量有着较大的减少，使得总的体重增长率与应用单一药物治疗组相比较，变得较小了。
结论，与单纯应用P43蛋白的治疗组动物相比较，应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组动物的肿瘤生长可能更加明显和更快地受到抑制。
例证2在胃癌异种种植瘤小鼠模型中，通过单一应用或者联合应用P43蛋白和紫杉醇，观察其抗癌活性2-1)实验动物的检疫、环境适应以及饲养依照上面例证1中所描述的方法，对实验中所需要的裸鼠进行检疫和饲养。将胃癌细胞给55只上述的动物进行了种植。而这些胃癌细胞，是从韩国生物科学和生物学研究所的癌细胞系库中获得的人胃癌细胞系NUGC-3，并加以应用。
2-2)单一应用或者联合应用P43蛋白和紫杉醇用上面的2-1)步骤中所描述的人胃癌细胞接种裸鼠，通过测量种植瘤的大小和裸鼠的体重，组成实验组。因为接种人胃癌细胞的实验组裸鼠之间的肿瘤生长变化很大，所以每隔一天就对实验组进行我们所说的测量。总共挑选出肿瘤大小为50～100mm3的裸鼠24只，并应用计算机将其分配入一个独立的组群，以致于肿瘤的大小在每一组中均能够均匀地分布。2天后，从余下的裸鼠中挑选出相似肿瘤大小的24只为另外一组，并应用计算机分配到实验组中。对上面所描述的每一组动物，应用例证1中所描述的同样的方法，进行p43蛋白的单独服用或与紫杉醇联合应用。实验动物的分组和应用的药物剂量见下面的表3。应用紫杉醇5ml/千克体重的动物组为阳性对照组。
表3实验动物分组及其药物的应用剂量

V.C.1×包含有20％丙三醇的PBS溶液(磷酸盐缓冲液)2-3)通过应用P43蛋白和紫杉醇治疗后，观察实验动物的一般症状和死亡率依照上面例证1中所描述的方法，给裸鼠种植人胃癌细胞，单独应用P43蛋白或者是与紫杉醇联合应用加以治疗。然后，观察实验动物的一般症状和死亡率。
实验结果显示对种植了胃癌细胞的裸鼠，在应用了P43蛋白和紫杉醇治疗以后，实验动物的一般症状没有明显的改变。仅仅是在这些动物死亡之前，出现肿瘤细胞的零星的坏死和动物的体温的下降。
如图6中显示的是通过应用P43蛋白和紫杉醇，实验动物的存活率改变。应特别指出的是，每一个实验组中动物的存活率如下阴性对照组在实验的最后一天(第28天)应用了赋形剂，其动物的存活率为25％；应用低剂量的P43治疗组动物的存活率为63％；应用高剂量的P43治疗组动物的存活率为25％；应用低剂量的P43与紫杉醇联合治疗组和应用高剂量的P43蛋白与紫杉醇联合治疗组，这两组动物的存活率均为100％；以及仅仅应用紫杉醇治疗的阳性对照组动物的存活率为63％。在动物尸体解剖时，对于P43蛋白和紫杉醇联合治疗组的动物，观察了存活率大于50％的动物状况。对于其它的实验组，大多数的动物均已死亡。另外，对于阴性对照组和仅仅应用了P43蛋白的治疗组，实验动物在开始用药治疗的第5天便开始出现了死亡。即使是在仅仅应用紫杉醇的治疗组或者是在应用P43蛋白和紫杉醇联合的治疗组，从开始用药的第19天，或者是从第28天的用药治疗终止以后，均观察到了实验动物的死亡情况。因此，与单纯应用紫杉醇治疗或者是应用P43蛋白和紫杉醇联合治疗的动物相比较，在阴性对照组和单纯应用P43蛋白的治疗组动物观察到了特别早期的死亡。
2-4)通过单一应用和联合应用P43蛋白和紫杉醇治疗后，对实验动物的体重、肿瘤大小和肿瘤重量变化的测量依照例证1中所描述的同样的方法，对单纯应用和联合应用P43蛋白和紫杉醇加以治疗的实验动物，测量了动物体重、肿瘤大小和肿瘤重量的改变。
结果，图7中显示了实验动物的体重改变。对于包括阴性对照组在内的所有的实验动物，从单纯应用和联合应用P43蛋白和紫杉醇加以治疗的两天以后，实验动物的体重出现了临时的下降。与种植了人肺癌细胞系的裸鼠相比较，这些观察到的实验结果是相同的。然而，对于联合应用P43蛋白和紫杉醇的治疗组和单纯应用紫杉醇的阳性对照组动物而言，从开始用药的第5天起，这些实验动物的体重即开始缓慢地回升，并且在用药的第10天左右，最终完全恢复到最初的体重水平。与此同时，对于阴性对照组的动物，则没有观察到那种的体重增加，并且这些实验动物的体重出现了持续地下降。对于单纯应用P43治疗的实验组动物，也没有观察到这些实验动物体重的明显改变，并且这些实验动物保持了暂时性地较轻体重。
图8和图9显示的是肿瘤大小的改变。直到开始实验的第14天，阴性对照组的实验动物，有少于一半的已经死亡，而与阴性对照组相比较，单纯应用P43蛋白的治疗组动物的肿瘤生长，也没有出现特殊的抑制现象。然而，对于应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组(也就是应用低剂量的P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组和应用高剂量的P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组)动物而言，与对照组相比较，在用药的第14天，肿瘤的生长抑制分别为85％和94％，具有显著的意义。因此，这样的实验结果显示，从实验的开始之时，肿瘤就几乎保持着相同的大小。同样显而易见地是，应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组动物，肿瘤完全停止了生长，或者甚至开始出现了消失。此外，对于单纯应用紫杉醇的实验组，在用药的第14天，肿瘤的生长抑制为58％，具有显著的意义。与此同时，对于胃癌细胞的种植实验而言，在实验的后半程(即在开始用药的第14天以后)，实验组与对照组之间的精确比较已是不可能的了，这是因为在对照组动物中出现了高的死亡率。
结论，与单纯应用P43蛋白或者是紫杉醇的治疗相比较，通过P43蛋白和紫杉醇的联合应用治疗，能够取得更加有效的抑制肿瘤的生长。
对于胃癌的种植瘤实验而言，在对照组与实验组的肿瘤重量之间不能进行比较，这是由于在对照组和单纯应用P43蛋白的治疗组动物中出现了高的死亡率。
由于这种高的死亡率，种植了人胃癌细胞系的对照组的实验动物，在实验的开始阶段，就出现了连续的体重下降和肿瘤生长的高发，并认为癌细胞的种植是造成动物死亡的原因。而且，对于应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗组动物而言，在实验的早期就出现了高的存活率和肿瘤的抑制现象，并认为这些都是由于上述药物的抗癌活性的作用结果。就针对胃癌的抗癌活性来说，应用P43蛋白和紫杉醇的联合治疗，比单纯应用P43蛋白或者是单纯应用紫杉醇的治疗更加有效。
工业上的适用性含有P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物以及使用本发明中的合成物的治疗方法的优点是，与单纯的应用相比较，通过联合应用这两种成分，肿瘤的生长可以出现更加明显的抑制，并且可以出现协同增效的治疗效果。另外，含有P43蛋白和紫杉醇的药用性合成物以及使用本发明中的合成物的治疗方法，使得应用紫杉醇所造成的相关副作用降到了最低的程度，因此，这也就可以减少了抗癌药物的不良作用。
权利要求
1.应用于治疗癌症的药用性合成物，包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的药用性合成物，其特征是所述的P43蛋白和紫杉醇是以单一或各自的形式制备的。
3.根据权利要求1所述的药用性合成物，其特征是所述的P43蛋白和紫杉醇是同时、分别或顺序加以应用的。
4.根据权利要求2所述的药用性合成物，其特征是，对于分别的合成物，P43蛋白的应用是从第一天开始每天加以应用的，紫杉醇的应用则是在用药的第一天首次应用，然后在开始用药之后，每隔二到三天持续加以应用。
5.根据权利要求4所述的药用性合成物，其特征是该合成物是P43蛋白以10毫克/千克到50毫克/千克的剂量，在一天中应用一次或者是数次。
6.根据权利要求5所述的药用性合成物，其特征是，P43蛋白以25毫克/千克到50毫克/千克的剂量，在一天中应用一次。
7.根据权利要求2所述的药用性合成物，其特征是，对于各别的合成物，紫杉醇的应用是在用药的第一天中应用一次或数次、首次应用的剂量为1毫克/千克到10毫克/千克，然后在开始用药之后，每隔二到三天持续加以应用一次或数次。
8.根据权利要求7所述的药用性合成物，其特征是，对于分别的合成物，紫杉醇的应用是在用药的第一天中应用一次、首次应用的剂量为5毫克/千克到10毫克/千克，然后在开始用药之后，每隔二到三天连续加以应用一次。
9.根据权利要求1所述的药用性合成物，其特征是，该合成物的应用是口服或者是非肠道应用。
10.根据权利要求1所述的药用性合成物，其特征是，该合成物进一步包含药用性的适宜载体。
11.根据权利要求1所述的药用性合成物，其中的癌症是实体性肿瘤。
12.根据权利要求11所述的药用性合成物，其特征是，该合成物所治疗的实体性肿瘤是从一组包括肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、骨癌、脾癌、皮肤癌、胰头(cephalic)癌、子宫颈癌、皮肤或者眼内的恶性黑色素瘤、子宫肉瘤、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、结肠癌、乳腺癌、输卵管肿瘤、子宫内膜肿瘤、子宫颈肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、疏松结缔组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或者急性的白血病、淋巴细胞性的淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞肾肿瘤、肾性骨肉瘤、中枢神经系统肿瘤、原发性的中枢神经系统淋巴瘤、骨髓肿瘤、脑干神经胶质细胞瘤、和脑垂体腺瘤，以及这些肿瘤并发的组中选择出的一种癌症。
13.根据权利要求12所述药用性合成物，其特性是，癌症为肺癌或者是胃癌。
14.治疗癌症的方法，包括应用包含有有效剂量的P43蛋白和紫杉醇的药用合成物，对需要治疗的患者进行治疗。
15.根据权利要求14所述的治疗癌症的方法，其特性是，所述的是P43蛋白和紫杉醇是以单一或分别合成物的形式制备的。
16.根据权利要求14所述的治疗癌症的方法，其特性是，所述的是P43蛋白和紫杉醇是同时、分别或顺序应用的。
17.根据权利要求15所述的治疗癌症的方法，其特性是，对于分别的合成物，P43蛋白的应用是从第一天开始每天应用的，紫杉醇是在用药的第一天首次应用，然后在开始用药之后，每隔二到三天连续应用。
18.采用P43蛋白和紫杉醇，用于制备药用合成物，是联合应用治疗癌症的。
19.根据权利要求18所述的采用P43蛋白和紫杉醇用于制备药用性合成物，其特征是，P43蛋白和紫杉醇以单一或分别合成物的形式制备的。
20.根据权利要求18所述的采用P43蛋白和紫杉醇用于制备药用性合成物，其特性是，P43蛋白和紫杉醇是同时、分别或顺序加以应用的。
21.根据权利要求19所述的采用P43蛋白和紫杉醇用于制备药用性合成物，其特性是，对于分别的合成物，P43蛋白的应用是从第一天开始每天加以应用的，紫杉醇的应用是在用药的第一天首次应用，然后在开始用药之后，每隔二到三天连续应用。
全文摘要
本发明涉及一种含有P43蛋白和紫杉醇的用于治疗癌症的药用性合成物，以及使用该合成物的治疗方法和用途。特别是，本发明涉及药用性合成物，其特征是P43蛋白联合紫杉醇的同时、分别或顺序应用，以及采用该合成物的治疗方法和用途。依据本发明的药用性合成物及其治疗方法，其中的P43蛋白联合紫杉醇的应用，在一段较短的时期内，通过明显地抑制癌细胞的生长，增强了治疗癌症的有效性。此外，在本发明中通过最低限度地应用紫杉醇的剂量，降低了药物的毒性。
文档编号A61K38/16GK1496269SQ03800008
公开日2004年5月12日 申请日期2003年1月15日 优先权日2003年1月15日
发明者金圣勋, 姜太熙, 崔树永 申请人:艾玛基因有限公司