专利名称：一种含有重组人血白蛋白的紫杉醇纳米颗粒冷冻干燥制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及制药领域，更具体地讲，涉及一种白蛋白结合型抗肿瘤药物的纳米颗 粒制剂及其制备方法。
背景技术：
人血白蛋白是通过低乙醇法或层析法从人体血液中提取的血浆蛋白制剂，但是血 源产品的生产受到血源供应的限制，不可避免地会有周期性缺货发生，同时由于血液的来 源不能完全得到控制，无法完全避免致病微生物的潜在威胁。日本首家研制成功了重组人 血白蛋白并作为药用辅料用于疫苗产品的生产，国内如华北制药、浙江海正药业采用基因 重组人血白蛋白项目采用现代生物技术，运用发酵生产重组人血清白蛋白的方案，大规模 生产白蛋白产品，替代疫苗生产过程中作为培养基的血源白蛋白，降低血源产品的安全风 险。利用现代大规模生物发酵技术生产的重组人血白蛋白，同人血白蛋白相比具有纯 度高、防污染、可量产等优点，专家分析认为药用辅料级及未来的药用级重组人血白蛋白市 场潜质巨大。紫杉醇是一种天然的抗癌原料药，为白色结晶粉末、难溶于水及许多药用溶媒，水 中溶解度仅为0. 006mg/ml，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，紫杉醇是一个复杂的二萜类化合 物，具有含氧四环的紫杉烷环及酯侧链，分子式为C47H51N014，分子量853. 90，在PH4 8 范围内紫杉醇比较稳定，碱性条件下很快分解，酸性条件下比较稳定。目前上市的紫杉醇静脉注射液最早由NCI于1978年研制，该药物由施贵宝药厂生 产，现已进入我国市场。处方以CremophorEL50% (ν/ν增溶剂)，50% (ν/ν)无水乙醇为 溶媒，紫杉醇浓度达6mg/ml，用5%右旋糖酐稀释或生理盐水稀释至0. 3 1. 2mg/m，紫杉 醇理化性质可稳定12h以上。现FDA批准的给药方案是每21d静脉滴注一次，每次将总给 药剂量的1/3用500ml5%右旋糖酐稀释后他内滴完，连续滴注Mh，最低给药剂量135mg/ m2。该处方给药后数分钟，过敏反应发生率为39%，其中严重过敏反应发生率为2%，多数为 I型变态反应，表现为支气管痉挛性呼吸困难、荨麻疹和低血压，部分病人出现药物性皮疹、 呼吸急促、支气管痉挛、低血压等过敏反应。研究认为，这主要是处方中CremophorEL引起 体内组胺释放造成。其在紫杉醇注射液中使用剂量明显高于所有已上市制剂，目前多采取 在给药前数小时服用苯海拉明、地塞米松、氨茶碱等抗组胺剂防止过敏反应的发生。研究还 发现，注射液中CremophorEL与聚氯乙烯塑料管和输液袋接触可浸提出大量的塑化剂邻苯 二甲酸二乙基乙酯，因此专家建议临床使用玻璃、聚乙烯容器及内衬聚乙烯的硝化甘油管 为输液器具。由于细胞膜上有白蛋白受体GP60，在Gp60与白蛋白结合后，激活胞膜穴样内凹， 进行细胞转运，由肿瘤细胞分泌的富含半光氨酸酸性分泌性蛋白，存在于多种恶性肿瘤组 织间质中，和病人的预后有直接关系，它和GP60同源，能和白蛋白结合，利用其与白蛋白结 合的特性，使表面镶嵌有白蛋白的脂质囊胞相对富集在肿瘤间质中，通过膜融合和转运释内，使肿瘤细胞内的药物局部浓度增高，从而增加肿瘤细胞的疗效。白蛋 白结合型抗肿瘤药物的制剂研究一直是纳米颗粒的研究热点，由于技术上的难度，目前为 止也没有重组人血白蛋白紫杉醇制剂上市。中国专利(申请号200810147343. 5)中公开了一种利用磷脂双分子层内嵌入胆 固醇所形成的囊泡包裹药物分子而形成的制剂，我们进一步研究发现，该制剂由于胆固醇 的加入，形成的脂质囊胞制备的纳米颗粒粒径比较大，最关键的是冻干后复溶无法实现纳 米颗粒的平均粒径小于200nm，在临床上无法实现静脉滴注，从而大大缩小其产业化价值。本发明在运用重组人血白蛋白替代人血白蛋白的同时，在制剂中去掉了留醇，制 备了冻干复溶后平均粒径小于200nm的纳米颗粒，使得本发明更具有产业化价值，具有非 常重要的现实价值。由于重组人血白蛋白和人血白蛋白在蛋白质组分和纯度上的差异，用重组人血白 蛋白替代人血白蛋白在制备抗肿瘤药物纳米颗粒的过程中，需要进一步调整处方及工艺路 线，经过多年研究，本发明公开了重组人血白蛋白和紫杉醇结合的最佳处方及制备工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有重组人血白蛋白的紫杉醇纳米颗粒冷冻干燥粉 末制剂。本发明的第二个目的是提供有重组人血白蛋白的紫杉醇纳米颗粒冷冻干燥粉末 制剂的制备方法。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案作为第一个方案一种含有重组人血白蛋白的紫杉醇纳米颗粒冷冻干燥粉末制 剂，所述制剂由紫杉醇、磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂、PH调节剂和少量水分组成，各 组分质量百分比如下紫杉醇0. 05-5%、磷脂0. 1_50%、重组人血白蛋白1-60%、冻干支持 剂1-60 %、PH调节剂0. 05-10 %，所述少量水分为小于5 %。作为第二个优选方案，各组分质量百分比如下紫杉醇0. 15-3%、磷脂1-30%、重 组人血白蛋白2-60 %、冻干支持剂2-60 %、PH调节剂0. 05-10 %，所述少量水分为小于5 %。作为第三个优选方案，一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂， 所述制剂由紫杉醇、磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂、PH调节剂、抗氧化剂和少量水分组 成，各组分质量百分比如下紫杉醇0. 05-5%、磷脂0. 1_50%、重组人血白蛋白1-60%、冻 干支持剂1_60%、PH调节剂0. 05-10%、抗氧化剂0. 01-5%，所述少量水分为小于5%。作为第四个优选方案，各组分质量百分比如下紫杉醇0. 15-3%、磷脂1-30%、重 组人血白蛋白2-60%、冻干支持剂2-60%、PH调节剂0. 05-10%、抗氧化剂0. 01_5%，所述 少量水分为小于5%。所述磷脂选自天然磷脂和合成磷脂中的一种或几种，其中天然磷脂包括从大豆中 提取得到的磷脂和从蛋黄中提取得到的磷脂，其中磷脂的纯度为50% -100%。磷脂举例如下，比如卵磷脂(大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二月桂酰磷脂、二肉豆蔻 酰磷脂、二棕榈酰磷脂或二硬脂酰磷脂等)、磷脂酰乙醇胺(二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉 豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等)磷脂酰丝氨酸 (二月桂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸或二硬脂酰磷脂酰丝氨酸等)、磷脂酸、磷脂酰甘油(二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕 榈酰磷脂酰甘油或二硬脂酰磷脂酰甘油等)、磷脂酰肌醇(二月桂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻 酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇或二硬脂酰磷脂酰肌醇等)、溶血卵磷脂、鞘磷脂、蛋黄 卵磷脂、大豆卵磷脂、羟基卵磷脂、氢化磷脂以及经过PEG修饰过的磷脂。本发明提到的大豆卵磷脂，其纯度可以是50% -100%,比如市售的各种规格 PC50、PC60、PC70、PC75、PC80、PC90、PC99、PC100，蛋黄卵磷脂的纯度可以是 50% -100%, 比如市售的各种规格PC50、PC60、PC70、PC75、PC80、PC90、PC99、PC100。所述冻干支持剂选自小分子氨基酸、多糖和多元醇中的一种或几种，所述小分子 氨基酸指20种天然氨基酸中的一种或几种，所述多糖指海藻糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖中的 一种或几种，所述多元醇指甘露醇和山梨醇中的一种或几种。20种天然氨基酸举例如下，比如20种α -氨基酸包括，八种非极性氨基酸丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸；七种极性、不带电荷氨 基酸丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸；两种酸性氨基酸 天门冬氨酸、谷氨酸；三种碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸、组氨酸。所述PH调节剂为生物相容性酸或缓冲盐，所述生物相容性酸指盐酸、磷酸或其金 属钠盐、柠檬酸或其金属钠盐、草酸或其金属纳盐、冰醋酸或其碱金属盐、氢氧化钠、氢氧化 钾和碳酸钠中的一种或几种，所述缓冲盐指磷酸缓冲盐和柠檬酸缓冲盐中的一种或几种的 混合物。缓冲盐举例如下，磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠缓冲液、磷酸-磷酸二氢钠的缓 冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠的缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲液，也可以是磷酸二 氢钾-磷酸氢二钾的缓冲液。所述抗氧化剂指维生素Ε、维生素C、亚硫酸盐类、乙二胺四乙酸及其衍生物和盐 酸半胱氨酸中的一种或几种。上述方案一中所述的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂的制备方法，包括以下步骤 将紫杉醇溶解于有机溶剂中，磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂和PH调节剂溶解于水 或有机溶剂中，用挤压过滤法或高压均化法制成纳米颗粒，所述高压均化法中高压为 600-1500bar，除菌过滤冷冻干燥得干燥粉末。上述方案三中所述的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤按照本发明公开的配比将紫杉醇溶解于有机溶剂中，磷脂、重组人血白蛋白、冻 干支持剂、PH调节剂和抗氧化剂溶解于无菌水或有机溶剂中，用挤压过滤法、微射流或高压 均化法(药剂书上公开的常规方法)在高压下反复勻质处理制成纳米颗粒，所述微射流或 高压均化法中压力为600-1500bar，除菌过滤冷冻干燥得干燥粉末。所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮中的一种或 几种。所述纳米颗粒平均粒径小于0. 4um,获得的粉末制剂和注射用水、葡萄糖和生理盐 水重制形成PH在5. 0-7. 0之间的可注射水溶液。作为一个优选方案，所述纳米颗粒平均粒径小于0. 2um,获得的粉末制剂和注射用 水、葡萄糖和生理盐水重制形成PH在5. 5-6. 5之间的可注射水溶液。本发明的优点在于本发明提供的含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末的制剂，主要由抗肿瘤药物紫杉醇、磷脂、冻干支持剂和PH调节剂组成，通过高压均质或微 射流技术将重组人血白蛋白与紫杉醇结合，用磷脂作为乳化剂，可以显著提高重组人血白 蛋白与紫杉醇结合的稳定性，且本发明获得的纳米颗粒平均粒径小于0. 4um，获得的粉末制 剂和注射用水、葡萄糖和生理盐水重制形成PH在5. 0-7. 0之间的可注射水溶液，大大提高 了该制剂的产业化价值。
图1为大鼠静脉注射给予市售紫杉醇注射液，辅料为聚氧乙基代蓖麻油、无水乙 醇、柠檬酸。紫杉醇(20.(X3mg/kg)后不同时间组织中的药物分布柱形图。图2为大鼠静脉注射给予本发明紫杉醇重组人血白蛋白纳米粒(紫杉醇含量 20. 05mg/kg)后不同时间组织中的药物分布柱形图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。实施例1 紫杉醇0. 3g、维生素E0. 05g加入5_15ml无水乙醇(或0. I-Iml氯仿)溶解、大豆 卵磷脂6. 5g、重组人血白蛋白5g、海藻糖10g，加入IOOml注射用水充分溶解，用磷酸二氢钠 缓冲盐调节PH值为5. 5，用高速分散机充分分散，高压均质机均质乳化至50%粒径范围为 IOOnm,除菌过滤，在无菌条件下迅速冷冻到-30度，冷冻干燥至水分小于5%即得紫杉醇重 组人血白蛋白结合物干燥粉末。实施例2 紫杉醇1. 2g、大豆卵磷脂IOg加入50ml无水乙醇(或2_10ml氯仿)溶解，重组人 血白蛋白20g、大豆卵磷脂15g、焦亚硫酸钠0. 05g、海藻糖60g，加入500ml注射用水充分溶 解，磷酸二氢钠与磷酸氢二钠的缓冲液调节PH值为5. 8，用高速分散机充分分散，高压均质 机均质乳化至50%粒径范围为80nm，除菌过滤，在无菌条件下迅速冷冻到_40度，冷冻干燥 至水分小于5 %即得紫杉醇重组人血白蛋白结合物干燥粉末。实施例3 紫杉醇0. 5g、加入5_15ml无水乙醇(或0. 5_2ml氯仿)溶解、大豆卵磷脂15g、重 组人血白蛋白20g、麦芽糖30g，加入150ml注射用水充分溶解，用柠檬酸缓冲盐或盐酸盐调 节PH值为6. 0，用高速分散机充分分散，高压均质机均质乳化至50%粒径范围为80nm，除菌 过滤，在无菌条件下迅速冷冻到-45度，冷冻干燥至水分小于5%即得紫杉醇重组人血白蛋 白结合物干燥粉末。实施例4 紫杉醇0. 2g、加入5-15ml无水乙醇(或0. I-Iml氯仿)溶解、大豆卵磷脂3. 5g、 重组人血白蛋白3g、焦亚硫酸钠0. 05g、麦芽糖3g、蔗糖3g，加入80ml注射用水充分溶解， 用磷酸缓冲盐调节PH值为6. 0，用高速分散机充分分散，高压均质机均质乳化至50%粒径 范围为50nm，除菌过滤，在无菌条件下迅速冷冻到-45度，冷冻干燥至水分小于5%即得紫 杉醇重组人血白蛋白结合物干燥粉末。实施例5
紫杉醇1. 0g、大豆卵磷脂5g加入30_40ml无水乙醇(或2_5ml氯仿)溶解、重组 人血白蛋白15g、大豆卵磷脂15g、蔗糖40g，加入200ml注射用水充分溶解，用磷酸缓冲盐调 节PH值为5. 8，用高速分散机充分分散，高压均质机均质乳化至50%粒径范围为80nm，除菌 过滤，在无菌条件下迅速冷冻到-40度，冷冻干燥至水分小于5%即得紫杉醇重组人血白蛋 白结合物干燥粉末。实施例6 紫杉醇0. 3g、蛋黄卵磷脂3g加入5-10ml无水乙醇(或l_3ml氯仿)溶解、重组 人血白蛋白5g、蛋黄卵磷脂5g、蔗糖10g、甘氨酸lg，加入IOOml注射用水充分溶解，用磷酸 氢二钠-柠檬酸的缓冲液调节PH值为6. 2，用高速分散机充分分散，高压均质机均质乳化 至50%粒径范围为lOOnm，除菌过滤，在无菌条件下迅速冷冻到_45度，冷冻干燥至水分小 于5 %即得紫杉醇重组人血白蛋白结合物干燥粉末。实施例7 紫杉醇0. 5g、大豆卵磷脂5g加入10_15ml无水乙醇(或l_5ml氯仿)溶解、重组人 血白蛋白Sg、大豆卵磷脂10g、蔗糖16g，加入200ml注射用水充分溶解，用磷酸氢二钠-柠 檬酸的缓冲液调节PH值为6. 5，用高速分散机充分分散，高压均质机均质乳化至50%粒径 范围为80nm，除菌过滤，在无菌条件下迅速冷冻到-45度，冷冻干燥至水分小于5%即得紫 杉醇重组人血白蛋白结合物干燥粉末。实施例8 紫杉醇2g、大豆卵磷脂8g加入40ml无水乙醇(或2_8ml氯仿)溶解、重组人血 白蛋白40g、蔗糖30g、蛋黄卵磷脂20g、麦芽糖30g，加入500ml注射用水充分溶解，磷酸二 氢钠与磷酸氢二钠的缓冲液调节PH值为6. 0，高速分散机充分分散，高压均质机均质乳化 至50%粒径范围为85nm，除菌过滤，在无菌条件下迅速冷冻到_48度，冷冻干燥至水分小于 5%即得紫杉醇重组人血白蛋白结合物干燥粉末。实施例9 对上述1-8个实施例制备的制剂复溶后粒度测试结果
权利要求
1.一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂，其特征在于，所述制剂由 紫杉醇、磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂、PH调节剂和少量水分组成，各组分质量百分比 如下紫杉醇0. 05-5%、磷脂0. 1_50%、重组人血白蛋白1_60%、冻干支持剂1-60%、PH调 节剂0. 05-10%，所述少量水分为小于5%。
2.根据权利要求1所述的一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂，其 特征在于，各组分质量百分比如下紫杉醇0. 15-3 %、磷脂1-30 %、重组人血白蛋白2-60 %、冻干支持剂2_60 %、PH调节 剂0. 05-10 %，所述少量水分为小于5 %。
3.一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂，其特征在于，所述制剂由 紫杉醇、磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂、PH调节剂、抗氧化剂和少量水分组成，各组分 质量百分比如下紫杉醇0. 05-5%、磷脂0. 1_50%、重组人血白蛋白1_60%、冻干支持剂1_60%、PH调 节剂0. 05-10%、抗氧化剂0. 01-5%，所述少量水分为小于5%。
4 根据权利要求3所述的一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂，其 特征在于，各组分质量百分比如下紫杉醇0. 15-3 %、磷脂1-30 %、重组人血白蛋白2-60 %、冻干支持剂2_60 %、PH调节 剂0. 05-10%、抗氧化剂0. 01-5%，所述少量水分为小于5%。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末 制剂，其特征在于，所述磷脂选自天然磷脂和合成磷脂中的一种或几种，其中天然磷脂包括 从大豆中提取得到的磷脂和从蛋黄中提取得到的磷脂，其中磷脂的纯度为50% -100%。
6.根据权利要求1-4任一所述的一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末 制剂，其特征在于，所述冻干支持剂选自小分子氨基酸、多糖和多元醇中的一种或几种，所 述小分子氨基酸指20种天然氨基酸中的一种或几种，所述多糖指海藻糖、蔗糖、乳糖和麦 芽糖中的一种或几种，所述多元醇指甘露醇和山梨醇中的一种或几种。
7.根据权利要求1-4任一所述的一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末 制剂，其特征在于，所述PH调节剂为生物相容性酸或缓冲盐，所述生物相容性酸指盐酸、磷 酸或其金属钠盐、柠檬酸或其金属钠盐、草酸或其金属纳盐、冰醋酸或其碱金属盐、氢氧化 钠、氢氧化钾和碳酸钠中的一种或几种，所述缓冲盐指磷酸缓冲盐和柠檬酸缓冲盐中的一 种或几种。
8.根据权利要求3或4所述的一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末制 剂，其特征在于，所述抗氧化剂指维生素E、维生素C、亚硫酸盐类、乙二胺四乙酸及其衍生 物和盐酸半胱氨酸中的一种或几种。
9.权利要求1所述的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤将紫杉醇溶解于有机溶剂中，磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂和PH调节剂溶解 于水或有机溶剂中，用挤压过滤法或高压均化法制成纳米颗粒，所述高压均化法中高压为 600-1500bar，除菌过滤冷冻干燥得干燥粉末。
10.权利要求3所述的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤将紫杉醇溶解于有机溶剂中，磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂、PH调节剂和抗氧化剂溶解于水或有机溶剂中，用挤压过滤法或高压均化法制成纳米颗粒，所述高压均化法 中高压为600-1500bar，除菌过滤冷冻干燥得干燥粉末。
11.根据权利要求9或10所述的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂的制备方法，其特征在于， 所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮中的一种或几种。
12.根据权利要求9或10所述的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂的制备方法，其特征在于， 所述纳米颗粒平均粒径小于0. 4um，获得的粉末制剂和注射用水、葡萄糖和生理盐水重制形 成PH在5. 0-7. 0之间的可注射水溶液。
13.根据权利要求11所述的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂的制备方法，其特征在于，所 述纳米颗粒平均粒径小于0. 2um，获得的粉末制剂和注射用水、葡萄糖和生理盐水重制形成 PH在5. 5-6. 5之间的可注射水溶液。
全文摘要
本发明公开一种含有重组人血白蛋白的纳米颗粒冷冻干燥粉末制剂，所述制剂由紫杉醇、磷脂、重组人血白蛋白、冻干支持剂和PH调节剂组成，各组分质量百分比如下紫杉醇0.05-5％、磷脂0.1-50％、重组人血白蛋白1-60％、冻干支持剂1-60％、PH调节剂0.05-10％。本发明获得的纳米颗粒平均粒径小于0.4um，获得的粉末制剂和注射用水、葡萄糖和生理盐水重制形成PH在5.0-7.0之间的可注射水溶液，大大提高了该制剂的产业化价值。
文档编号A61K31/337GK102078306SQ20111000428
公开日2011年6月1日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者张文芳 申请人:无锡圆容生物医药股份有限公司