专利名称：薯蓣总皂甙在制备抗阿司匹林抵抗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体地说，本发明涉及薯蓣总皂甙在制备治疗阿斯匹林抵抗药物中的应用。
背景技术：
阿司匹林(Aspirin)又阿斯匹林或乙酰水杨酸，应用于临床已有80多年的历史，是一种古老的解热、镇痛药。近年来随着前列腺素研究的深入，对阿斯匹林又有了新的认识临床上除了传统上用于解热、镇痛、抗炎外，还用于抗血小板聚集等。临床试验表明阿司匹林是心脑血管疾病高危患者一级预防有效的抗血小板药物，对心肌梗死和缺血性血管事件的二级预防也有效。
但是目前在临床上使用治疗剂量的阿司匹林，仍然有部分心脑血管疾病患者发生了冠脉血栓和中风，加大治疗剂量，不仅未能达到治疗及预防目的，而且不良反应增加，这种现象称为“阿司匹林抵抗”(Aspirin Resistance，AR)。
经过长期随访，原因如下第一血小板被其它途径激活，不能被阿司匹林阻断[Valles J，Santos MT，Aznar J，et al.Erythrocyte Promotion of platelet reactivity decreases the effectivenessof aspirin as an antithrombotic therapeutic modalitythe effect of low-dose aspirin is less thanoptimal in patients with vascular disease due to prothrombotic effects of erythrocytes on plateletreactivity.Circulation，1998；97350-355]；第二有些患者需要比常规剂量更大的剂量才能得到最佳抗栓效果，没有证据表明阿司匹林抗栓作用与剂量相关[Patrono C.Prevention ofmyocardial infarction and stroke by aspirindifferent mechanisms？Different dosage？Thromb.Res.，1998；92S7-S12]；第三某些患者尽管应用常规剂量阿司匹林也能生成TXA2[Tayllor DW，Low-dose and high-dose acetylsalicylic acid for patients undergoing carotid endarterectomyarandomized controlled trail；ASA and Carotid Endarterectomy(ACE)Trial Collaborators.Lancet，1999；3532179-2184]。
研究表明，AR的发生与下列机制有关。
红细胞提高血小板反应性血小板-红细胞相互作用影响血小板反应性，通过血小板释放反应、类花生酸类物质合成和血小板募集导致阿司匹林抵抗。红细胞引起TXA2合成增加，5-HT、β-TG和ADP释放，表明红细胞调节血小板花生酸类物质的生成[Valles J，et al.Erythrocyte metabolically enhancescollagen-induced platelet responsiveness via increased thromboxane production，adenosinediphosphate release，and recruitment.Blood，1991；78154-162]。
花生四烯酸(PGF2)代谢花生四烯酸经脂质过氧化产生一系列有生物活性的PGF2见复合物。F2-isoprostanes是血管疾病重要的新的预测因子。不稳定心绞痛、稳定性心绞痛、变异性心绞痛患者和健康人，服用阿司匹林100mg/d测量8-iso-PGF2(质脂过氧化作用的标志物)和11脱氢-TXA2(TXA2生物合成的标志物)的研究表明，不稳定心绞痛患者8-iso-PGF2尿排泄量明显高于稳定心绞痛患者和对照组；TXA2的排泄量明显高于稳定性心绞痛患者。不稳定心绞痛患者氧化剂应激增加，8-iso-PGF2增多，血小板对其他激动剂的反应增强。
吸烟刺激血小板聚集吸烟是心血管疾病主要的危险因素。资料表明阿司匹林能抑制血小板聚集率降低引起的血小板聚集[Davis JW，et al.Cigarette smoking-induced enhancement of plateletfunctionlack if prevention by aspirin in men with coronary artery disease.J Lab ClinMed，1982；126637-639]。吸烟后血小板聚集率降低。不吸烟者和吸烟成瘾者吸烟前服用阿司匹林能防止血小板聚集率下降。
儿茶酚胺水平增加血小板聚集增加体外血小板对肾上腺素的敏感性表明儿茶酚胺引起的则血小板活化和急性冠脉综合征之间存在联系[Larsson PT et al，Norepinephrine-indueed human platelet activation in vivo is onlypartly counteracted by aspirin.Circulation，1994；891951-1957]。40个急性心肌梗死患者随机分为华法林组和阿司匹林组。踏车试验前后取血，比较两组的基线特征，运动时间和最大心率。在基线时华法林组比阿司匹林组血小板聚集率明显降低，说明阿司匹林有抗血小板聚集的作用。运动时两组的血小板聚集率均降低，表明血小板聚集能力增加。其原因可能是去甲肾上腺素水平增加导致血小板活化。
血小板对胶原的敏感性增加胶原是生理性的重要的血小板聚集的激动剂。两个试验研究阿司匹林应答和胶原之间的关系。一个试验(n＝8健康男性)服用阿司匹林324mg/kg前，服药2小时后测量出血时间，区分阿司匹林应答者和无应答者。8个人中7个参与了第二个试验，给予胶原0.15-4μg/ml确定阿司匹林应答者和无应答者血小板对胶原的敏感性。第一个试验8个患者中，5个阿司匹林应答者，3个无应答者。阿司匹林应答者和无应答者服药前出血时间无差别[(408±121)和(330±30)秒，P＞0.05]，服药后有明显差别[(720±225)和(330±52)秒]。第二个试验7个患者中，4个阿司匹林应答者，3个无应答者。阿司匹林应答者和无应答者服药前出血时间无差别[(405±52)和(357±31)秒，P＞0.05]，服药后有明显差别[(623±189)和(345±54)秒][Kawasaki T，el at.Increased platelet sensitivity to cllagen in individuals resistant to low aspirin.Stroke，2000；31591-595]。
环氧化酶-2(COX-2)(p900)Cox是前列腺素合成的限速酶。Cox-1在大多数细胞和组织中表达。Cox-2的mRNA和蛋白质正常情况下在大多数组织中不能检测到。最近Webr等[Weber AA，et al.Cyclooxygenase-2 in human platelet as a possible factor in aspirin resistance.Lancet，1993；353900]报道Cox-2的蛋白质和mRNA在健康人的循环血小板中表达，这可能是阿司匹林抵抗的一个原因。
药物相互作用阿司匹林和其他非甾体类消炎药(NSAIDS)的相互作用能够削弱阿司匹林对血小板的作用。阿司匹林对丝氨酸残基的乙酰化作用，需要首先与赖氨酸-120结合，赖氨酸-120是所有NSAIDS共同作用的位点。NSAIDS对赖氨酸-120的亲和力较强，从而阻止了阿司匹林对血小板Cox-1的抑制作用。
以上阐述了阿司匹林抵抗的可能机制。明确血小板活化机制和可逆的危险因素，有助于减少阿司匹林抵抗的发生，改善患者的预后。
目前，对于治疗阿司匹林抵抗的报道还不是很多。Yusuf S等[Effects ofpretreatment withclopidogrel and aspirin followed by long-term therapy in patients undergoing percutaneouscoronary interventionthe PCI-CURE study.Lancet，2001]报道了在阿司匹林治疗的基础上加用氯毗格雷能减少急性冠脉综合征患者包括经皮冠状动脉介入治疗的患者早期和长期的严重心血管事件的发生率。
John W.等[Aspirin-resistant thromboxane biosynthesis and the risk of myocardial infarction，stroke，or cardiovascular death in patients at high risk for cardiovascular events.]通过测量患者尿液中的11-脱氢TXB2含量，研究了阿司匹林抵抗现象。结果表明，在阿司匹林治疗的患者中，尿液中11-脱氢TXB2含量可以预测心肌梗塞和心血管疾病死亡的风险。这些发现增加了这样的可能性，那就是尿液中11-脱氢TXB2含量升高的患者，其相对越容易引起阿司匹林抵抗，那么他们可能从其它的抗血小板聚集的药物中受益，从而更有效地抑制血栓烷产生和活性。
中药理血药，特别是活血化瘀类药物是历代医家所常用的药物，本类药物具有活血调经、破血消癥、化瘀止痛、消肿生肌的功效，现代药理学证实，理血药具有扩展冠状动脉、增加冠脉流量，降低心肌耗氧，降低外周血管阻力，抑制血小板聚集，改善微循环，抑制血栓形成，增强纤维蛋白溶解活性，抗凝血系统，改善微循环，降压，缓解平滑肌痉挛等作用。理血药中的川芎、丹参、益母草、桃仁、红花、水蛭等的临床作用不断的拓展。
薯蓣总皂甙是从野生草本植物薯芋科的黄山药(Dioscorea Panthaica Prain et Burkill)或穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)的根茎中提取的甾体总皂甙，其主要含有8种甾体皂甙。现代药理学研究表明，其具如下药理学作用对心脏的作用采用大鼠左冠状动脉结扎法造成急性心肌梗死，动态观察薯蓣总皂甙的作用，结果显示它在0.1g/kg能够使心肌缺血程度(ST)和缺血范围(NST)减轻，心肌梗死面积减少，表明它具有抗心肌缺血，降低缺血程度和减少缺血范围的作用；此外，它还能减慢心串、降低心脏收缩力，减少心脏做功，有效降低心肌耗氧量，改善受损心肌的营养与修复，同时可以使回心血量增多，左心室壁弹性增强，心输出量增加，有效恢复心肌的代谢和能量平衡。
对血流动力学的影响薯蓣总皂甙能扩张血管，降低血管总外周阻力从而降低血压，降低心脏负荷，改善冠心病人微循环异常，同时扩张冠脉，降低冠脉的灌注压、血球压积、全血比粘度、血浆比粘度、纤维蛋白原水平，缓解体内高凝状态，此外能增加血管壁的弹性，使其收缩更敏捷、迅速，有效缩短微循环时间。
抗氧自由基作用薯蓣总皂甙不仅可增加血SOD含量，直接清除氧自由基，还能降低心肌组织细胞膜MDA水平，有效降低脂质过氧化作用。
降血脂作用采用高脂血症大鼠模型的研究表明，薯蓣总皂甙能明显降低高脂血症大鼠TC、TG、LDL-C水平，而较大剂量时则使血清HDL-C升高，提示薯蓣总皂甙不仅对冠心病有治疗作用，同时具有防止动脉粥样硬化形成，对预防心血管意外事件如心肌梗塞、猝死的发生等有作用。
钙通道阻滞作用研究发现，薯蓣总皂甙不影响静息状态下的钙离子内流，但可抑制由去甲肾上腺素和高钾去极化引起的钙离子内流，对电压依赖性钙通道和配基依赖的钙通道均有明显的阻滞作用。
但有关薯蓣总皂甙治疗阿司匹林抵抗方面的作用尚未见报道。
发明内容
本发明是在已有产品薯蓣总皂甙的基础上，完成的新用途发明。
薯蓣皂甙的制备可以通过下述方法实现水提取法取黄山药根茎，用95％乙醇加热回流提取2次，提取液浓缩后，加水溶解，除去不溶物，水溶液浓缩得棕色浸膏。取浸膏过硅胶柱色谱，采用氯仿和甲醇系统进行梯度洗脱。收集洗脱液，浓缩，得薯蓣皂甙。
酶解法称取一定量的黄姜根茎，用粉碎机粉碎后，加一定量的高温淀粉酶及一定量的水.搅匀，置于超级恒温器中发酵一定时间后，水洗抽滤。滤渣用盐酸回流水解，用Ca(OH)2中和至中性，水洗抽滤后干燥，然后置索氏提取器中用石油醚提取，提取液经浓缩干燥后即得薯预皂甙产品。
二氧化碳超临界萃取法条件为萃取压力33.0-37.0MPa，萃取温度44-46℃，以95％乙醇为携带剂，携带剂含量3％，浸泡6h后常温60℃下分离3小时，流量21/min。
为了达到本发明的目的，采用上述方法(并不仅限于上述方法)得到的薯蓣皂甙提取物采用以下方法进行检定。
鉴别(1)取上述方法得到的产品5mg，加水10ml使溶解，置具塞试管中，强力振摇1分钟，产生持久性泡沫；(2)取[含量测定]项下遗留的沉淀少许，置点滴盘中，加入醋酐3-4滴溶解，加硫酸1-2滴，显紫红色，渐变为棕红色至污绿色；(3)取本品适量，加入甲醇制成1ml含50mg的溶液，作为供试品溶液。另取黄山药皂甙提取物或穿龙薯蓣皂甙提取物适量，加入甲醇制成1ml含50mg的溶液，作为对照品溶液。薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素为粘合剂的硅胶H板上，以氯仿∶甲醇∶水(75∶35∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以E试剂(取对二甲氨基苯甲醛1g，加入甲醇75ml，摇匀后再加入盐酸25ml，摇匀)，在105℃加热3-5分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色的主斑点。
检查依照《中国药典2000版》相应的规定，干燥失重不的超过5.0％；炽灼残渣不得超过0.3％；铁盐与标准铁溶液2.5ml制成的对照溶液比较，不得更深；重金属不得超过百万分之二十。
含量测定取上述方法得到产品0.3g，精密称定，至于150ml圆形烧瓶中，加入硫酸40％乙醇溶液(取硫酸60ml缓缓注入适量的40％乙醇溶液中，放冷，加入40％乙醇至1000ml。摇匀)50ml，回流5小时，放冷，加水100ml，摇匀，用称定量的4号垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀用水洗涤至滤液不显酸性，105℃干燥至恒重，精密称定，计算，即得。按干燥品计算，含甾体总皂甙以甾体总甙元计，优选不得少于35％。
应用小剂量阿司匹林治疗和预防冠心病、心绞痛是现代医学常用的手段之一，表现出良好的临床效果。但流行病学调查表明有些心脑血管疾病患者长期使用阿司匹林，以预防心脑血管疾病的发生，非但没有产生预期的效果，反而不良反应增加，这种现象临床上被称为“阿司匹林抵抗”。
由于阿司匹林抵抗常发生于心脑血管疾病患者中，所以本发明所述的阿司匹林抵抗为阿司匹林抵抗性心脑血管疾病；即使用阿司匹林治疗无效的心脑血管疾病，特别是阿司匹林治疗无效的冠心病、心绞痛。本发明所说的药物组合物具有抗阿司匹林抵抗的作用。
通过测量受试患者晨尿中段11-脱氢TXB2含量，研究了本发明药物组合物治疗阿司匹林抵抗的作用。其中，对阿司匹林抵抗的治疗作用是指阿司匹林抵抗患者单独使用该药物组合物，或联合阿司匹林一起使用时，其尿液中11-脱氢TXB2含量将低。实验表明，其11-脱氢TXB2含量下降越低，其治疗阿司匹林抵抗的效果就越好。本此实验中，原属于活血化瘀，理气止痛类药物的本发明药物组合物具有抗“阿司匹林抵抗”的作用。
为了更好地理解本发明的实质，下面通过临床观察薯蓣总皂甙在抗“阿司匹林抵抗”的试验结果，说明其在制药领域中的新用途。
患者尿中11-脱氢TXB2含量是目前公认的最能代表人类“阿司匹林抵抗”的指标。本试验采用测量患者晨尿中11-脱氢TXB2含量，来说明服药前后患者“阿司匹林抵抗”的改善情况。
一般资料本组177例病人全部来自总后第一干休所、八分部干休所离退休人员。其中男性140人，女性37人。年龄70岁～87岁，平均年龄77.1岁。随机选出170人进行标本检测，数据可接受范围150人(IC20～IC80)。记入统计人员中，服阿司匹林者50人；服用薯蓣总皂甙50人；合用者50人(全部病人至采样之日，至少已连续服药半年以上)，其中91人合并有高血压史，25人有高血脂，32人有糖尿病，139人有冠心病，57人有脑血管疾病。
材料与方法所采尿样为第一次晨尿中段，取后立即投入液氮中，后保存于-86℃低温冰箱中备用。应用免疫酶标法检测11-脱氢TXB2，试剂盒采用Cayman Chemical公司产品，全部实验在天士力研究院生物所完成，病人分组状况对实验室人员及后期数据统计人员实行双盲。
结果对组间均值进行t-检验，对组间抵抗者频数进行x2检验。
表1.各组病人尿值11-脱氢TXB2(ng/mmol)阿司匹林与薯蓣总皂甙合用阿司匹林(n＝50例) 薯蓣总皂甙(n＝50例)(n＝50例)尿值11-脱氢TXB2(ng/mmol) 尿值11-脱氢TXB2(ng/mmol) 尿值11-脱氢TXB2(ng/mmol)30.24 30.94 19
19 13 8.3518.78 19.36 29.3630.46 12.23 17.6615.26 12.63 24.0237.24 31.86 17.6511 13.08 21.2336 35.64 32.7711.63 23.32 9.2538 10.38 11.4434.64 9.52 1113.41 28.6 25.6216.68 28.01 25.3227.621.94 12.7730.12 27.32 28.9214.74 15.21 11.0115.54 34.42 28.1238.25 10.67 9.7427.68 18.8 30.2528.94 24.25 20.1136.51 28.67 15.2617.45 14.25 13.3315.32 31.58 2539.35 10.25 8.5937.65 22.49 319.2520.52 2514.84 11.28 29.7347 31.28 31.2528.43 10.53 10.2727.32 35.66 22.3527.00 16.35 11.239.523.11 9.0418.25 10.99 30.2537.42 13.48 12.826.26 19.5 14.730.44 32.7 2916.82 28.56 79.9623.52 269.2415 8.7425 30.24 14.724.22 28.62 29.9930.24 15.43 2534.45 25.36 18.4330.22 13.99 19.79.7835.89 22.0527.63 10.02 37.05
10.1 14.23 7.938 21.33 10.8245.2721.96 26.2515.2421.45 19.0725.16±11.21 21.33579±7.563 19.39421±8.919结论薯蓣总皂甙与阿司匹林合用组(薯蓣+阿)与阿司匹林单独使用组组间尿中TXB2排泄量之间有明显统计学差异，t＝2.50 p＜0.05；薯蓣总皂甙与阿司匹林组组间尿中TXB2排泄量之间也有明显统计学差异，t＝1.99 p＜0.05；薯蓣总皂甙组与薯蓣总皂甙合用阿司匹林(地奥+阿)组组间尿中TXB2排泄量之间无明显统计学差异，t＝0.62 p＞0.05。
该实验结果证明，薯蓣总皂甙可使尿中的TXB2排泄量减少，即在体内可阻断血栓素A2(TXA2)的形成，减少血小板的黏附和凝血，从而抑制血小板聚集，减少动脉硬化、心肌梗塞的发生，结果说明薯蓣总皂甙具有抗阿司匹林抵抗作用，对阿司匹林无效的心血管病患者，薯蓣总皂甙依然有改善生命指标的作用。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述该实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。
实施例1薯蓣总皂甙的制备取黄山药根茎10kg，用95％乙醇加热回流提取2次，提取液浓缩后，加水10L溶解，除去不溶物，水溶液浓缩得棕色浸膏。取其中50g进行硅胶柱色谱分离，采用氯仿-甲醇(20∶1)系统进行梯度洗脱，得薯蓣皂甙产品。其中，按干燥品计算，含甾体总皂甙以甾体总甙元计，不得少于35％。
胶囊剂的制备将上述方法得到的薯蓣总皂甙加工制成胶囊，即得。
实施例2薯蓣总皂甙的制备称取一定量的黄姜根茎，用粉碎机粉碎后，加一定量的高温淀粉酶及一定量的水，搅匀，置于超级恒温器中发酵一定时间后，水洗抽滤。滤渣用3mol/L盐酸回流水解4h后，用Ca(OH)2中和至中性。水洗抽滤后干燥，然后置索氏提取器中用石油醚提取6h，提取液经浓缩干燥后即得薯蓣皂甙产品。其中，按干燥品计算，含甾体总皂甙以甾体总甙元计，不得少于35％。
胶囊剂的制备将上述方法得到的阿薯蓣总皂甙加工制成胶囊，即得。
权利要求
1.薯蓣总皂甙在制备抗阿司匹林抵抗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的薯蓣总皂甙在制备抗阿司匹林抵抗药物中的应用，其中的薯蓣总皂甙的制备方法为水提取法或酶解法或超临界萃取法。
3.根据权利要求1或2所述的薯蓣总皂甙在制备抗阿司匹林抵抗药物中的应用，其中的薯蓣总皂甙中，按干燥品计算，含甾体总皂甙以甾体总甙元计，不得少于35％。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种药物组合物在制备治疗阿司匹林抵抗药物中的应用，其特征在于该药物组合物在制备治疗阿司匹林抵抗性心脑血管疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的阿司匹林抵抗性心脑血管疾病是指使用阿司匹林治疗无效的心脑血管疾病。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的阿司匹林抵抗性心脑血管疾病是指使用阿司匹林治疗无效的冠心病、心绞痛。
全文摘要
本发明公开了薯蓣总皂甙在制备治疗阿司匹林抵抗药物中的应用。其中，薯蓣总皂甙的制备方法包括水提取法、酶解法或超临界提取法等，按干燥品计算，含甾体总皂甙以甾体总甙元计，不得少于35％。
文档编号A61K31/7042GK1634100SQ200310122040
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月31日 优先权日2003年12月31日
发明者吴迺峰, 郭治忻, 范立君, 郑军, 郑永锋, 李旭 申请人:天津市天士力制药股份有限公司