培养基组合物、培养方法和获得的成肌细胞及其应用的制作方法

专利名称：培养基组合物、培养方法和获得的成肌细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于一种源自肌肉组织的祖细胞/干细胞的培养基组合物，涉及一种用于祖细胞/干细胞培养的方法，以及一种生产能够用作细胞/基因治疗产品的成肌细胞的方法。
背景技术：
已进行许多有关细胞培养方法的研究，以便获得富合成肌细胞的细胞部分，用于给予一般患有肌退化的患者，如迪谢纳肌营养不良。例如，这些研究中许多涉及到原始细胞的选择、培养条件、或细胞鉴定步骤。
在这方面，可以提及文献US-A-5538722，其提出了用于体内合成肌蛋白的方法，该肌蛋白是由在培养中将DNA整合到成肌细胞而得到的，这些成肌细胞已经历至少5次细胞复制。
文献US-A-5130141披露了一种用于获得源自培养物的肌源细胞以及先前已克隆的肌源细胞的方法，后者优越于前者，这是由于其优越的发展潜力。
文献US-A-2001 0034061披露了通过受控使用缺氧培养来培养祖细胞以促进特定的分化的方法。
最后，文献WO-A-01 94555提出了提供具有良好特性的肌源细胞群，其适合用于细胞治疗，特别是在细胞治疗中用于所需用途而制备的肌源细胞群。
然而，有更少数的研究工作涉及培养基本身的组合物，其目的在于生产适用于细胞/基因治疗的细胞群。
在后者之中，有欧洲申请EP-A-1048724，其涉及培养永生化肌细胞系的方法，即，其在大量传代后获得，其用于基因治疗“修复”缺损肌肉组织，或作为载体，一种或多种基因可以引入其中以便提供确定的产品。
文献WO-A-97 00774教导一种用于改善获得移植物的方式，具体做法是在生长因子如bFGF和金属蛋白酶生成的诱导物存在的情况下，“预调节”供体的成肌细胞，以便增加移植的成肌细胞的移行距离并增加表达肌肉功能蛋白的融合成肌细胞的数目。
文献WO-A-99 56785披露了一种生产肌细胞的方法，其在注射进肌功能障碍部位前进行遗传修饰该方法尤其用于治疗尿失禁。
文献WO-A-01 78754涉及具有长期原位存活能力的祖细胞，其具有特定的表达细胞标记物的外形并且可用于治疗尿失禁。
最后，文献WO-A-02 067867涉及一种用于制备干细胞的方法，它是利用细胞底物以结合后者它尤其用于泌尿治疗。
因而包括上述现有技术的所有这些资料的文献，共有以下特点在实际细胞培养期间使用非补充的动物血清(非人血清，例如，牛或马血清)，后者可被认为足以供给细胞增殖所需要的所有元素。

发明内容
移植需要生产大量的成肌细胞，于是重要的是通过从源自肌肉组织的祖细胞/干细胞开始来改善该生产。本发明提出补充用于培养基的血清(或血清成分)，因而使得优化培养基成为可能。因此，可以缩短培养时间。因而该优化使得使用较少的血清(或血清成分)成为可能，其在人血清的情况下是必要的，其的可获量有限并且同时可以无需使用动物蛋白，而动物蛋白是朊病毒或病毒污染的潜在来源。
为了解决从祖细胞/干细胞开始生产成肌细胞的优化问题，本发明提出细胞培养基组合物，其包括(i)人起源和/或动物起源的血清和/或血清成分(ii)胰岛素或后者的衍生物(iii)一种或多种选自抗氧化剂和/或维生素的化合物。
可以使用牛源、优选人源的血清和/或血清成分。有利地，人血清的浓度小于5％(体积)，以及更有利地在1％至3％(体积)之间。
通常，胰岛素衍生物选自IGFs、以及钒酸盐型胰岛素模拟物(insulomimetics)。
有利地，维生素是抗坏血酸，而抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸或硒。
在一个具体实施例中，还可以使用选自FGF型生长因子的一种或多种化合物。通常，此生长因子选自bFGFs、FGF-2至FGF-10。
在另一个具体实施例中，如果合适的话，培养基可以包括糖皮质激素。
在另一个具体实施例中，培养基组合物还包括脂磷脂酸和/或一种或多种化合物，其来自EGFs、heregulins(一种神经调节素)、凝血酶、PDGF、甲状腺激素、以及LIF。
本发明还涉及培养祖细胞和/或干细胞的方法，其中在细胞扩增步骤期间将先前介绍的组合物用作培养基。
根据一个具体实施例，细胞分化步骤是在细胞扩增步骤之前、期间、或之后进行。通常，使用的人血清与祖/干细胞是自体的。
本发明还涉及通过实施先前介绍的方法来生产成肌细胞的方法。
根据一个具体实施例，祖细胞和/或干细胞是通过细胞提取步骤从肌肉组织获得。有利地，提取步骤通过酶消化来进行。
根据另一个具体实施例，对获得的细胞进行收集和分离。通常，细胞的收集和分离是通过酶消化接着离心和/或过滤来进行。此外可以省去酶消化步骤。
根据另一个具体实施例，试验了成肌细胞形成集落的适用性。
根据另一个具体实施例，进行细胞表征。有利地，使用了细胞周期标记物。
根据另一个具体实施例，进行了冰冻成肌细胞的步骤。
本发明还涉及在培养基中的细胞群，其包括祖/干细胞或成肌细胞或后者的混合物。
根据本发明，按照前述方法生产的成肌细胞可以用于细胞治疗。优选地，它们用于制备产品，该产品用于治疗尿失禁或功能治疗小肌(这些肌(特征在于其较小的尺寸)的非完全清单包括括约肌如尿道或肛门括约肌、眼睑肌、手指肌、以及喉肌)。
根据另一个具体实施例，如此生产的成肌细胞用于基因治疗。
最后，本发明涉及生产的成肌细胞用于毒理学和/或药理学筛选。通常，该筛选的目的在于检测横纹肌溶解症涉及的一种或多种物质。


根据下文结合附图进行的本发明的具体实施例的描述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见，其中图1是矩形图，其表示在每单位表面积上人肌细胞的细胞核数目，其中使用以下培养基(A)没有生长因子；(B)含有5％的根据本发明的人血清；(C)FGF+胰岛素+PDGF+EGF+地塞米松+凝血酶(混合物M)；(D)相应于(B)+(C)，以及含有20％胎牛血清的“FCS”培养基。
图2A示出了加入培养基的地塞米松的剂量(浓度为0至10-6M)对来自传23代的大鼠细胞的增殖的影响，其中培养基含有胎牛血清(FCS)并补充以胰岛素和FGF。
图2B示出了地塞米松的特性研究。观察了在含有胎牛血清(FCS)并补充以胰岛素和FGF的培养基中，加入10-7M地塞米松、或另外的固定剂量(10-7M)的类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮、DEHA、SDEAH、醛固酮)对细胞生长的影响。还与抗孕激素RU486结合对地塞米松进行了试验。
图3示出了洛伐他汀对肌细胞和脂肪细胞的毒性的比较研究。
图4示出了在人临床应用中不同抑制素对人肌细胞的毒性的比较研究。
具体实施例方式
在图2A和图2B中，染色强度(此处由暗斑表示)随细胞密度的增加而增加。对于每种浓度用三个培养孔进行试验。
本发明首先涉及用于细胞增殖和/或分化的培养基组合物。尤其可以使用这种培养基以便确保肌祖细胞和/或干细胞在成肌细胞中的增殖和分化。除基础营养培养基之外，本发明的培养基组合物包括最少量的人源和/或动物源血清、胰岛素(或其衍生物之一)、以及抗氧化剂、和/或维生素。
所使用的基础营养培养基用依赖于或不依赖于CO2浓度的缓冲液进行缓冲。优选培养基中不含N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸作为缓冲剂，因为15mM的浓度会长期抑制人肌细胞的生长。在大多数情况下，使用的培养基由DME型、Ham F12型、以及MEMα型培养基的混合物构成。在这些混合物之中，还可以提及例如DME/F12和DME/MCDB 202混合物。在培养祖细胞和/或干细胞期间尤其适合的基础营养培养基还包括4.5g/l葡萄糖和3.7g/l碳酸氢盐。优选培养基的另一个实例是培养基MCDB 120，其通过用D-缬氨酸代替L-缬氨酸加以改进。
在本发明的组合物中可以使用动物源(例如牛或马)的血清，但可以获自PAA Laboratories的人源血清是优选的，以避免动物源的血清对人类污染的风险。代替血清，还可以使用血清成分(由血清的一种或多种子要素构成)，其通常可以商业上获得(如人白蛋白或转铁蛋白)。在细胞培养期间尽可能降低人血清的浓度是特别有利的，因为不同于丰富和相对容易获得的动物血清，人血清获自更有限的“来源”，即患者，并且希望限制血液采集的次数并采用尽可能少的血液。根据本发明的一个具体实施例包括利用浓度小于5％的人源的血清或血清成分，并且优选浓度在1％至3％之间。
图1意外地显示，在人血清中加入混合物M(C)使得成肌细胞的生产比单独用HS(人血清)(A)好三倍。实施例2和实施例3，其中分别补充以人血清和胎牛血清，更详细地说明此点。
细胞培养基组合物还包括胰岛素或胰岛素模拟物。在后者之中，可以发现属于生长调节素或胰岛素样生长因子的激素，如IGF1和IGF2，或金属如钒酸盐，其抑制特定的磷酸酶基团。
在根据本发明的组合物中，至少一种抗氧化剂和/或一种维生素应加入培养基。在抗氧化剂之中，N-乙酰半胱氨酸(浓度在0至10mM之间)或硒是优选的。一般而言，硒浓度在0至1mM之间，形式为亚硒酸钠或硒蛋氨酸(Sigma)。应当注意到，术语“抗氧化剂”还指培养条件，其中使用降低的氧分压。
在维生素之中，可使用浓度在0至1mM之间的抗坏血酸或浓度在0至100mM之间的烟酰胺。还可以使用维生素E。然而，抗坏血酸是优选的维生素，因为它产生最好的结果，如实施例4所示。
除了与前述化合物结合的血清外，还可以将属于FGF生长因子的一种或多种化合物加入本发明的培养基。这些因子允许培养中的细胞、尤其是干细胞或祖细胞，以特定方式增殖以及分化。这类生长因子包括bFGFs、FGF-2至FGF-10。一般而言，这些生长因子的浓度在0.1ng/ml至100ng/ml之间。
根据本发明的一个具体实施例，至少一种糖皮质激素可以加入培养基。这些激素尤其作用于糖类的代谢。可以使用天然或半合成糖皮质激素，即氢化可的松、地塞米松、泼尼松龙、或曲安西龙。地塞米松(Dex)是优选的糖皮质激素。如实施例5所示，糖皮质激素对于细胞生长具有刺激和特定效应。
本发明的另一个具体实施例包括利用一种或多种另外的添加剂，其选自脂磷脂酸、生长因子EGF、PDGF、heregulins、凝血酶(IL6、IL8、IL-15)、LIF、以及甲状腺激素(包括T3、T4)。
如果合适的话，还可以加入转铁蛋白作为抵抗重金属的保护因子。在培养基组合物中可以包括其他激素或活性分子，如肝细胞生长因子、HGF/SF、以及具有特征的不同因子如LIF、VEGF、SCF、TGFb、TNFa、凝血细胞生成素、或生长激素。
还可以使用孕激素和衍生物(如孕酮)、雌激素和衍生物(如雌二醇)、雄激素和衍生物(如睾酮)、盐皮质素和衍生物(如醛固酮)、激素LH、LH-RH、FSH和TSH、视黄酸和其衍生物、降钙素、前列腺素E2和前列腺素F2α、或甲状旁腺激素。
根据本发明的一个具体实施例，以上规定的组合物特别适合于作为源自肌肉组织的祖细胞和/或干细胞的培养基。
根据本发明，优选使用与培养的祖细胞和/或干细胞为自体的人血清，因为这可以消除在使用异种血清期间存在的污染危险。在这种情况下，结果是不再需要在细胞培养框架内在其使用之前对血清进行处理。
本发明还涉及生产成肌细胞的过程，在此期间肌祖细胞和/或干细胞在其组成以上已规定的培养基上进行培养。此生产过程可以分成以下阶段-提取例如通过酶处理获自肌肉组织的细胞，-扩增培养在上述步骤中获得的细胞，它们经历选择生长，-冰冻源自扩增的细胞(如果合适的话)，-在移植到患者之前表征源自扩增的细胞。
在此生产过程之前，进行肌肉活组织检查以便收获祖细胞和/或干细胞。它是在局部麻醉下通过切开进行。样品的大小大约为1g，从其可以提取106个细胞。在进行活组织检查后，组织放置在保护培养基中。此保护培养基基本上包括前述的基础营养培养基，对其可以加入抗生素，如庆大霉素，由于较少的变应性特性其优于青霉素衍生物；保护因子如肉碱(卡尼汀))(1mM)、胰岛素(10μg/ml)、地塞米松(5.10-9M)、抗坏血酸、烟酰胺、以及海藻糖。温度必须低于25℃而高于4℃。优选的是，转运培养基的体积至少比肌肉组织的体积大10倍，而转运时间不超过24小时。具体而言，这些细胞可以获自外股肌、内股肌、二头肌、四头肌、胫骨肌、腓肠肌、腓骨肌、三角肌、大背面肌、胸锁乳突肌、肋间肌、肩胛舌骨肌、腹肌、或来自腰大肌。可以进行切碎步骤以允许其后更好的酶解离。此包括将活组织检查切割成大小优选小于0.5mm的切片并放置在适当的培养基中。可以利用精细的剪刀人工进行切碎。还可以辅助方式进行切片，例如，利用由电能或机械能提供动力的切割机。这样的适用机器的一个实例是Medimachine(由Becton-Dickinson配送)。
本发明的一个具体实施例包括从肌肉组织提取细胞。事实上，肌肉组织由肌纤维构成，在其内卫星细胞位于后者的基底层的下方。解离肌纤维和分离卫星细胞的步骤使得分离后者成为可能。根据本发明优选的解离步骤包括使用细胞外间质消化酶。为解离所取样的组织的肌纤维和卫星细胞所使用的酶以及其浓度是通过研究其酶有效性加以选择，寻找的准则是为获得类似效果所需要的尽可能最低的酶浓度和最少的保温时间。过滤后获得的细胞产率部分取决于酶解离步骤的质量。在本发明的方法中可以单独或组合使用的消化酶是，例如，所有胶原酶，包括部分纯化的类型IA、S和H，以及由Roche-Boehringer以Liberase名称出售的纯化形式，链霉蛋白酶，或胰蛋白胨，所有起源，在含有或不含有EDTA的缓冲溶液中，分散酶(也称作蛋白酶)，弹性蛋白酶，或透明质酸酶。尤其是胰蛋白胨-胶原酶或链霉蛋白酶-胶原酶酶组合是合适的，如实施例1的结果所示。在后者之中，链霉蛋白酶-胶原酶组合是优选的，因为这些是非提取起源的酶，因而可以避免被朊病毒或病毒污染的健康危险。还可以使用胶原酶作为单个酶。优选通过顺序过程进行此提取步骤以便最大程度减少细胞暴露于酶的时间。此外希望酶处理的持续时间不超过10分钟，以及使用20和25℃之间的处理温度。对于所有此步骤，使用的培养基是保护培养基。通过稀释、洗涤、以及离心作用来抑制酶的作用。
提取处理的变型是合适的。一方面，解离步骤可以分两阶段进行；在有胶原酶的情况下第一次保温以及在有胰蛋白酶的情况下第二次保温。另一方面，通过吸管抽吸以及通过吸管输送悬浮液的机械解离可以完成酶分离。
于是通过显微观测释放自组织片段的细胞可以监测酶消化的有效性。通过这种观测，可以注意到各种大小细胞、红细胞、以及肌节片段的存在。这些肌节片段是肌肉组织的酶消化有效性的良好指示物。建议按照先前描述的相同处理再次对未被酶消化的组织片段进行新的酶消化。重复该操作5次尤其是适当的。按照本技术领域熟知的程序可以在此步骤(培养前)对细胞进行冰冻。
本发明还涉及生产成肌细胞的过程，在此期间利用如已经描述的培养基进行细胞扩增步骤。在此扩增阶段结束时，主要获得成肌细胞的细胞群，即，其中发现最小70％的成肌细胞。此细胞生长步骤以后是分化步骤因此先前描述的生长培养基由分化培养基取代，其一个实施例在下文提供(实施例6)。
为了改善成肌细胞前体的生长，在细胞培养领域通常是使用胶原或其衍生物如白明胶。这些物质是通过提取获自牛尸体，存在污染后危及健康的风险问题，例如，通过朊病毒。因而本发明提出通过使用经基因工程获得的蛋白来解决此问题。商业上可获得的称作Pronectin F的分子，其是纤连蛋白的RGDS片段的多聚体，对此是特别合适的。对于人细胞(如那些肌肉组织前体的细胞)的生长具有可与白明胶相比的有效性，于是此蛋白可以用在本发明的框架内作为底物。还可以使用L-赖氨酸或D-赖氨酸多聚体。
优选的是，细胞在适合于培养粘附细胞的反应器中进行培养。为了避免检查搅拌速度、其规律性、以及制剂的均一性的限制，优选地培养反应器是固定的。与标准载体(平皿、烧瓶)相比，它必须具有较大的培养表面以便在几天内收获较大的细胞群。这样的培养反应器的一个实例是平板培养装置(单、双和/或多级)。
在此方法中可以使用的培养装置还使得可以无菌方式对细胞进行取样。这使得可以通过分析特定标记物进行取样，这些取样是鉴定在不同培养阶段存在的细胞类型所必需的。它允许以无菌方式排空培养基、洗涤和分离细胞、以及最后进行收获。
可以使用袋以及特别合适的无菌管来将袋连接到反应器以便允许倾析培养基或收获细胞。因此，该装置可以在密闭系统中进行大量的操作。取决于所需要的细胞群，培养天数从0至45天不等。
此外，通过标准扩增或灌注技术可以进行连续培养，其持续时间可以长达数月。
为了增加收获的细胞数目，可使用一个或多个扩增期。扩增时期包括分离细胞、洗涤细胞、以及在更大培养表面积上再培养的步骤，用于进行这些步骤的溶液和酶是本领域技术人员熟知的。
具体而言，本发明的方法包括至少一个细胞扩增期。这样的方法可以增加细胞的数目同时确保在每个扩增培养结束时大多数初期的祖细胞和/或干细胞分化成成肌细胞。根据本发明的一个具体实施例，对已经受扩增步骤的部分细胞进行冰冻。冰冻程序提供在实施例8中。例如，可以冰冻1/5的培养物，即，大约2.105细胞，剩余4/5经受细胞扩增过程。为了能够及时使用如此制备的细胞，在一定条件下对它们进行冰冻可能是有利的，以致其后的融化允许足够存活的细胞，优选大于90％。例如，细胞悬浮在冰冻培养基中。这些冰冻培养基组合物通常是DME/F12培养基并具有1mM L-卡尼汀、0.2521mM抗坏血酸、5.10-9M地塞米松、10μg/ml胰岛素、以及2％人血清，并被转移到两个无菌冰冻袋，浓度在105至107细胞/ml之间，或转移到细胞冰冻管中，浓度在105至107细胞/ml之间。在这些条件下，防腐剂是DMSO，浓度为10％。海藻糖L-精氨酸(高达0.5M)可以加入此冰冻培养基。通过将细胞浸入此二低聚糖(diholoside)中，使得可以改善后者的保存。冰冻是利用一种装置(Digicool或Nicool)进行，以确保温度的受控逐渐下降。细胞存储在液氮中直到融化时。培养后冰冻细胞的融化可以例如用37℃的水浴进行。利用等渗盐水溶液洗涤细胞制剂两次。通过无菌连接于等渗溶液袋以及连接于排空袋进行冲洗。保存等分试样用于评估细胞生存力和质量。
在细胞扩增以后，应通过酶消化进行细胞的分离。在此步骤期间以及为了降低健康风险，使用商业上可获得的重组源胰蛋白酶。
在未来临床应用的框架内进行细胞移植之前，优选地根据本发明在分子和功能水平上对通过上述成肌细胞生产方法获得的细胞悬浮液进行表征。在标记表面抗原或任何对要分析的不同细胞类型特异的抗原以后，可以通过流式细胞荧光法或FACS对细胞标志进行分析从而进行表征。在本文中，术语“细胞标记物”是指任何细胞抗原，其使得能够单独地或与其他标记物结合提供关于细胞类型的信息。
此表征可以利用其他细胞标记物在蛋白质水平上进行如-P-Cam作为内皮细胞标记物-N-Cam作为神经元以及肌细胞标记物-“平滑肌肌动蛋白”作为平滑肌标记物-GFAP作为胶质细胞标记物
-MyoD Myf5、Pax3、Pax7、C-met以及M-钙粘素、N-cam作为肌细胞标记物-Scal+、C-Kit、CD45、CD34以及CD56作为干细胞标记物-PCNA、P21、P16、Ki67作为细胞周期标记物。
此表征也可以利用DNA芯片(基因阵列)在转录水平上进行，其中DNA芯片含有为细胞基因(例如，特异性转录因子和细胞周期机器样因子)编码的寡核苷酸，这使得可以鉴定在细胞悬浮液中的细胞。
获得高纯度细胞群可以证明对于某些作为细胞治疗产品的应用是必要的。显而易见，本领域技术人员可以实施现有技术中提出的不同技术以便选择性地筛选所述细胞。作为实施例，可能有所提到的通过克隆、流式细胞荧光法、或免疫亲和或免疫磁柱(利用对上述细胞特异的抗体)的筛选技术。为此，应使用分子表征和功能生物表征。选择的细胞标记物可以鉴定肌纤维的前体细胞。此鉴定不是通过单一标记物而是通过标记物组合来进行。这些标记物是膜标记物如N-Cam、Vla4、M-钙粘素、整联蛋白、CD56，细胞质标记物如肌纤维蛋白，以及细胞核标记物如pax7和myoD。为了增加植入有机体细胞的移生和生长能力，用于细胞治疗的细胞对于细胞周期机器的标记物如Ki67、PCNA是阳性的，而对于细胞周期抑制剂如P21和P16是阴性的。另一方面，这些细胞对于末端肌分化的末端标记物是阴性的，如肌细胞生成素和肌钙蛋白T(TNT)。细胞功能度的分析是在培养基中通过生物试验来进行。这些试验的目的是确定细胞样品在培养基中形成集落的能力以及肌源集落的频率。此试验可以在细胞提取之后、或在冰冻之前、或在冰冻之后进行。原则是基于利用特定分化培养基对低密度生长和细胞表型发育的分析。应注意到，细胞接种密度必须尽可能低。祖细胞/干细胞先经受生长期，接着是细胞分化期。然后用乙醇溶液固定生成的细胞，按照本技术领域熟知的程序用吉姆萨染液进行染色，然后用数字装置进行照相。然后在功能度试验的框架内，后者进行以下步骤-宏观观察，可以计数集落的总数并确定具有克隆生长潜力的细胞的百分数，-微观观测，可以确定肌前体集落的数目和百分数。肌前体的集落，通过细胞融合，形成多核梭形细胞，在生物内将形成肌纤维的肌管。
该功能试验说明于实施例6。本发明还包括任何包含在如上所规定的培养基中的细胞群。细胞群是指任何非纯细胞群，一般含有主要的细胞类型以及一种或多种次要细胞类型。因而此具体实施例涉及大多数为祖细胞和/或干细胞的群(即，在扩增期发生之前)、富集成肌细胞的群(在细胞扩增步骤以后)、以及“中间”群，其相应于没有细胞种类占大多数的情况，即，在扩增过程期间。因而它可能是不同细胞类型的混合物。
本发明涉及主要细胞类型由成肌细胞构成的细胞群应用于制备细胞治疗产品，其用于重建人的骨骼、心和内脏肌肉组织、以及血管组织。
根据一个优选具体实施例，作为细胞治疗产品的成肌细胞群用于治疗男性或女性的尿失禁。后者可能因不具足够的压力闭合尿道，尿道的正常阻力一半源于平滑括约肌而一半由中部尿道的纹状括约肌而引起。
该细胞治疗产品还可以用来治疗在前列腺癌治疗以后的失禁以及先天或获得性肌营养不良。在营养不良患者中，移植成肌细胞能够恢复抗肌萎缩蛋白表达。它包括例如将通过本发明的方法获得的肌起源细胞直接注射到骨骼肌或利用针注射到全身循环中。
适合于给予人的细胞治疗产品包括细胞重悬浮于其中的等渗溶液。优选的是，该溶液没有毒性成分存在于冰冻培养基中。
在治疗尿失禁的情况下，这尤其包括利用针将细胞群，其主要类型具有成肌细胞的特征并获得以及制备成细胞治疗产品，直接注射到尿道或横纹括约肌，以便改善尿道闭合机制的功能。注射的细胞数目在105至107个细胞之间。
还可以通过经尿道超声探针控制成肌细胞的注射，以及在注射前后测量尿道压力，因而具体而言可以利用MRI估计尿道闭合压力的变化。
在本发明所提供方法的细胞培养和扩增期期间，可以通过转染异种核酸对细胞进行遗传修饰。选择核酸以便允许在转染细胞中表达多肽或蛋白质。然后移植经转染的细胞并允许输送从异种核酸开始表达的多肽或蛋白质，所述多肽或蛋白质是生物活性产品。因而本发明涉及应用作为细胞治疗产品的细胞群作为输送生物活性产品的平台。为了遗传修饰前体细胞，优选使用病毒方法，其可以在培养物中快速而有效地对细胞进行修饰。在这种情况下莫洛尼型逆转录病毒特别有效。可以将分子标记物插入此病毒，如GFP型荧光蛋白(实施例7)。如此修饰的细胞在引入动物后是追踪细胞命运的工具。
根据本发明的另一个具体实施例包括在毒理学和/或药理学筛选中使用成肌细胞群。目的是尽可能缩短开发以及临床前和临床试验期，以便尽可能快速地响应患者的需要。事实上，在开发药剂时使用此细胞群作为“模型”是有利的，因而使得可以进行高生产率筛选。然后可以探明发病初期的发病机理并发现治疗靶或成为活性组分的候选分子。此筛选还可以用于毒物学，尤其是用于研究药剂相互作用。
药理学/毒理学的专家熟知如何实施自动化技术，并且能够从几千种新分子或已经用作其他病理学的药剂库中选择感兴趣的分子，作为要达到的靶的功能。根据本发明的一个优选具体实施例包括利用药理学/毒理学筛选以便检测横纹肌溶解症(即，横纹肌的溶解)涉及的靶分子。
事实上，由于抑制素家族的胆固醇合成抑制剂(HMG-CoA还原酶抑制剂)的致命事故已将肌肉组织放置在最前部作为毒理学靶。对于Bayer已知的西伐他汀的危险的粗劣评估已对人和经济造成不可忽视的后果。
大量的药物能够导致肌病。在急性和严重的情况下，发生肌肉组织大量溶胞(横纹肌溶解)，其机理仍然不清楚。已经提出几种假说。这些假说中一些指的是膜透性的增加，而另一些指的是线粒体水平的异常。
在大多数情况下，在综合化学疗法情况下发生的事故暗示出药剂(大环内酯、免疫抑制剂、抗癌剂、贝特(fibrate)、可卡因、HIV抗蛋白酶、麻醉剂等)间的相互作用。
在大量的物质中包含P450细胞色素、参与细胞凋亡如BCL2中的分子、抗氧剂、NFKb络合物中的蛋白质、PPAR或外科手术。
除了急性事故之外，可能发生生命预后(横纹肌溶解)，肌肉机能障碍的临床体征是衰弱、肌肉疼痛(肌痛)、易疲劳性、痛性痉挛，以及除了极性事故CPK水平以外的生物学体征通常是很正常的。在斯达汀的情况下，新近的数据表明患有肌肉肌能障碍的患者既没有显示在药物学药剂的血浆水平与中毒性机能障碍之间的相关性，没有显示出CPK升高。在这些情况下，组织学揭示了肌肉组织中线粒体(疏松部)的变型和脂滴的累积。
在潜在的靶分子之中，可能提及HMG-辅酶A还原酶抑制剂、肌酸激酶、斯达汀(statins)、贝特(fibrates)、麻醉剂、海洛因、大环内酯、环孢菌素以及其衍生物。
以下部分提出了用于说明本发明的具体实施例。然而，后者可能对于熟知本领域的技术人员来说是并非限制的，可提供还被本发明涵盖的一些变型。
具体实施方式
实施例1在无提取来源的蛋白质存在的情况下从肌肉组织活组织检查中提取细胞本试验包括对不同细胞提取实验方案效果的比较。参考实验方案使用两种酶的混合物(胰岛素+胶原酶)。胰岛素来源自猪，胶原酶来源自细菌。通过胎牛血清停止这些酶的活动。在如下的实验方案中，选择细菌来源的酶并且消除胎牛血清。
所使用的祖细胞/干细胞源自成年母绵羊肌肉组织的活组织检查。
细胞提取的实验方案具有顺次类型。酶的活动受稀释、洗涤、离心的抑制。酶处理期不超过10分钟。处理温度在20-25℃。将肌肉组织(切碎后为1克)放入酶溶液中，该酶溶液比肌细胞的容积大例如至少10倍。酶溶液由胶原酶(0.5mg/ml)和胰岛素(1mg/ml)的结合组成，没有添加血清，或者由胶原酶(0.5mg/ml)和链霉蛋白酶(1mg/ml)的结合组成，有或没有添加胎牛血清，这些酶可以在DME/F12中溶解，在该DME/F12中添加了15mMHepes(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸)。
使用于细胞提取的补充的基础培养基(无血清)是加入15mMHepes的DME/F12，10μg/ml的人胰岛素，10ng/ml的FGF-2，地塞米松(5.10-9M)，0.252mM的抗坏血酸维生素C和1mM的L-肉碱。在与酶溶液接触10分钟之后，混合物(酶溶液和组织碎片)稀释成30ml的容积以抑制酶，然后，进行缓慢离心(少于每3分钟10克)。通过该程序，重新获得包含通过第一次酶消化提取的细胞的上清液以及残存的组织碎片。为了从该第一次酶消化中重新获得细胞，在200克进行大约3分钟的离心。由此所获得的细胞重悬浮在无血清的介质中。酶消化(酶解)的效率通过对从组织碎片释放出来的细胞的显微镜观察监控。保留的组织碎片再次经受根据相同实验方案的酶消化。该操作连续重复5次。
用于细胞附属物的底物是牛明胶。使用补充了20％的胎牛血清、10μg/ml的胰岛素、5至10-9M的地塞米松以及10ng/ml的FGF-2的DME/F12作为培养基。培养条件如下空气湿润，温度37℃，20％氧气和5％二氧化碳。培养时间是7天。用乙醇将细胞固定，用吉姆萨染液染色。然后拍摄培养皿。
结果指明在3种不同提取条件胰岛素+胶原酶不加牛血清，链霉蛋白酶+胶原酶加牛血清(FCS)，以及链霉蛋白酶+胶原酶不加牛血清，在培养一个星期之后观察到的细胞数目类似，正如其分化潜力类似一样。该实施例显示使用非提取来源的酶例如链霉蛋白酶和胶原酶的细胞提取技术的效率。
实施例2人血清的“补充”对人肌前体细胞扩增的影响在这个试验中人细胞源自正常个体的活组织切片检查。
如前述进行细胞提取。
在第一阶段，在有人血清(PAA实验室)存在的培养中扩大细胞，然后在所描述的不同条件下接种细胞。生长因子FGF2、EGF、PDGF A/B由Preprotech生产，而凝血酶从Sigma获得。
在细胞培养期间，使用如下物质-2个具有12个孔的多孔板(TPP)-牛明胶(Merck)-10,000细胞/孔-1ml培养基/孔以如下方式配制不同的培养基基本营养介质是DME，在其中加入如下物质-无补充物(0)
-1％人血清(1％HS)-5％人血清(5％HS)-混合物MFGF-2(10ng/ml)+胰岛素(10μg/ml)+PDGF(1ng/ml)+EGF(10ng/ml)地塞米松(5.10-9M)+凝血酶(1单位)-1％人血清(1％HS)+混合物M(1％HS+M)-5％人血清(1％HS)+混合物M(5％HS+M)-20％胎牛血清(20％FCS)值得注意的是，混合物M不含有动物来源的蛋白质。
在第一次的培养基更换的3天之后进行第二次更换。在培养3天后(总共7天)，进行固定和用吉姆萨染液着色。确定固定和着色的细胞数目。
结果(表示为细胞数目/孔)在下表中指出表1补充人血清(HS)对细胞生长的影响

根据这些结果，观察到生长因子的混合物与人血清的结合可以获得比不补充的胎牛血清的情况3倍多的生长。在这些条件下，扩增系数在生长一个星期之后超过30。令人惊讶的是，着重指出补充有混合物M的浓度为1％和5％的人血清有力地刺激细胞增殖，因为在这些低浓度上，与不补充的20％胎牛血清的情况相比分别观察到二倍和三倍的成肌细胞数目。最后，与不补充血清相比，补充有混合物M的血清增加了4倍的增殖。
实施例3在补充的胎牛血清存在的情况下改善肌细胞前体的生长潜力在这个试验中，细胞提取和扩增步骤类似前述。然而，所使用的培养参数确定如下选择正常人血清，在细胞提取后的第7传代获得。温度为37℃，在湿润空气中，20％氧气以及5％二氧化碳。细胞密度是103个细胞/培养皿。使用的底物是明胶。
作为生长期的培养基，对下述物质进行了试验-DME/F12，其中加入20％胎牛血清，-DME/F12，其中加入补充有血清(10ng/ml)、抗坏血酸维生素C(0.252mM)和FGF-2(10ng/ml)的20％胎牛血清，-PDGF(1ng/ml)，EGF(10ng/ml)、凝血酶(1单位)、LPA(5mM)。
生长期分别为10天和7天，每3天更换培养基。
在固定在乙醇中并用吉姆萨染液染色以后，拍摄培养皿的数字照片。
结果记录在下表2中。
表2补充的胎牛血清对细胞生长的影响

根据获得的结果，意外地观察到，与仅用胎牛血清相比，在加入上述混合剂以后人肌细胞的数目显著改善，因为经过仅7天生长期细胞的数目提高了5倍。
实施例4抗坏血酸和烟酰胺对扩增人肌前体细胞的影响在这个试验中人细胞源自16岁正常受治疗者的活体组织检查。
使用的提取程序和实施例1相同。在扩增步骤，遵循如在上述实施例中的程序，不同之处在于DME/F12补充有以下任何一种用作培养基2％人血清+混合物M(血清(10μg/ml)+地塞米松(5.10-9M)+FGF-2(10ng/ml)+EGF(10ng/ml)+凝血酶(1单位))(指定为2％HS+M)
表2此表说明了在根据TB诊断分组的患者中受HIV感染的人数(及占TB诊断组的百分比)及suPAR(中值，范围)。

实施例2在结核患者中，血清可溶性尿激酶受体的水平增加，预示了治疗期间的死亡率并可用于监测TB治疗的效果。
目标为了调查受结核分枝杆菌感染的个体在治疗期间的血清可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体(suPAR)的水平是否携含预后信息及是否可用于监测TB治疗的有效性。
设计用ELISA测量在登记时基于疑似为活动性结核而登记为一个群体的262人中及经8个月跟踪调查后的101人中的suPAR。此262人与实施例1中被调查的相同。
结果实施例5糖皮质激素对肌纤维前体细胞生长的特定影响使用在细胞提取后第23传代获得的大鼠细胞。保温温度为37℃，在湿润空气中，20％氧气和5％二氧化碳。细胞密度是3.103个细胞，为12的倍数。底物是明胶。
使用加入了胎牛血清并补充有胰岛素(10μg/ml)和FGF(10ng/ml)的DME/F12作为生长阶段的培养基。
将如下物质加入该培养基-增加浓度的地塞米松(10-6M至10-10M)-或单独或结合的类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮、DEHA、SDEAH、醛固酮)，如地塞米松和抗孕激素RU486，以固定浓度(10-7M)。
培养期为5天，不改变培养基。
在乙醇固定以及用吉姆萨染液染色后，拍摄数字照片。
结果示于图2A和图2B。
根据这些结果，可以看到加入地塞米松非常明显地改善细胞增殖并且其最佳浓度在10-6M和5.10-9M之间。此外，该糖皮质激素对于肌祖细胞生长的影响是明确的，而不像其他试验的类固醇激素，其并不改善生长。最后，抗孕激素如RU486的存在可消除糖皮质激素的影响。
实施例6人肌细胞前体的功能试验使用在提取后在第1传代的健康人细胞。细胞培养条件如下温度为37℃，湿润空气，20％氧气以及5％二氧化碳。细胞密度是103个细胞/培养皿，其来自100mm的肌肉组织。底物是明胶。在此实验中用于生长期的培养基是DME/F12，其中加入20％胎牛血清、10μg/ml人胰岛素、5.10-9M地塞米松、以及2.10ng/ml FGF。生长时间是9天，其中每3天变化培养基。然后，DME/F12用作分化培养基，其中加入2％人血清、10μg/ml胰岛素、10ng/ml EGF、以及5.10-9M甲状腺激素T3。分化时间是4天，其中每2天变化培养基。然后乙醇固定，以及用吉姆萨染液染色，接着拍摄皿的数字照片。
根据此实验，宏观观察使得可以计数107个集落。在后者之中，可以注意到两种类型的集落。第一类型的集落被强烈地染色而微观观测揭示存在许多分化的肌细胞，肌管这些是由肌前体形成的集落。第二类型的集落，在宏观观察下更淡，不含有肌管这些是非肌细胞集落。
结果如下在总计107个集落之中，有91个肌组织前体细胞集落以及16个非肌细胞集落。因此，总的说来，在接种的1000个细胞之中，10.7％的细胞能够形成集落而在后者之中85.6％能够形成肌组织前体细胞集落。
实施例7肌纤维前体细胞的遗传修饰为了遗传修饰前体细胞，我们使用莫洛尼型逆转录病毒(MMLV)，其中已插入为“绿色荧光蛋白质”(GFP)编码的序列。筛选-感染是按照本领域技术人员熟知的程序通过包装含有序列“gag”以及“pol”的质粒、含有VSVg包膜的质粒、以及含有GFP结构的质粒来进行。
使用在细胞提取后在第21传代获得的大鼠细胞。保温温度是37℃，在湿润空气下，并具有20％氧气以及5％二氧化碳。细胞密度是2.104个细胞/35mm培养皿。所使用的底物是明胶。
作为用于生长期的培养基，使用基础营养培养基DME/F12，其中加入补充以胰岛素(10μg/ml)、地塞米松(5.10-9M)、以及FGF(10ng/ml)的20％胎牛血清。
感染程序如下在接种细胞的次日，用病毒rMLV(VsVg)LTR-eGFP以8.3.106ip/mL的剂量对细胞进行感染。利用10个感染性颗粒/细胞进行感染(MOI)。
对于10mm培养皿，样品稀释在终体积为5mL的培养基中，该培养基包括-DMEM/F12-聚凝胺(polybrene)(8μg/ml)(帮助将DNA导入细胞的分子)-胰岛素(10μg/ml)
-FGF(10ng/ml)。
细胞在37℃保温6小时，然后用10mL的DME/F12更换培养基，其补充以20％FCS以及胰岛素(10ng/ml)、地塞米松(5.10-9M)以及FGF-2(10ng/ml)。
在第3天和第7天，借助荧光显微镜并通过微观照相术观察活细胞。计数成肌细胞、以及肌管，其显现绿色，因而已被病毒转染。
正如所预期的，非感染细胞并不呈现荧光而很大部分的细胞表达GFP，因而呈现绿色，在这些条件下90％以上的细胞表达GFP。GFP还正确表达在肌管中，其来自成肌细胞的融合。在这些条件下，可以遗传修饰成肌细胞，其是复制性细胞，以及肌管，其是分化的细胞，并且这种修饰是稳定的。培养传代并不改变表达GFP的细胞数目。在重新引入动物后，如此修饰的细胞表达GFP并因而可以被观察到。此工具对于分析重新引入动物后细胞的命运和功能是很重要的。
实施例8利用低浓度的人血清改善细胞冰冻技术使用的细胞来自年龄16岁的正常个体。对它们进行培养并在第7传代进行收获。
在培养期间，2％人血清(HS)用作培养基，其补充以10μg/ml胰岛素、0.252mM抗坏血酸、生长因子FGF(10ng/ml)、PDGF(1ng/ml)、EGF(1ng/ml)、以及凝血酶(1单位)和LPA(5mM)。
如在实施例1进行酶处理，其中使用胰蛋白酶-EDTA(PAALaboratories)作为酶。处理时间是10分钟。
与其底物分离后，细胞被放置在以下不同的冰冻培养基中，以105个细胞/ml的浓度单独的DME/F12培养基或DME/F12培养基补充以-90％FCS-10％FCS-10％HS-2％HS-5.10-9M地塞米松-10μg/ml胰岛素-0.252mM抗坏血酸-地塞米松+胰岛素+抗坏血酸(以上述浓度)-2％HS+5.10-9M地塞米松-2％HS+10μg/ml胰岛素-2％HS+0.252mM抗坏血酸-2％HS+地塞米松(5.10-9M)+胰岛素(10μg/ml)+抗坏血酸(0.252mM)
被加入10％DMSO(作为低温保存剂)和90％胎牛血清(FCS)的溶液。
在环境温度下10分钟以后，细胞被逐渐地冷却到-80℃。
融化是在37℃的恒温箱或水浴中进行。保存在液氮中的小瓶被放置在培养箱中。5分钟以后，融化的细胞被放置在10ml离心管中，其中存在补充以丙酮酸盐、抗生素如庆大霉素、以及保护因子如1mML-肉碱、10μg/ml胰岛素、5.10-9M地塞米松、0.252mM抗坏血酸的DME/F12。在环境温度和200g下进行离心作用10分钟。以12的倍数培养如此融化的细胞，其中明胶作为底物，而2％人血清(HS)，以及补充以胰岛素(10μg/ml)、抗坏血酸(0.252mM)、生长因子FGF2(10ng/ml)、PDGF(1ng/ml)、EGF(1ng/ml)、以及凝血酶(1单位)和LPA(5mM)的HS作为培养基。
培养两天后，利用新的多孔培养皿对培养基进行更换。在此阶段，在多孔培养皿对部分细胞进行染色。其他部分则经受另外4天的新的培养期以及新更换的培养基。两天后进行染色。
结果记录在以下的表4中
表4冰冻培养基的类型对细胞生长的影响(表示为细胞数目/孔)

这些结果证实，冰冻培养基必须含有血清或其部分如白蛋白以获得良好的细胞保存。其还意外地表明，不同添加剂如胰岛素、地塞米松、以及抗坏血酸的存在可以在有低浓度血清(尤其是人源)的情况下增加冰冻的有效性。通过这些方式，表明为了保存其后良好的细胞生长，可以通过降低血清浓度同时避免动物源的朊病毒和病毒的污染危险，可以对冰冻培养基进行优化。
实施例9选择和扩增来自活组织检查的肌祖细胞通过培养技术可以选择和扩增存在于生物样品中的肌祖细胞。从细胞的角度考虑，肌组织活组织检查是非常不均一的。对于细胞治疗以及对于药理学和毒理学应用这种不均一性都是不利条件。
所用技术是基于培养技术的结构，其分离肌祖细胞选择期和肌祖细胞扩增期。使用祖细胞选择培养基以及其后使用扩增培养基。
用于正选择肌祖细胞的培养基将抑制非肌细胞生长的制剂和刺激肌祖细胞生长的制剂结合起来。第一种制剂属于糖皮质激素族而第二种制剂是抗氧化剂和金属。在该选择期，在酶消化后来自肌活组织检查的细胞在有抑制剂和刺激剂的情况下以克隆密度(clonal density)进行培养。
扩增培养基含有生长因子，其可以促进所选择细胞的生长。这些因子属于FGFs族。在该扩增期，可以以低密度或以高密度对细胞进行培养。
在两个步骤中描述的程序可以获得富集95％以上的肌细胞群。
关于实施例6细胞以克隆密度进行接种。在这种类型的试验中，每个细胞产生细胞集落，并对其表型加以分析。
这些细胞来自没有肌病理特征的正常个体。细胞以250个细胞/100mm培养皿的克隆密度接种在10ml的培养基中。以下培养基用于第0天的选择期-DMFM/F12+FCS。
-DMEM/F12+FCS+FGF。
-DMEM/F12+FCS+胰岛素+地塞米松+硒蛋氨酸+抗坏血酸。
-DMEM/F12+FCS+FGF+胰岛素+地塞米松+硒蛋氨酸+抗坏血酸。
在第3天，对于此四个系列，培养基被换成以下相同的培养基DMEM/F12+FCS+FGF+胰岛素+地塞米松。
在此四个系列中在第6天和第10天更换培养基。在第14天培养基被换成允许肌细胞分化的培养基，其包括-DMEM/F12+1％FCS+胎球蛋白+胰岛素+EGF+T3。
-在第19天按照在实施例6中所述对细胞进行固定和染色。
获得的结果如下-在FCS中培养的细胞提供70个集落/皿，包括10％肌源集落。
-在FCS+FGF中培养的细胞提供70个集落/皿，包括0％肌源集落。
-在FCS+胰岛素+地塞米松+硒蛋氨酸+抗坏血酸中培养的细胞提供150个集落/皿，包括100％肌源集落。
-在FCS+FGF+胰岛素+地塞米松+硒蛋氨酸+抗坏血酸中培养的细胞提供80个集落/皿，包括50％肌源集落。
组合胰岛素、地塞米松、硒蛋氨酸、以及抗坏血酸的存在能够高效地选择肌祖细胞。
实施例10肌毒性的预见性细胞试验为了构造能够体外进行毒理学试验的细胞培养物，我们使用大鼠肌和脂肪细胞以便分析肌毒性的特异性。
实验条件如下细胞来源及其类型是大鼠(肌细胞)以及大鼠160mg(脂肪细胞)。它们的传代数目是P9和P4。培养条件是FCS+FGF+胰岛素+地塞米松。
用胰蛋白酶-EDTA(PAA)进行酶处理，处理时间是5分钟。
进行离心作用。
处理条件如下皿类型4个具有12孔的多孔平板(TPP)；底物明胶；密度5,000个细胞/孔，培养基是DME/F12+20％FCS+FGF+胰岛素+地塞米松+抑制素(浓度为0；0.1；0.5或1μM)。
浓度是FGF10ng/ml；胰岛素10μg/ml；地塞米松5.10-9M。
然后对如此培养两天的细胞进行固定、染色、以及分析。
该分析表明洛伐他汀对肌细胞的优先毒性。在0.5μM时，肌细胞的生长受到很大抑制，而脂肪细胞对它不敏感。图3示出了毒性试验结果的数字处理结果。
用人肌细胞再进行这些实验以便试验商用抑制素的毒性。
实验条件如下-皿的类型是两个具有96孔的多孔平板(TPP)-细胞密度是2,500个细胞/孔-培养基含有DME/F12+20％FCS+FGF+胰岛素+地塞米松+X。
X选自洛伐他汀，其浓度为0；0.01；0.05；0.1；0.5μM；或西伐他汀，其浓度为0；0.01；0.05；0.1；0.5；1μM；或托伐他汀，其浓度为0；0.01；0.05；0.1；0.5；1μM；或普伐他汀，其浓度为0；0.01；0.05；0.1；0.5；1μM；或氟伐他汀，其浓度为0；0.01；0.05；0.1；0.5；1μM；或辛伐他汀，其浓度为0；0.01；0.05；0.1；0.5；1μM。
试验程序如下在第一天改变培养基。在第三天进行着色。
总培养时间为5天。
在吸入培养基以后，用PBS洗涤细胞，然后用100％乙醇固定。10分钟以后，用水洗涤细胞，然后用10％吉姆萨溶液染色10分钟。最后步骤是用水进行洗涤。
用装备有数字照相机和自动载物台的倒置显微镜(Nikon)获得细胞图像。
数字数据处理提供在图4中。该图表明西立伐他汀的高毒性。后者分子证明在人临床应用中是毒性最大的抑制素。因而此试验可以揭示西立伐他汀对人肌细胞的优先毒性。
权利要求
1.一种细胞培养基组合物，包括(i)人源和/或动物源的血清和/或血清成分(ii)胰岛素或后者的衍生物(iii)选自抗氧剂类和/或维生素类的一种或多种化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，使用人血清。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，使用牛血清。
4.根据权利要求1所述的组合物，还包括一种或多种选自FGF型生长因子类的化合物。
5.根据前述权利要求所述的组合物，其中，所述FGF型生长因子类是由bFGF、FGF-2至FGF-10组成。
6.根据前述权利要求之一所述的组合物，其中，所述胰岛素衍生物是选自IGFs类以及钒酸盐型胰岛素模拟物类。
7.根据权利要求1-2和4-6中任一项所述的组合物，其中，以体积计，所述人血清浓度小于5％，优选在1％至3％之间。
8.根据前述权利要求之一所述的组合物，其还包括糖皮质激素。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述维生素为抗坏血酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述抗氧剂为N-乙酰基-半胱氨酸和/或硒。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包括脂多糖酸和/或所述EGFs类、heregulins类、凝血酶类、PDGF类、甲状腺激素类、以及LIF类中的一种或多种化合物。
12.一种用于祖细胞和/或干细胞培养的方法，其中，在所述细胞扩增步骤期间，将根据前述权利要求之一所述的组合物用作培养基。
13.根据前述权利要求所述的方法，其中，在所述细胞扩增步骤之前、之中、或之后进行细胞分化步骤。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所用的人血清是与所述祖细胞和/或干细胞自体的。
15.一种用于生产成肌细胞的方法，所述方法通过根据权利要求12至14之一所述的方法实施。
16.根据前述权利要求所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，所述祖细胞和/或干细胞是通过从肌肉组织中提取细胞的步骤而获得。
17.根据前述权利要求所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，所述提取步骤通过酶消化来实现。
18.根据权利要求15至17之一所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，将所得到的细胞进行采集和分离。
19.根据前述权利要求所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，所述细胞的采集和分离步骤通过酶消化、接着通过离心和/或过滤而实现。
20.根据权利要求15至19之一所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，对用于形成集落的成肌细胞的适应性进行功能性测试。
21.根据权利要求15至20之一所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，还进行表征步骤。
22.根据前述权利要求所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，使用细胞周期标记物。
23.根据权利要求15至20之一所述的用于生产成肌细胞的方法，其中，进行所述成肌细胞的冰冻步骤。
24.细胞群，包含在根据权利要求1至11之一所述的培养基中的祖细胞和/或干细胞和/或成肌细胞。
25.根据权利要求15至23之一所述的成肌细胞的应用，其中，所述产品用于细胞治疗。
26.根据前述权利要求所述的成肌细胞在制备用于小肌的功能性治疗的产品中的应用。
27.根据权利要求25所述的成肌细胞在制备用于尿失禁治疗的产品中的应用。
28.根据权利要求15至23之一所述的成肌细胞的应用，其中，所述产品用于基因治疗。
29.通过根据权利要求15至23之一的方法获得的所述成肌细胞在毒理学和/或药理学筛选中的应用。
30.根据前述权利要求所述的成肌细胞在用于检测一种或多种与横纹肌溶解症有关的物质中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种源自肌肉组织的祖细胞/干细胞的培养基组合物，其含有胰岛素的人源和/或动物源的血清和/或血清成分或其衍生物，以及一种或多种选自抗氧剂类和/或维生素类的化合物。本发明还涉及一种用于培养祖细胞/干细胞的方法、一种用于生产能够用作细胞/基因治疗产品的成肌细胞的方法。本发明的目的在于优化从祖细胞/干细胞生产成肌细胞。
文档编号A61P21/00GK1723277SQ200380105443
公开日2006年1月18日 申请日期2003年12月12日 优先权日2002年12月13日
发明者克里斯蒂安·潘塞 申请人:赛罗哥斯公司