专利名称：一种治疗缺血性脑中风的中药组合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及中药组合物的制备方法，具体地说是涉及一种治疗缺血性脑中风的中药组合物的制备方法。
背景技术：
脑中风是一种常见病和多发病，脑中风一般又分为出血性脑中风和缺血性脑中风，本申请涉及后者的治疗用中药组合物。
利用中医中药治疗缺血性脑中风在现有技术中已经有很多实例，目前应用于缺血性脑中风的口服中成药有通脉颗粒、脑络通胶囊等。通塞脉片原是一种治疗血栓闭塞性脉管炎的中药处方，全方由黄芪、党参、石斛、玄参、金银花、牛膝、当归、甘草等八味中药组成，具有培补气血、养阴清热、活血化瘀、通经活络等功效。该处方是南京中医药大学与江苏省中医研究院、江苏省中医院等单位于1962年开始，以中西医结合、辨证论治的方法，先后经过三次总结，以《四顾汤》为基础，经过二十余年临床与基础研究所取得的科研成果。1982年，“通塞脉片治疗血栓闭塞性脉管炎”通过省级鉴定；同年11月8日经江苏省卫生厅批准由江苏南星药业有限责任公司正式生产；1994年4月被列为国家中药二类保护品种。根据中医异病同治的原理，通塞脉片在临床应用过程又进一步拓宽了临床应用范围，可用于具有气血虚弱，阴血不足，瘀血症的多种疾病，如冠心病、心绞痛、脑动脉硬化的失眠、健忘、痴呆等症；也可用于慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝的康复治疗，高血压、高血脂等症的辅助治疗；还可用于中风及中风后遗症特别是脑出血半身不遂等。
通塞脉片为治疗血栓病的优良中成药，临床验证对血栓闭塞性脉管炎总有效率为97.8％，显效率为95.6％，并对脑血栓形成及其后遗症，闭塞性动脉硬化症，静脉血栓形成及糖尿病坏疽均有满意的疗效。长期的临床实践表明，通塞脉片是治疗心脑血管疾病的优良中成药，口服安全，方便。但该片剂主要活性部位群不明确，服用剂量偏大(一次4～5片，一日3次)，而且由于全浸膏片吸湿性较大而导致片剂的稳定性较差。因此，为了进一步阐明通塞脉片治疗缺血性脑中风的主要活性部位群，研制出有效部位群较为明确、服用剂量相对较小、制剂稳定性较好的中药新制剂，我们开展了以下研究。
发明内容
1.发明目的本发明的目的在于提供一种治疗缺血性脑中风的中药组合物的制备方法。
2.技术方案本发明人为了进一步探索通塞脉片处方治疗缺血性脑中风的作用机理，在分析原处方的组成及其配伍关系的基础上，并结合药物的药理研究，提出了将缺血性脑中风作用机理密切相关的黄芪、当归、玄参、金银花为基本组成药物，对其余的党参、牛膝、石斛、甘草四味药进行正交拆方加减试验，并以治疗缺血性脑中风作用机理相关的药效学试验进行验证，评价组方的合理性，而获得治疗缺血性脑中风的有效处方的原料为黄芪、当归、玄参、金银花、石斛和甘草六味药。
一种治疗缺血性脑中风的中药组合物的制备方法，以黄芪10～20g、当归10～18g、玄参8～10g、金银花8～15g、石斛8～15g、甘草6～10g为原料，其制备步骤如下。
(1)取当归10～18g进行二氧化碳超临界萃取，收集提取物，备用；(2)把当归二氧化碳萃取后的药渣与黄芪10～20g、玄参8～10g、金银花8～15g、石斛8～15g、甘草6～10g合并，进行乙醇提取，得到乙醇提取液；(3)用上述的乙醇提取液回收乙醇后的药液，浓缩，离心，水洗沉淀，洗液与滤液合并，弃去沉淀，上清液经大孔吸附树脂吸附后上柱后循环上样，用乙醇洗脱，得到乙醇洗脱液；(4)将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥后粉碎成干浸膏粉末；(5)最后将(1)、(4)两个步骤得到的组分合并，即得到本发明的中药组合物。
更具体地说，制备本发明中药组合物的方法是，以黄芪8g、玄参8g、金银花8g、石斛8g、甘草8g为原料，其步骤如下(1)取当归8g进行二氧化碳超临界萃取收集提取物，备用；(2)把当归的二氧化碳超临界萃取后的药渣与黄芪8g、玄参8g、金银花8g、石斛8g、甘草8g合并，用70％乙醇回流提取2次，50％乙醇回流提取1次，第1次8倍量，第2、3次6倍量，每次1h，三次醇提液合并，减压回收乙醇并薄膜浓缩至无醇味，得醇提液；(3)用上述的醇提液，浓缩，离心，弃去沉淀，上清液经SP-825型大孔吸附树脂吸附12h后上柱或上柱后循环上样4次，用60％乙醇依次洗脱；(4)将上述乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎得干浸膏粉末；(5)将(1)、(4)两个步骤得到的组分进行合并，即得到本发明的中药组合物。
上述步骤(1)当归的二氧化碳超临界萃取物为挥发性成分；步骤(4)的干浸膏中主要成分为总黄酮、总皂苷、黄芪甲苷、绿原酸、阿魏酸等。
本发明的中药组合物用常规的制剂方法，可以制成片剂、颗粒剂、微丸和胶囊剂等口服固体制剂。
3.有益效果(1)该组合物针对治疗缺血性脑中风，选取相应的药效学筛选模型和复方，精简处方，并进一步确定了组合物的主要部位为当归挥发性成分和全方混合提取液经大孔吸附树脂分离含有总皂苷、总黄酮、总酚酸等混合提取物，去除了金银花中挥发性成分和处方药物所含的多糖类成分以及其他水溶性杂质，极大地减少了服用剂量。
(2)采用CO2-SFE获得当归中挥发性活性成分，由于提取分离温度低，较好地保留了不稳定的活性成分，提高了疗效。
(3)采用大孔吸附树脂分离富集复方药物的有效部位群，方法简便，工业化生产的可行性较好。
(4)全方混合提取液经大孔吸附树脂分离含有总皂苷、总黄酮、总酚酸等混合提取物中部位组成基本明确且组成比例相对固定。组合提取物溶解性好、吸湿性小，便于制剂。
具体实施例方式
实施例1治疗缺血性脑中风的中药组合物的制备方法处方黄芪8g、当归8g、玄参8g、金银花8g、石斛8g、甘草8g制备方法步骤如下(1)取当归干燥，粉末20目，投入萃取釜、2个解析釜及罐分别进行加热或冷却，当萃取釜温度达到40℃，解析釜I的温度达到50℃，解析釜II的温度达到35℃时，打开CO2气瓶，当萃取釜压力达到20MPa，解析釜II的压力为6MPa时，开始循环萃取，CO2流量为18kg/h左右，萃取2h后从解析釜出料，收集提取物；(2)当归的二氧化碳萃取后的药渣与黄芪8g、玄参8g、金银花8g、石斛8g、甘草8g合并，用70％乙醇回流提取2次，50％乙醇回流提取1次，第1次8倍量，第2、3次6倍量，每次1h，三次醇提液合并，减压薄膜浓缩至无醇味；(3)用上述步骤2得到的醇提液去醇，浓缩，离心，弃去沉淀，上清液经SP-825型大孔吸附树脂吸附12h后上柱或上柱后循环上样4次，60％乙醇依次洗脱；
(4)将上述乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩(0.08MPa，60℃)，真空干燥(0.08MPa，70℃)，粉碎得浸膏粉末；(5)将(1)、(4)步骤得到的两个组合进行合并，即得到本发明的中药组合物。
实施例2、通塞脉组合物对电凝中动脉大鼠所致缺血性中风的治疗作用1.实验目的观察通塞脉组合物对电凝中动脉大鼠所致缺血性中风的治疗作用。
2.实验材料2.1动物SD大鼠，雄性，250-300g，购自南京医科大学动物中心。
2.2药物药物均密封，置阴凉干燥处保存，配制成液体后，置4℃保存。
通塞脉组合物由江苏南中医大药业有限责任公司提供，批号20030926，每克浸膏含生药10.43克，人日用生药量51.84克；通塞脉片浸膏由江苏南中医大药业有限责任公司提供，批号20030120，每克浸膏含生药6.67克，人日用生药量42.02克；阳性药组(尼莫地平片)由山西亚宝药业集团股份有限公司生产，批号030905，人日用生药量90-360毫克；2.3药物配制、剂量及分组通塞脉片组(1.69g浸膏量/kg·d)，通塞脉组合物高剂量组(2.66g浸膏量/kg·d)，通塞脉组合物中剂量组(1.33g浸膏量/kg·d)，通塞脉组合物低剂量组(0.44g浸膏量/kg·d)，阳性药组(尼莫地平片)(32mg/kg·d)上述各组药物均用蒸馏水配置成所需浓度。给药体积为1ml/100g。
3.方法与结果3.1取体重250～300g SD雄性大鼠160只，按Tamura等的方法[1]进行大鼠脑中动脉电凝术，各鼠以10％水合氯醛麻醉(4ml/kg，腹腔注射)，以侧卧位沿右外耳道与右眼外眦连线的中点，垂直于连线切开皮肤约2cm，逐层分离肌肉，除去硬脑膜，暴露中动脉，确认后电凝嗅束至大脑下静脉之间的一段大脑中动脉，逐层缝合伤口，注射5000单位/ml青霉素钠防止感染(3ml/kg，腹腔注射)，术后回笼饲养。观察术后4h、8h、24h对其行为评分的影响。评分标准①提鼠尾离地面约1尺，观察前肢情况。如两前肢对称地伸向地面，计为0分。如有左前肢出现腕屈曲、肘屈曲、肩内旋或三者都具有，分别评为1、2、3、4分。②将动物置平滑地板上，分别推左或右)肩向对侧移动，检查抵抗推动的阻力。正常大鼠双侧阻力对称。右肩向左侧移动时，发现阻力下降者，根据下降程度的不同(轻、中、重)，评为1、2、3分；③将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。正常大鼠两前肢肌张力对称。发生左前肢肌张力明显下降者，根据下降程度的轻重，评为1～3分。(4)动物无转圈者为0分，有向一侧转圈行为的计1分，有向一侧不停转圈者计2分。根据以上标准评分，满分12分，分数越高，说明动物的行为障碍越严重，取10分以上者进一步进行试验。将大鼠随机分为7组，分别为假手术组、通塞脉片组、模型组、阳性药组、通塞脉组合物高中低剂量组，每天给药二次，连续七天。
3.2颈动脉取血进行血流变学试验和血小板聚集试验。
取大鼠颈动脉血，置于肝素管和盛有3.8％枸橼酸钠的塑料试管中，进行血流变学试验和血小板聚集试验。
用肝素管取全血，取1.5ml左右用毛细滴管加入红细胞压积管中至上部的零刻度，静置1小时后，观察红细胞下降的长度(白细胞不计入)；红细胞压积参考文氏法，将测完血沉的红细胞压积管3000rpm离心30分钟，读取红细胞柱的高度。
另取全血0.8mL，在血液黏度测试仪上检测全血黏度，然后2000RPM离心10分钟取上清所得血浆检测血浆黏度。并用血浆在血凝测定仪上检测凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)。
以ADP为诱导剂，按比浊法测定血小板聚集率。全血与抗凝剂(3.8％枸橼酸钠)9∶1混匀，1000rpm离心8分钟，取得上层富血小板血浆(PRP)，余血再以3500rpm离心10分钟，得贫血小板血浆(PPP)，取250μlPRP置于比浊管内，37℃温育5分钟，随后在PRP中加入10μl的ADP(使其终浓度为10mmol/L)，在血小板聚集仪上检测最大聚集率。结果见表。
3.3随即将大鼠断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干后，冷冻十分钟，切成五片。第1刀在脑前极与视交叉连线中间；第2刀在视交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄与后叶尾极之间。然后迅速将脑片置于5ml含0.05％2，4，5-三苯基四氮唑(TTC)的PBS(10％)溶液中，37℃避光水浴温孵10min，经染色后，正常脑组织呈攻瑰红色，而梗塞组织呈白色，且界限分明。梗塞指数测定取出用滤纸吸干，按顺序平铺于黑纸上，拍照，打印，按以下公式计算梗塞指数。梗塞指数＝梗塞灶纸重(g)/梗塞侧脑纸重(g)，对所有数据使用Microsoft Excel软件进行数据处理，并统计分析结果。
3.4病理组织切片检查重复3.1试验，动物处死后，取其脑组织置于10％福尔马林内固定，常规取材、石蜡包埋，切片厚4～5μm，HE染色，病理专业人员阅片，根据病变轻重程度，依次半定量为“+”，“++”，“+++”，“++++”，无病变正常组织标记为“—”，又分别记分为1分，2分，3分，4分，0分，累加除血管增生、巨噬细胞增生外所有分数，得出总分。血管增生、巨噬细胞增生为损伤修复的表现，故从总分中减去，根据每例修正后的总分，计算出每组每只动物的均分(X±SD)，分值越高提示损伤越严重，反之则说明经药物处理后损伤减轻，治疗有效。取脑组织做病理切片后剩余部分，称重，以pH7.OPBS缓冲液制成10％匀浆，4℃3000r/min离心30min，取上清液检测NO、iNOS、总NOS、SOD、MDA等指标。
表1通塞脉组合物对电凝中动脉所致缺血性中风大鼠血液流变学的影响(X±SD)例数 全血粘度(mpa.s)组 别(只)200s-130s-15S-11S-1模型组 12 5.49±2.36 7.46±2.97 13.33±4.7831.44±10.735.38±9.24± 20.93±假手术组10 4.03±0.34*0.44**1.03**3.48**9.76±22.40±阳性药组11 4.13±0.35*5.56±0.49*1.18**3.94**4.22± 10.02±塞脉片组11 5.71+0.50 23.40±3.34*0.470.90*通塞脉组合物低剂4.33±11 5.77±0.63 9.98±1.29*22.54±4.26*量组0.54通塞脉组合物中剂11 4.37±0.45 5.88±0.55 10.26±1.1323.34±3.33*量组通塞脉组合物高剂4.34±22.90±11 5.90±0.54 10.15±0.87量组0.53 2.34**
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。与通塞脉片相比，#P＜0.05，##P＜0.01。下同。
表2通塞脉组合物对电凝中动脉所致缺血性中风大鼠血液流变学的影响(X±SD)组别例数 血浆粘度(mpa·s)血沉(mm) 压积(％)模型组121.43±0.19 0.83±0.49 41.42±5.21假手术组 101.39±0.10 1.05±0.72 37.3±3.23*阳性药组 111.47±0.09 1.41±1.87 38.73±2.76通塞脉片111.42±0.11 0.82±0.25 38.64±2.54组低剂量组 111.40±0.06 0.95±0.72 38.27±3.50中剂量组 111.47±0.11 1.77±1.78 38.91±4.37高剂量组 111.46±0.11 1.55±1.54 39±3.32与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3通塞脉组合物对电凝中动脉所致缺血性中风大鼠血液流变学的影响(X±SD)组别 例数PT(s) TT(s) APTT(s)模型组 12 19.94±1.60 30.90±4.64 19.72±2.85假手术组10 22.48±6.85 35.92±8.87 21.76±13.48阳性药组11 21.23±4.73 36.75±22.98±15.9512.56通塞脉片11 19.43±2.82 31.52±4.71 20.06±2.40组低剂量组11 17.82±1.97**30.12±3.76 18.87±2.63中剂量组11 18.53±2.07 31.92±6.53 19.26±2.90高剂量组11 23.11±12.4632.91±23.90±12.3410.22与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4通塞脉组合物对电凝中动脉所致缺血性中风血小板聚集试验的影响(X±SD)血小板最大聚集率组别例数 剂量(％)模型组 12 - -47.80±2.94假手术组 10 - -43.22±5.13*阳性药组 11 32mg/kg·d43.38±3.72*通塞脉片 11 1.69g/kg·d 46.22±6.13组低剂量组 11 0.44g/kg·d 40.66±3.93**中剂量组 11 1.33g/kg·d 38.15±3.55**高剂量组 11 2.66g/kg·d 37.56±5.39**与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
通塞脉组合物对全血粘度有较好的降低作用，对血小板聚集也有一定的抑制作用。说明其能使血瘀状态明显恢复，具有活血作用。对血浆粘度、血沉、压积及凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间测定(APTT)、凝血酶原时间测定(PT)的影响不大，表5通塞脉组合物对电凝中动脉所致缺血性中风梗塞指数的影响(X±SD)组别 例数 剂量 梗塞指数(％)模型组11 - 5.95±0.89假手术组 11 - 0阳性药组 10 32mg/kg·d4.09±0.85**通塞脉片组10 1.69g/kg·d 4.96±1.25低剂量组 8 0.44g/kg·d 5.17±0.99中剂量组 11 1.33g/kg·d 4.37±1.13**高剂量组 9 2.66g/kg·d 4.56±1.83*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
由表5结果显示，通塞脉组合物高剂量和中剂量组与模型组相比，梗塞指数有显著下降，与通塞脉片组比较无显著性差异。说明通塞脉组合物对大鼠缺血性中风有一定的治疗作用。
表6通塞脉组合物对电凝中动脉所致缺血性中风大鼠脑匀浆中递质的影响(X±SD)例NO(μ组别 MDA(nmol/mgprot) SOD(U/mgprot)数mol/gprot)模型组 9 3.05±1.90 3.09±1.28 21.16±2.52假手术组 111.15±1.14*1.63±1.11 24.81±3.60*阳性药组 101.31±0.92*2.52±1.44 22.68±3.49*通塞脉片组 8 2.15±1.86 1.76±0.46*21.92±1.56低剂量组 8 0.59±0.33*1.85±2.12 23.25±1.55中剂量组 121.66±1.66 2.79±2.12 24.88±4.53*高剂量组 9 1.18±1.00*3.20±0.88 26.89±1.54**与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
一氧化氮(NO)作为一种新的神经递质，由一氧化氮合酶(NOS)降解精氨酸产生，它具有极短的半衰期，通过弥散作用通透细胞膜，从胞内迅速弥散到胞外，广泛作用于神经元胞体、末梢、胶质细胞以及内皮细胞等，但过量和失调的一氧化氮合成则导致细胞损伤甚至死亡，当中枢神经系统缺血时，可引起神经损伤，从而诱发一氧化氮合酶(NOS)合成过量的一氧化氮，对中枢神经系统具有直接的神经毒性，为脑缺血迟发性神经细胞损伤的重要原因。从上表结果可以看出，通塞脉组合物能显著降低大鼠脑组织中因缺血而升高的NO含量，从而减轻NO的神经细胞毒性作用，保持NO在脑网络信息传递中发挥非传统的中枢信使作用。另在需氧生物体内，随时都有大量的超氧离子生成。超氧离子具有较高的化学活性，对生物细胞具有一定的毒性。它可与过氧化氢反应，生成毒性更强的羟基自由基(·OH)。超氧离子与羟基自由基进攻生物膜，可改变膜的结构和通透性；进攻染色体，可使染色体降解、断裂。它们还可攻击许多细胞内成分，使其失去生物活性和功能。氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid PUFA)引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物如醛基(MDA)、酮基、羟基以及新的氧自由基等。所以，如果生物体内或某一组织中超氧离子含量异常高，就会引起疾病，甚至死亡。SOD是催化超氧阴离子(O2-)歧化反应的酶类。它的存在与生物体内的解毒作用有关，SOD活力的高低间接反应了机体清除自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。从上表结果可以看出，通塞脉组合物能明显，增加超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)含量，对大鼠缺血性中风具有明显的治疗作用。
表7通塞脉组合物对电凝中动脉所致缺血性中风大鼠脑匀浆中递质的影响(X±SD)例 总组别INOS(U/mgprot)cNOS(U/mgprot)数 NOS(U/mgprot)模型组11 1.50±0.21 1.29±0.340.21±0.32假手术11 0.94± 0.63±0.13**0.31±0.20组 0.23**阳性药91.06±0.57 0.58±0.19**0.48±0.45组通塞脉11 0.92±0.58**0.48±0.16**0.44±0.52片组低剂量91.05±0.57 0.66±0.21**0.39±0.45组中剂量10 1.17±0.83 0.67±0.12**0.48±0.84组高剂量11 1.33±0.66*0.53±0.21**0.72±0.65**组与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
NOS有两种形式结构型NOS(constructive NOS，cNOS)和诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)。cNOS是NOS的生理存在形式，合成NO时间短、量少；iNOS在生理条件下水平很低，脑缺血状态下局部炎症细胞受各种因素刺激，iNOS大量表达、激活，可长时间大量释放NO，故成为脑缺血后神经细胞迟发性损伤的重要原因。在缺血区域的血管和浸润的中性粒细胞有诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，另外胶质细胞和巨噬细胞在脑缺血时也产生iNOS，由iNOS产生的NO及其副产物过氧化氮可以通过破坏神经元结构蛋白导致神经元死亡。另外神经元NOS(nNOS)产生的神经元NO可以促使谷氨酸介导的神经毒，从而引起神经细胞死亡。相比之下，内皮细胞NOS(eNOS)产生的NO对脑缺血有保护作用。实验发现，通塞脉组合物能上调鼠脑eNOS活性，下调iNOS和总NOS，改善神经功能，提示本药物可能通过保护脑血管病内皮，减轻脑缺血损害。
表8通塞脉组合物对缺血性中风大鼠大脑的影响组别大脑数(n) 大脑受损伤的程度分值模型组 8 3.38±1.77假手术组 8 0.63±0.52阳性药组 8 2.38±1.06通塞脉片组 8 2.50±1.38低剂量组 8 2.63±1.19中剂量组 8 2.50±1.07高剂量组 8 1.63±1.06病理组织学观察，模型组大鼠脑组织有不同程度坏死，坏死处胶质细胞有不同程度的增生，并见巨噬细胞增生、胶质小结形成，胶质细胞及间质水肿。阳性药及通塞脉组合物在不同程度上减轻脑组织损伤，其效果按递减次序依次为大剂量组，阳性药组，中剂量组，原剂型组、小剂量组。假手术组切片组织病理学改变不明显，模型组脑组织损伤程度最严重，说明通塞脉组合物对脑组织有保护作用。
4.结论从以上结果表明，通塞脉组合物对大鼠缺血性中风具有明显的治疗作用，能明显减少梗塞面积，增加超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，升高内皮型一氧化氮合酶(NOS)含量，降低诱导型一氧化氮合酶(NOS)含量。
病理组织学观察说明通塞脉组合物对脑组织有保护作用。
实施例3、通塞脉组合物对大脑中动脉栓塞模型大鼠的保护作用1.实验材料1.1药物及试剂同实施例2。
1.2实验动物清洁级雄性SD大鼠，体重240g～310g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。
2.统计方法实验数据表示成X±SD，计量资料用Student T检验比较统计学差异，行为分级组间比较用等级序值法(Ridit法)。
3.试验方法3.1实验方案采用颈内动脉栓线法制备该模型。采用Longa的方法加以改进，大鼠灌胃给药，连续5天，第五天给药后1h以10％水合氯醛麻醉(350mg/kg，ip)，仰位固定与手术台上，颈部正中切口，切开皮肤后，钝性分分离，找出颈总动脉(CCA)，继续向下分离并结扎颈外动脉(ECA)及颈外动脉各分支(枕动脉、甲状腺上动脉、舌动脉和面动脉)，轻轻剥离迷走神经，分离出颈内动脉(ICA)和翼腭动脉，ECA近心端备线，用动脉夹夹闭ICA和CCA，在ECA距ICA2mm处剪一小口，将一尼龙线(直径0.24mm，头端经明火处理，使其熔成光滑的球状)插入ECA并进入CCA，轻扎备线，防止出血，剪断ECA，松开ICA的动脉夹，牵引ECA，使其和ICA约成一直线，轻轻回抽尼龙线，使其顺入ICA，继续向下推进(注意避免尼龙线进入翼腭动脉，直至有轻微阻力。此时可见ICA伸展，尼龙线插入深度约为18mm，表明尼龙线已经穿过大脑中动脉(MCA)起始段，到达大脑前动脉(ACA)近端，阻断了MCA的所有血供来源，包括来自ICA和ACA及大脑后动脉的血液供应。松开CCA动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤，回笼饲养。
缺血3h后再灌注，再灌注时轻拉尼龙线，使尼龙线拔出颅外，血流再通，修剪尼龙线，缝合皮肤，回笼自然喂养。以上过程均在室温恒定(24～25℃)情况下进行，以利于评价脑缺血情况。观察对大鼠局灶性脑缺血行为评分和脑梗塞面积的影响。以上过程均在室温恒定(24～25℃)情况下进行，以利于评价脑缺血情况。观察对大鼠局灶性脑缺血行为评分和脑梗塞面积的影响。
3.2大鼠实验性脑缺血行为评分法参考Bederson等的方法对术后动物的行为缺陷进行分级评分，分级标准如下动物症状 等级提尾悬空时，动物的两前肢均伸向地板方向且无其他行缺陷0级提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、 1级肘外展、紧贴胸壁将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时阻力降低2级动物自由行走时，向手术对侧环转或转圈 3级等级分数越高，表明动物的行为缺陷越严重。
3.3 TTC染色测量脑梗塞面积TTC染色测量脑梗塞面积[3]MCAO后24小时断头取脑，将脑置冰冷的生理盐水中(2～3℃)10min，去除嗅球、小脑和低位脑干后，用生理盐水冲洗大脑使表面不留血污，吸干周围水分后，沿冠状切四刀，切成五片。第一刀在脑前极与视交叉连线中间；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。然后迅速将脑片置5ml含有1％TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30分钟，其中每隔7～8分钟翻动一次，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，且界限分明。温孵完毕后将脑片照相，剪下红白颜色区称重计算之。然后根据重量求面积法，分别计算出五个脑片共10个平面的总面积和梗塞区域的面积，求出梗塞区面积占半球总面积的百分比，即梗塞率。
3.4脑含水量的测定动物处死后，取出大脑称湿重后将脑组织置于115℃电热干燥箱中烘至恒重，称干重，按下列公式计算脑含水量含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％
脑指数＝(脑湿重/体重)×1003.5血浆6-KPGF1α、TXB2、ET含量测定颈动脉放血，消炎痛-EDTA.Na抗凝，同时加入适量抑肽酶，3000转/min离心分离血浆，置-20℃保存。测试时用解放军总医院科技开发中心放免所提供的试剂盒(生产日期为2004年4月23日，测试日期为04年5月9日)，由南京市第一医院放免测试中心进行检测，仪器为芬兰产Wizard 1470γ计数仪。
3.6动物分组及给药大鼠随机分为7组，即假手术组，尼莫地平组，模型组通塞脉高、中、低剂量和通塞脉片组。每组10只，灌胃给药，连续5天，第5天进行手术，术后30min再给药一次。
3.7组织病理切片重复3.1试验，动物处死后，取其脑组织置于10％福尔马林内固定，常规取材、石蜡包埋，切片厚4～5μm，HE染色，病理专业人员阅片，根据病变轻重程度，依次半定量为“+”，“++”，“+++”，“++++”，无病变正常组织标记为“—”，又分别记分为1分，2分，3分，4分，0分，累加所有分数，得出总分，计算出每组每只动物的均分(X±SD)，分值越高提示损伤越严重，反之则说明经药物处理后损伤减轻，治疗有效。
4.结果4.1行为学评分4h和24h时，所有试验动物均出现了不同程度的神经功能障碍。4h时，各给药组动物的行为学得分与模型组比较差异无显著性(P＜0.05＝；在24h后，通塞脉组合物各剂量组动物的行为学评分均呈下降趋势，且显著低于模型组，经统计学处理，差异有显著性(P＜0.05，P＜0.01＝，见表9。提示通塞脉组合物可以改善模型动物的行为学障碍。
表9通塞脉组合物对对局灶性脑缺血再灌注大鼠的行为学评分的影响剂量 行为学评分组别 例数(g/1000g)4h 24h模型 10 - 2.6±0.522.5±0.53假手术 10 - 0 0尼莫地平102×10-32.6±0.521.8±0.79*通塞脉片10 2 2.6±0.521.9±0.88通塞脉组合物低 10 2 2.6±0.521.8±0.79*通塞脉组合物中 10 1 2.6±0.521.7±0.82*通塞脉组合物高 10 0.52.5±0.531.4±0.52**
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
4.2对脑梗塞面积和梗塞率的影响各给药组大鼠的脑梗塞面积和梗塞率均明显低于模型组，经统计学处理，差异有显著性(P＜0.05～P＜0.01＝，见表10。提示通塞脉组合物可以明显缩小模型大鼠的脑梗塞面积，降低梗塞率。
4.3对脑含水量和脑指数的影响模型大鼠脑指数和含水量均明显高于假手术组，通塞脉组合物高剂量可降低模型大鼠的脑指数，高、中剂量均可降低模型动物的脑含水量，与模型组比较，差异均有显著性(P＜0.05 P＜0.01)，见表3。提示通塞脉组合物可以降低缺血脑组织的含水量，减轻脑水肿。
表10.对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗塞面积及梗塞率的影响(X±SD)剂量 梗塞面积 抑制率组别 例数 梗塞率(％)(g/kg) (cm2)(％)模型 10- 3.08±1.41 26.38±11.36假手术 10- 0 0尼莫地平 10 2×10-31.35± 1.52*11.87±13.08*55.00通塞脉片 102 1.36±1.61*12.03±14.33*54.38通塞脉组合物 102 1.43±1.54*12.10±12.51*54.15低通塞脉组合物 101 1.31±1.35*11.81±12.20*55.24中通塞脉组合物 100.5 0.47±0.53**4.44±4.54**83.16高注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表11.对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑指数及脑含水量的影响(X±SD)组别 例数 剂量(g/kg) 脑指数 含水量(％)模型 10 - 0.530±0.01180.46±1.19假手术 10 - 0.470±0.037**78.38±0.90*尼莫地平 102×10-30.496±0.029*79.04±1.45*通塞脉片 10 2 0.501±0.05179.21±1.40通塞脉组合物 10 0.50.508±0.04479.28±1.63低通塞脉组合物 10 1 0.522±0.02979.16±1.52*中通塞脉组合物 10 2 0.486±0.045*79.08±1.21*高注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
4.4对血浆6-K-PGF1α、TXB2、ET含量的影响局灶性脑缺血再灌注模型大鼠血浆中TXB2、ET含量明显升高，与假手术组比较差异有显著性(P＜0.05＝；除尼莫地平外，各给药组血浆TXB2、ET含量均有下降的趋势，其中中、高剂组可降低血浆中TXB2的含量，中剂量和原剂型组可降低血浆中ET的含量，与模型组比较差异均有显著性(P＜0.05＝，见表12。
表12对局灶性脑缺血再灌注大鼠血浆6-K-PGF1α、TXB2、ET含量的影响(X±S)例 剂量组别 6-K-PGF1α、TXB2、 ET数 (g/kg)模型10- 800.38±462.47 821.58±453.83 46.25±11.43317.29±假手术 10- 611.59±416.13 33.19±12.73*260.24**尼莫地平 10 2×10-3668.84±393.36 749.62±698.24 44.02±16.22通塞脉102 1008.88±369.61 716.74±450.90 34.09±13.09*片通塞脉低 10 0.5 780.03±426.85 484.79±531.58 35.80±18.48通塞脉中 101 900.48±411.69 362.64±220.31*28.99±15.95*通塞脉高 102 660.06±333.02 370.52±315.76*35.64±17.76PGI1、TXA2对血小板及血管功能的调节具有重要的意义，TXA2主要在血小板微粒体内合成，具有很强的血管收缩及促进血小板聚集作用。PGI1由血管内皮细胞合成，可舒张血管，抑制血小板聚集。正常情况下，两者保持动态平衡对维持血管的正常功能、调节血流量具有重要的意义，病理状态下两者平衡失调是造成血小板聚集、血栓形成及血管痉挛的重要原因。TXA2生物半衰期约30秒，迅速代谢成无活性的TXB2；PGI1生物半衰期约3分钟，代谢成6-K-PGF1α。由于PGI1和TXA2性质不稳定，难以直接测定，故国内外均测定6-K-PGF1α和TXB2作为判断PGI1和TXA2浓度的指标。ET是广泛分布于心血管系统的一种调节肽和生长因子，是目前已知引起血管收缩的最强及最持久的体液因子，由血管内皮细胞分泌，参与血流的调节。临床及实验研究表明，脑缺血时ET分泌增加。本实验显示各给药组血浆TXB2、ET含量均有下降的趋势，其中中、高剂组可降低血浆中TXB2的含量，中剂量和原剂型组可降低血浆中ET的含量，与模型组比较差异均有显著性。
表13通塞脉组合物对缺血性中风大鼠大脑的影响组别 大脑数(n)大脑受损伤的程度分值模型组 6 5.8±0.4假手术组 6 0.4±0.54阳性药组 5 2.6±1.82通塞脉片组 5 3.8±2.17低剂量组 6 3.17±2.04中剂量组 5 2.2±1.64高剂量组 6 2.33±2.9病理组织学观察，线栓法缺血性中风大鼠模型，表现为脑组织不同程度坏死，胶质细胞及间质水肿。阳性药及通塞脉组合物对脑中风模型在不同程度上有减轻脑组织损伤作用，其效果按递减次序依次为通塞脉组合物大剂量组，中剂量组，阳性药组，小剂量组。假手术组组织病理学改变不明显，原剂型组脑组织损伤程度比模型组轻，但较其他组别为重。
5.结论从以上结果表明，通塞脉组合物可以改善模型动物的行为学障碍，可以明显缩小模型大鼠的脑梗塞面积，降低梗塞率；降低缺血脑组织的含水量，减轻脑水肿。各给药组血浆TXB2、ET含量均有下降的趋势，其中中、高剂组可降低血浆中TXB2的含量，中剂量和原剂型组可降低血浆中ET的含量，与模型组比较差异均有显著性。病理组织学观察，线栓法缺血性中风大鼠模型，表现为脑组织不同程度坏死，胶质细胞及间质水肿。阳性药及通塞脉组合物对脑中风模型在不同程度上有减轻脑组织损伤作用，其效果按递减次序依次为通塞脉组合物大剂量组，中剂量组，阳性药组，小剂量组。假手术组组织病理学改变不明显，原剂型组脑组织损伤程度比模型组轻，但较其他组别为重。
实施例4、通塞脉组合物浸膏对大鼠体内血栓的影响[实验目的]结扎下腔静脉后，造成血管壁损伤，血流阻断，形成下腔静脉血栓，观察通塞脉组合物浸膏对血栓长度、重量的影响。
1.动物健康SD大鼠，300g左右，雌雄各半，购自南京医科大学实验动物中心。生产许可证号(SCXK)2002-0031。
2.药物通塞脉组合物浸膏，南京中医药大学新药及海洋药物研究中心制剂研究室提供，临床人用量51.84g/日，每克浸膏相当于生药量7.92g。南中医大药业股份有限公司提供。
通塞脉原剂型，临床人用量6.3g浸膏/日，每克浸膏相当于生药量6.67g。南中医大药业股份有限公司提供。
戊巴比妥钠中国医药集团上海化学试剂公司进分，批号F20020405。
3.器材手术器械若干套。
取健康SD大鼠72只，随机分成6组，每组12只。模型组(等量蒸馏水)，阳性药组(尼莫地平g/kg·d)，通塞脉组合物浸膏大、中、小三个剂量组(2.679g/kg·d、1.3395g/kg·d、0.4465g/kg·d)。
给药方式为灌胃给药，每日一次，共给药10天。末次给药前一天禁食。末次给药后1小时，大鼠以戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定后腹部消毒，从腹中线打开腹腔，暴露并分离下腔静脉，在左肾静脉下方水平处结扎，并缝合腹腔。结扎2小时后，重新打开腹腔，在结扎下方2cm处用止血钳夹住下腔静脉，取出此段血管，迅速纵行剖开官腔，在滤纸上取出血栓，蘸干多余血迹，称量湿重。然后放入37℃烘箱干燥24小时。称量干重。
获得的数据采用EXCEL软件进行F检验和T检验。
通塞脉组合物浸膏对结扎损伤管壁造成的下腔静脉血栓形成有一定的抑制作用，见表14。
表14.通塞脉组合物浸膏对大鼠下腔静脉血栓的影响(X±SD)组别 剂量(g/kg.d)例数 血栓长度(mm) 血栓湿重(mg) 血栓干重(mg)模型组-11 10.89±3.9734.45±13.73 9.55±2.54阳性药 0.032 12 6.12±4.61*14.58±13.03**4.67±4.66**原剂型 11 8.60±2.84 24.18±8.33*7.36±2.25*小剂量 27.77 12 8.56±3.50 19.33±11.22**6.58±3.94*中剂量 13.89 11 7.27±2.62*19.27±7.50**6.73±2.69*大剂量 4.63 12 7.12±3.74*17.08±7.13**#6.00±3.36**与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。与原剂型相比，#P＜0.05。
通塞脉组合物浸膏对结扎损伤管壁造成的下腔静脉血栓形成有一定的抑制作用。
实施例5、通塞脉组合物对胶原蛋白-肾上腺素诱发的小鼠体内血栓形成的影响[实验目的]胶原蛋白和肾上腺素都是血小板聚集诱导剂，小鼠静脉注射等诱发体内肺拴塞，血栓形成，导致偏瘫和死亡，观察通塞脉组合物浸膏对其影响。
1.动物ICR小鼠，18-22g，雌雄各半，购自南京医科大学实验动物中心。生产许可证号(SCXK)2002-0031。
2.药物和试剂通塞脉组合物，南京中医药大学新药及海洋药物研究中心制剂研究室提供，临床人用量51.84g生药/日，每克浸膏相当于生药量10.43g。
通塞脉原剂型，临床人用量6.3g浸膏/日，每克浸膏相当于生药量6.67g。南中医大药业股份有限公司提供。批号阿斯匹林，湖南制药厂，批号990402。
肾上腺素注射液，1mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0306031。
II型胶原蛋白，Sigma公司生产，北京邦定泰克生物技术公司分装。
3.器材小鼠固定器，1ml注射器。
取小鼠144只，随机分为6组，每组24只，雌雄各半模型组(蒸馏水10ml/kg·d)，通塞脉原剂型组(16.39g生药/kg·d)，阳性药组(阿斯匹林50mg/kg·d)，通塞脉组合物大、中、小三个剂量组(40.08、20.04、6.68g生药/kg·d)。连续灌胃7天，灌胃体积为10ml/kg。末次给药后1h，尾静脉注射肾上腺素-胶原蛋白混和液0.1ml/10g体重。观察小鼠5分钟内死亡率。结果采用卡方检验，比较组间差异。
附胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂的配制称取胶原蛋白30mg，浸泡于3-4ml生理盐水中2小时以上，匀浆，加生理盐水40ml，3000rpm离心10分钟，取上清，另加入肾上腺素1ml，加入生理盐水至50ml即成。
通塞脉组合物浸膏对结扎损伤管壁造成的下腔静脉血栓的抑制作用，见表15；表15通塞脉对胶原蛋白-肾上腺素所致小鼠体内血栓的影响(X±SD)组别 剂量(g/kg.d)例数 5’内小鼠死亡数 5’内小鼠死亡率(％)模型组 - 24 16 66.67阳性药0.05 21 2 9.52**原剂型16.3922 7 39.13*大剂量40.0823 11 47.83中剂量20.0423 7 30.43**小剂量6.68 21 11 47.62与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
通塞脉组合物对胶原蛋白-肾上腺素所引起的小鼠体内血小板聚集有抑制作用，从而抑制其体内血栓的形成。
权利要求
1.一种治疗缺血性脑中风的中药组合物的制备方法，以黄芪10～20g、当归10～18g、玄参8～10g、金银花8～15g、石斛8～15g、甘草6～10g为原料，其制备步骤如下(1)取当归10～18g进行二氧化碳超临界流体萃取，收集萃取物；(2)当归二氧化碳萃取后的药渣与黄芪10～20g、玄参8～10g、金银花8～10g、石斛8～15g、甘草6～10g合并，进行乙醇提取，得到乙醇提取液；(3)用上述乙醇提取液减压回收乙醇后的药液、浓缩离心、水洗沉淀、洗液与滤液合并，弃去沉淀，上清液经大孔吸附树脂吸附后，用乙醇洗脱得到乙醇洗脱液；(4)将乙醇洗脱液减压回收乙醇，浓缩，干燥后粉碎得干浸膏粉末；(5)将上述步骤(1)、(4)得到的组分合并，即得到本发明的中药组合物。
2.根据权利要求1所述的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤(2)中先用70％乙醇回流提取2次，后用50％乙醇回流提取1次，第1次8倍量，第2、3次6倍量，每次提取1h。
3.根据权利要求1所述的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤(3)中清液经SP-825型大孔吸附树脂吸附12h后上柱或上柱后循环上样4次，用60％乙醇依次洗脱。
4.根据权利要求1所述的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤(4)中的干燥方法为喷雾干燥或真空干燥。
5.根据权利要求1的中药组合物可制成片剂、颗粒剂、微丸、胶囊剂。
全文摘要
本发明公开了一种治疗缺血性脑中风的中药组合物的制备方法，其步骤为(1)取当归二氧化碳超临界流水萃取物；(2)把当归药渣与黄芪、玄参、金银花、石斛、甘草合并进行乙醇提取得醇提液；(3)将醇提液减压回收乙醇、浓缩、离心、水洗沉淀，弃去沉淀，上清液经大孔吸附树脂吸附后上柱或循环上样，用乙醇洗脱得洗脱液；(4)将洗脱液减压回收乙醇、浓缩、干燥后粉碎成干浸膏粉末；(5)再将(1)、(4)两个组分合并，即得中药组合物。该制法的优点是克服了原工艺水提醇沉难以保留当归挥发性成分的缺陷；采用大孔树脂分离较好地富集了主要活性成分，提高了疗效，减少了服用量，中间提取物的溶解性好，吸湿性小，便于制剂。
文档编号A61K9/48GK1615994SQ20041006478
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月28日 优先权日2004年9月28日
发明者蔡宝昌, 狄留庆, 陈涤平, 陆茵, 吴皓, 李伟, 李伟东, 李吉峰 申请人:南京中医药大学