专利名称：多孔基质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多孔基质。更具体地说，本发明涉及预计用于动物体并在靶组织部位原位形成的多孔基质。
许多专利申请描述了凝胶或溶胶特别是水凝胶用作组织支架的用途。例如，WO00/23054描述了聚乙烯醇微球在血管阻塞或栓塞中的用途。WO 99/15211和WO00/64977描述了水凝胶作为组织支架的用途。水凝胶被植入病人体内，以便支撑组织的生长或修复。
水凝胶用作组织支架的难题在于，尽管凝胶自身可以适当填充其所插入的洞，但是它们的扩散性差，并且供给组织的药物、营养物或其它因子同样不能通过凝胶进行适当扩散。此问题在凝胶与活细胞一起播种(seed)的情形中尤为严重，这是因为营养物的较差扩散性导致细胞死亡过早，从而无法进行治疗。有关凝胶支架的另一个问题是，用于稳定或固化凝胶(尤其是原位)的交联法，能够损坏截留细胞。
基于水溶性聚合物的支架在本领域内也是公知的，例如WO 99/25391描述了聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)用作组织尤其是骨组织再生的聚合物支架。对聚合物进行处理，以便形成多孔结构。与水凝胶一样，这些水溶性聚合物被植入病人体内，以便支撑组织生长或修复。
然而，这些水溶性聚合物的缺陷是，它们仅能填充具有开放形状的洞，并且材料的成型方法也待优选。此外，在支架与细胞一起播种的情形中，播种没有效果(仅有少数孔被细胞填充)，或者是细胞在播种过程中被结构损坏，而周围的组织细胞也可被植入过程损坏。
WO 99/11196描述了微粒基质作为组织支架的用途，这些颗粒具有用于稳定颗粒结构的内部交联性。
同样，PCT/GB02/02813描述了一种以药物的形式在体内用于靶组织内或靶组织上的微粒材料的开放多孔基质，所述基质包括彼此交联以便在二者之间限定出孔的颗粒。
本发明提供了一种多孔基质的生产工艺，所述工艺包括如下步骤-使第一相成为流体状态，-将第二相引入第一相，-使第一相和第二相混合，以确保第二相通过第一相实现所需的分布，以及-使第一相固化或改变状态，而第二相就在其中。
有益的是，此工艺使基质在插入靶细织内或靶组织上之前成型或部分成型。
此处所用的术语“流体”是指任何流动的物质，并因此包括能够流动并顺应容器外形的液体、气体和固体(例如粉状、粒状或谷粒形式、或塑料固体)。
此处所用的术语“固化”是指相变为固态或半固态。
第一相可以是载体相，其中这个相承载或包含第二相的材料，或者可以是包被第二相材料的包被相。优选的是，第一相不是液态或完全液化态的，但却是流动的，足以混合、承载或包被第二相。例如，第一相可以流动但有些粘稠并包被第二相的微粒材料。或者是，第一相和第二相可以是微粒或粉末形式并混合在一起。在这种情形下，还期望第一相有些软或粘稠或同样能够包被第二相的任何微粒材料。
优选的是，在一个参数例如温度、pH、交联、硬化或胶凝剂的引入、光线的存在/缺乏、紫外熟化改变时或者在厌氧条件下，第一相从流态转变为固态或半固态。最优选的是，第一相由于温度、pH的改变或交联、硬化或胶凝剂的引入而发生变形。在采用温度的情形中，优选的是，温度足以使相工作但却不破坏周围的组织。烧结步骤的预先使用可应用到任一相中。第二相优选是固相，但也可采用液相，尤其是在液体是微粒材料的乳液或悬浮液时。在多孔基质用作组织支架基质的情形中，第二相任选地包含用于形成新组织的细胞。
然而，本发明人已经发现，基质在无需引入细胞的前提下也可用作组织支架。当组织支架(没有细胞)置于所需部位处或部位上时，局部的内源性细胞就在导致现存组织发生新的生长的支架内或围绕该支架生长。此效果由于支架现存的适当生长因子的存在而得以增强。这样的情形特别有用，因为新的组织与引入非内源性组织相比，几乎没有排斥的机会或其它免疫反应。因此，用免疫抑制剂治疗病人的需要减少了，与此有关的问题也减少了。此外，此技术对于已经免疫妥协的病人(例如癌症病人、非常年青的人、年长的人、孕妇或患有艾滋病或乙肝的人)是有用的。
据此，本发明还提供了一种组织支架基质，这种基质包括第一相和包含在第一相之内的第二相。优选的是，组织支架基质按照上述方法来制备。
本发明中所用的第一相和第二相可以用具有不同的固化或硬化特性的相似材料来制备。例如，第一相和第二相可以用具有不同的胶凝pHs或不同熔融温度或玻璃化点的相似聚合物来制备。
通常，本发明的一个或两个相包括一种或多种聚合物。可用于本发明的合成聚合物的实例包括聚(α-羟基酸)特别是聚乳酸或聚乙醇酸、聚交酯聚乙交酯共聚物、聚交酯聚乙二醇(PEG)共聚物；其它的聚酯，包括聚(ε-己内酯)、聚(3-羟丁酸酯)、聚(s-己酸)、聚(p-二噁酮(dioxanone))和聚(丙烯富马酸酯)；聚(原酸酯)，包括多羟基/双烯酮乙缩醛(polyol/diketene acetals)加成聚合物(如Heller ACSSymposium Series 567，292-305，1994所述)；聚酐，包括聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基双羧苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)、聚[双(对-羧苯氧基)甲烷](PCPM)以及SA、CPP和CPM的共聚物(如Tamada and Langer in Journal of Biomaterials SciencePolymer Edition，3，315-353，1992和Domb in Chapter 8 of the Handbook ofBiodegradable Polymers，ed.Domb A.J.and Wiseman R.M.，Harwood AcademicPublishers所述)；聚(氨基酸)；聚(假氨基酸)(包括James andKohn at pages 389-403of Controlled Drug Delivery Challenges and Strategies，American Chemical Society，Washington DC所述的那些)；聚磷腈，包括聚[(二氯)磷腈]、聚[(有机)磷腈]聚合物的衍生物(如Schacht in Biotechnology and Bioengineering，52，102-108，1996所述)；聚磷酸酯；聚乙二醇聚丙烯嵌段共聚物(例如以PluronicsTM为商品名所出售的)。
也可以采用天然聚合物，例如丝绸、弹性蛋白、壳质、脱乙酰的甲壳质(chitosan)、纤维蛋白、纤维蛋白原、聚糖(包括胶质)、和藻酸酯、胶原质、聚(氨基酸)、肽、多肽或蛋白质。
也可以采用由这些聚合物的单体制备的共聚物，诸如可以将这些聚合物随机掺和或者将它们混合或组合。
聚合物可以用各种方法进行交联，这些方法包括诸如丙烯酸酯聚合物的UV交联、硫醇盐或丙烯酸酯聚合物的Michael加成反应、经由乙烯基砜交联的硫醇盐聚合物、经由琥珀酸酯或乙烯基砜的交联、经由肼的交联、热诱导的冻结、酶交联(例如凝血酶与纤维蛋白原的加成)、经由盐或离子(特别是Ca2+离子)加成的交联、经由异氰酸酯(诸如1，6-己二异氰酸酯)的交联。
在一个优选实施例中，采用聚(乳-共-聚乙醇)酸(PLGA)的聚酯。这些聚合物是由FDA批准用于胃肠外施用的。因为PLGA在初始阶段经由非酶水解而发生降解，所以由体外数据能够预测体内降解速率。PLGA降解为乳酸和乙醇酸，这些都是在体内天然发现的物质。
然而，聚酯可具有为一些实施例选择的聚合物系统。当聚酯材料断裂成分子量为约5000道尔顿时，材料就可以被细胞(包括巨噬细胞)摄取，因此一些感染与这些聚合物的断裂有关。
可以合成与氨基酸的共聚物，例如乙醇酸与甘氨酸，或乳酸与赖氨酸(Barrera等人的(1993)J Am Chem Soc 115，11010-11011和Cook等人的(1997)J Biomed MatRes 35，513-523)。这些可用于固定其它分子，诸如经由赖氨酰s-氨基部分。这些聚合物利用共价键，可用来将肽附着到表面上。例如，利用1，1’-羰基-二咪唑(CDI，Aldrich)作为交联剂，可以将肽附着到聚(乳酸-共-赖氨酸)上。
通过操纵乳酸和乙醇酸的摩尔比以及共聚物的分子量，能够获得不同的降解图形。聚-L-交酯在体外具有数月至数年的降解时间。这样长的降解时间是由于聚合物的高结晶度保护其避免被水渗透。聚乙交酯具有一至数月的降解时间，而聚-D，L-交酯是非晶形的，并具有一至数月的降解时间。D、L、PLGA在体外具有数周至数月的降解时间。当乙醇酸的比例增大时，降解速率就增大。S-己酸的均聚物在2-3年的植入周期中仍然能够保持完整无缺。
优选的是，至少其中一个相还包括增塑剂，所述增塑剂的例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、这些聚合物的聚己内酯低分子量低聚物或常规增塑剂，例如专用于日用塑料材料的那些增塑剂，包括(但不限于)己二酸酯、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、sabacates、壬二酸酯和柠檬酸酯。也可采用与用来形成第一和第二相的聚合物(例如聚交酯、交酯-共-乙交酯)相同的增塑剂。
第二相通常包括播种或形成组织支架所必需的组织细胞。这些细胞可播种到包括、包含或承载在第二相内部的微粒材料内。
在本发明的组织支架中可采用任何动物细胞。可使用的细胞的实例包括(但不限于)骨、骨先祖细胞(诸如来自于骨)、软骨、肌肉、肝、肾、皮肤、内皮细胞、肠或肠内细胞，或专门的细胞例如心血管细胞、心肌细胞、肺细胞或其它呼吸细胞、胎盘、羊膜、绒毛膜或胎儿细胞、干细胞、软骨细胞或来自身体其它部分的重编细胞诸如重编为软骨细胞的脂肪细胞。
在使用干细胞的情形中，它们优选是非胚胎干细胞，例如来自成人骨髓或角膜的那些干细胞或者其它内源性干细胞，优选取自于待治疗的病人的干细胞。
本发明人在实验中已经注意到，骨先祖细胞在某些条件下在体外环境中除了骨之外，还将产生软骨，因此容易使软骨骨化，从而允许骨-软骨界面进行组织建造。
可用于包含或引入细胞的第二相的颗粒，是待审专利申请PCT/GB02/02813中所述的类型。
在微粒材料用于第二相的情形中，优选的是，颗粒是多孔的。优选，颗粒的空隙率至少为10％，更优选在40％以上，理想的甚至有70-97％那么高。便利的工作范围在50-95％之间。在任何情形下，优选的是，颗粒的孔径至少足以将细胞容纳在其内。细胞在基质植入时或者在这之前加入到基质中，或者之后加入(在从内源性细胞原位募集的情形中)。
通常，颗粒是微粒；尽管采用大细胞，但颗粒也可以在mm的范围内。
颗粒可以利用超临界流体来产生。
理想的是，粒径在10-80μm直径的量级上。这意味着，粒径通常在50μm-1mm直径的量级上，或者优选在250-500μm的量级上。正如所看到的，所有粒径都是孔径的函数。也就是说，基质的最终应用将决定基质的尺寸、粒径和孔径。例如，在基质不承载细胞的情形中，孔径变得没有什么临界，只要仍然能够通过基质发生扩散即可。此外，松弛的包装使孔径增大，从而使营养物或其它物质的传送更佳，反之亦然。然而，孔径不总是细胞大小的函数，因为大孔可与微小细胞一起播种。这些颗粒的使用具有如下优点确保整个基质保持足以使细胞生长并因此容纳生长组织的空隙率。优选的是，颗粒至少在其外表面上是粗糙的，因此孔还可在封闭的包装颗粒之间形成。此外，颗粒的粗糙表面能够改善细胞对颗粒的粘附性。
基质可包括利用诸如另一聚合物相或无机相的附加相。包括在每个附加相中的无机材料的实例包括生物玻璃、陶瓷、羟磷灰石、玻璃、玻璃陶瓷及复合材料。将可用于促进组织生长和发育的因子加入到其中一个相或两个相中，或者用来包被颗粒。此外，将不同的因子加入到每个相中或者加入到这个或每个包被液中。经常加入的因子包括(但不限于)上皮生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子和骨形成蛋白、细胞因子，包括干扰素、白细胞介素、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、雌激素、睾丸激素、激酶、化学激酶、葡萄糖或其它糖、氨基酸、石灰化因子、多巴胺、富胺寡肽例如在诸如纤连蛋白和层粘连蛋白之类的粘合蛋白中发现的肝素结合域、其它胺类三苯氧胺、顺式铂、肽和某些类毒素。此外，药物、激素、酶、营养物或其它治疗剂或因子或它们的混合物可加入到其中一个相或两相中。再者，可以将不同的药物、激素、酶、抗生素、营养物或其它治疗剂或因子或它们的混合物加入到每个相中。
然而，如上所述，本发明人已经发现，基质在无需引入细胞的前提下可用作组织支架。当组织支架(没有细胞)置于需要定位的部位内或部位处时，就募集或激励内源性细胞，以便在支架上、支架中或围绕支架生长。此效果由于在支架中存在一种或多种上述生长因子而得以加强。
按照本发明方法形成的组织可在体内用作植入组织，或在体外用作组织培养物。例如，组织在体内可用来代替被除去的患病、损坏或不起作用的组织，或者在体外用作组织培养物。有益的是，本发明可产生或生成三维培养组织，这种组织例如在药物扩散或摄取的研究中或者在分泌细胞的使用中可用作研究工具，其中分泌细胞为了发生分泌经常要求细胞呈三维分布。
在基质用于组织的情形中，优选在固化之前将其引入组织。
在一个优选实施例中，在组织于体内使用的情形中，优选的是，第一相在或接近动物体温时，或者在或接近适当组织的pH时转变为固态或半固态。或者是，硬化剂可用来加速固化。在任何情况下，优选的是，使第一相固化所必需的条件对于包含在其内的任何细胞都没有害。
本发明还提供了一种如上所述的组织支架基质的形成药盒。
在本发明的一个优选实施例中，第一相包括一种聚合物，这种聚合物具有低玻璃化点(Tg)或熔点，诸如在45℃之下，优选在40℃之下，理想的是在37℃或之下，第二相包括一种聚合物，这种聚合物具有较高的玻璃化点或熔点，诸如＞55℃。第一相在45℃之上、优选在40℃之上、理想的是在37℃之上进行加热，以便使聚合物粘稠或完全液化，然后将第二相引入到第一相中并进行混合。使混合物冷却。当细胞存在于基质中时，这些细胞可以在引入到第一相之前或者更优选的是在基质固化之前加入到第二相中。任一相还可包括生长因子或其它药物活性化合物，以便在使用时达到控释的效果。
除了颗粒本身固有的空隙率之外，多孔结构还由这个或每个相的颗粒之间的缝隙形成，或者通过第一相的不完全液化而形成。
在第二个实施例中，基质优选通过胶凝而形成。在该实施例中，第一相包括随温度发生胶凝(例如琼脂糖)或随pH发生胶凝(例如丙烯酰亚胺)或随着硬化或胶凝剂的加入而发生胶凝(例如将凝血酶加入到纤维蛋白原中以产生纤维凝胶)的材料。第一相进入流态或液态，然后与非胶凝的、优选是固态的第二相进行混合。使混合物冷却或胶凝。细胞可以在与第一相混合之前或混合之后但是在凝胶发生完全胶凝之前加入到第二相中。
现在参照下面实例来描述本发明的实施例，这些实施例如附
图1-3所示，其中图1表示出利用刃天青(Resazurin)还原测定法测定的、在温度交联的15％PEG1000/PLGA作用下的细胞生长状况。数值表示减去无细胞的对照值(n＝3，±SD)之后的来自还原反应产物的相对荧光单位；图2表示出利用刃天青还原测定法测定的、在酶交联的多孔PDLLA片作用下的细胞生长状况。数值表示减去无细胞的对照值(n＝3，±SD)之后的来自还原反应产物的相对荧光单位；图3表示出利用刃天青还原测定法测定的、在与人真皮纤维原细胞一起播种的酶交联PDLLA微粒作用下的细胞生长状况。数值表示减去无细胞的对照值(n＝3，±SD)之后的来自还原反应产物的相对荧光单位。
例1经由温度触发的固化的交联在此例中，第一相包括聚(乙二醇)/聚(DL-交酯)掺和颗粒(10wt％聚乙二醇)，第二相包括用常规的微粒沥滤法制造的多孔聚(DL-交酯)颗粒。将这两种组分混合到一起(20∶80至80∶20的比例范围)，然后加热到60℃，从而产生展性材料，这种材料由外科医生成型并施加到缺陷部位。在该例中，第一相在处理温度(聚合物的玻璃化温度之上)不完全液化，但变成“粘稠的”半固体。在另一个实例中，(不同聚合物掺和组合物)第一相在40-60℃(聚合物熔化转变点之上)可完全液化。随后第二相的多孔颗粒与仍然为液态的第一相混合到一起。材料然后由外科医生成型并施加到缺陷部位。
例1A温度触发的固化聚合物掺和组合物、它们的玻璃化转变温度(用示差扫描量热法测定的)以及交联温度的其它实例如下表所示。
例1b温度触发的具有细胞播种的交联通过在置于电热板上的陶瓷瓦上加热组分(1.70g的PLGA，0.3g的PEG1000)并物理混合熔融状态的组分，来制造熔融掺合物。将材料冷却、从瓦上拿下，并且在液氮中冷却之后立即进行切割和研磨。研磨的掺合物在使用之前储存在真空干燥器内。用示差扫描量热法测定玻璃化转变温度，而温度取自转变区域的中点。PLGA的玻璃化转变温度在43℃测定，而掺合物的玻璃化转变温度在16℃测定。
在与人真皮纤维原细胞(和无细胞的对照物)一起播种的支架(三份重复样品)上测定静态培养物中的细胞生长。研磨的掺和材料(80mgs的15％PEG1000/5050DL研磨掺合物)在37℃于6mm的PDMS模具中预先烧结15分钟。然后将细胞悬浮液加入到材料(100μl完全介质中的5×105人真皮纤维原细胞(@p8，50岁的老年供体/面式活检))中，并用刮勺按压材料，然后在37℃再烧结1小时。然后将支架从PDMS模具中拿出并置于完全培养介质中。通过用100μl的完全介质取代细胞悬浮液，来制备无细胞的对照物。支架在完全介质中培养17天(静态培养物)，而全介质每3-4天改变一次。
用刃天青还原测定法测定细胞的生长和增殖(图1)，并且每3-4天读取一次数值。将支架从培养物中取出，在PBS中洗涤并在无血清的介质中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小时。然后将溶液等分(3×150μl)到96孔板内，在具有350nm激发频率和590nm发射频率的板式读数器上读取荧光强度。
例2通过胶凝固化在此例中，第一相是由在25℃之上经历液体-凝胶转变的Pluronics F127溶液(在缓冲液或介质中为20wt％)组成的。第二相包括用常规的微粒沥滤法制造的多孔聚(DL-交酯)颗粒。将这两种组分混合到一起(以可能的大范围比例，诸如100μls的第一相和100mgs的第二相)，并在室温之下保持为液体。然后使组分经注射运送到缺陷部位，在该部位材料在达到37℃之后发生胶凝。
例3通过胶凝固化在此例中，第一相是由在加入凝血酶之后胶凝的纤维蛋白原溶液(例如在缓冲液或介质中为30-200mg/ml)组成的。第二相包括用常规的微粒沥滤法制造的多孔聚(DL-交酯)颗粒。将这两种组分混合到一起(以可能的大范围比例，诸如100μls的第一相和100mgs的第二相)，并在准备注射的注射器内保持为液体。然后在注射到缺陷部位之后与凝血酶溶液混合(用双筒注射器)(产生最终的凝血酶浓度为诸如1-1000单位/ml)，从而导致第一相发生交联和胶凝。
例3a细胞填充的多孔PDLLA片(1-2mm的大片)的交联通过溶剂浇注和微粒沥滤、用80％重量分数的盐产生多孔PDLLA片。使45wt％PDLLA的DCM溶液(2ml中含有900mgs)与3.6g的盐粒(在研磨和筛过之后为63-106μm的尺寸分数，平均尺寸＝88±27μm)混合。然后将含有盐的聚合物溶液倾注到陶瓷瓦上，并放置过夜以使溶剂蒸发。将聚合物盐组合物从瓦上拿下并人工切成1-2mm大小的片。通过在水中浸渍并搅拌过夜，而将盐从片中沥滤出来。
在与人真皮纤维原细胞(和无细胞的对照物)一起播种的支架(三份重复样品)上测定静态培养物中的细胞生长。多孔PDLLA片(2×120mgs)经轻微搅拌在血清(2mls)中包被1小时。通过将120mgs血清包被的PDLLA放置到1ml的细胞悬浮液中并轻微搅拌1小时，而完成细胞播种(在血清的介质中为1.2×106c/ml，人真皮纤维原细胞@p8，50岁的老年供体/面式活检)。将无细胞的对照物在无血清的介质中放置1小时。细胞固定之后，将片在无Ca2+的HBSS中进行洗涤。将纤维蛋白原+凝血酶溶液(160μl的100mgml纤维蛋白原和10U/ml的凝血酶)加入到片中并与之混合，除去过量的液体，然后使片交联15分钟。将支架在完全介质(添加有胎牛血清的DMEM)中培养17天(静态培养物)，而全介质每3-4天改变一次。
用刃天青还原测定法测定细胞的生长和增殖(图2)，并且每3-4天读取一次数值。将支架从培养物中取出，在PBS中洗涤并在无血清的介质中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小时。然后将溶液等分(3×150μl)到96孔板内，在具有350nm激发频率和590nm发射频率的板式读数器上读取荧光强度。
例3b细胞填充的多孔PDLLA片(250-500μm的小片)的交联通过溶剂浇注和微粒沥滤、用90％重量分数的盐产生多孔PDLLA片。使45wt％PDLLA的DCM溶液(2ml中含有900mgs)与8.1g的研磨盐粒(在乳钵和臼中研磨之后没有过筛)混合。然后将含有盐的聚合物溶液放置到陶瓷瓦上，并放置过夜以使溶剂蒸发。将聚合物盐组合物从瓦上拿下并用乳杯和臼研磨。通过在水中浸渍并搅拌过夜，而将盐从片中沥滤出来。盐沥滤之后将多孔片过筛，并保留250-500μm的分数。
多孔PDLLA片(40mgs)经轻微搅拌而用血清进行包被。然后将片在PBS中进行洗涤。通过将多孔片在无血清的介质中于1ml的细胞悬浮液(9×105个细胞/ml)中放置并轻微搅拌1小时，而将人真皮纤维原细胞(来自成人供体@通道15)播种到多孔片上。
细胞固定之后，将纤维蛋白原+凝血酶溶液(160μl的100mgml纤维蛋白原和5U/ml的凝血酶)加入到片中并与之混合，除去过量的液体，然后使片交联30分钟。
将支架上的细胞代谢和生长测定72小时。然后将支架从培养物中取出，在PBS中洗涤并在无血清的介质中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小时。然后将溶液等分(3×150μl)到96孔板内，在具有350nm激发频率和590nm发射频率的板式读数器上读取荧光强度。在24与72小时之间，来自支架的RFU值从296RFU增大到569RFU(在减去背景之后)。
例3cPDLLA微粒与细胞的交联将4g的PDLLA溶解到20ml的二氯甲烷中，从而生成20wt％的溶液。将聚(乙烯醇)(88％水解的)溶解到蒸馏水中，从而给出通过0.45μm过滤器进行过滤的0.05wt％溶液。用均化器以6,000rpm的速度将PVA溶液分散15分钟，然后将PDLLA/dcm溶液注入分散的PVA溶液中。混合物在搅拌过夜以使DCM蒸发之前再均化5分钟。然后，微粒在冻干之前在离心机中用蒸馏水洗涤3次。用亮场显微镜和图像分析法测定微粒直径在20μm(±10μm)。
将人真皮纤维原细胞(来自于50岁的老年供体/面式活检，在通道8)重新悬浮到少量的全介质(50μl中有5×105c细胞)中。使该细胞悬浮液与100μl的纤维蛋白原/凝血酶溶液(HBSS中含有150mg/ml的纤维蛋白原和15U/ml的凝血酶)混合，然后将此溶液加入到200mgs的微粒中并混合。将所生成的糊放到6mm的PDMS立方体成型模具中并在37℃放置40分钟，以使交联完成。通过用50μl的完全介质取代细胞悬浮液，来制备无细胞的对照物。将支架在完全介质中培养17天(静态培养物)，而全介质每3-4天改变一次。
用刃天青还原测定法测定细胞的生长和增殖(图2)，并且每3-4天读取一次数值。将支架从培养物中取出，在PBS中洗涤并在无血清的介质中于1ml的10μg/ml刃天青溶液中放置1小时。然后将溶液等分(3×150μl)到96孔板内，在具有350nm激发频率和590nm发射频率的板式读数器上读取荧光强度。
例4多孔颗粒在此例中，用常规的盐沥滤技术产生大孔颗粒(≥500μm)。用乳钵和臼对盐进行研磨，然后过筛，从而将尺寸合适的部分保留下来。理想的是，盐粒的大小为50-100μm。然后在熔融相或适当的溶剂中，使盐粒与聚(DL-交酯)混合。盐的填充在50与90wt％之间。然后，通过研磨和切割，将整块的盐/聚合物组合物固体(在冷却或溶剂提取之后)处理成大的颗粒。随后，通过在水中搅拌至少24小时，而将盐从组合物中沥滤出来。
在另一个实例中，利用诸如超临界CO2、通过常规的气体发泡技术，可以处理盐/聚合物组合物。在另一个实例中，利用诸如超临界CO2、通过常规的气体发泡技术，可以制造多孔聚合物片。
权利要求
1.一种多孔基质的生产工艺，所述工艺包括如下步骤—使第一相成为流体状态，—将第二相引入第一相，—使第一相和第二相混合，以确保第二相通过第一相实现所需的分布，以及—使第一相固化，而第二相就在第一相内。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，第一相是粘稠的。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，第一相包被第二相。
4.根据权利要求1-3任一项所述的工艺，其特征在于，在一个参数改变时，第一相从流态转变为固态或半固态。
5.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述参数是温度、pH、硬化剂的引入、光线的存在/缺乏、紫外熟化、红外熟化，或者在厌氧条件下。
6.根据前述任一项权利要求所述的工艺，其特征在于，第二相是固相。
7.根据权利要求1-5任一项所述的工艺，其特征在于，第二相是液相。
8.根据权利要求7所述的工艺，其特征在于，所述液相是微粒材料的乳液或悬浮液。
9.根据权利要求8所述的工艺，其特征在于，所述微粒材料是多孔的。
10.根据权利要求8或9所述的工艺，其特征在于，所述微粒材料是多孔的，所述颗粒的空隙率在10-97％之间。
11.根据前述任一项权利要求所述的工艺，其特征在于，将细胞加入到一个相中。
12.根据权利要求11所述的工艺，其特征在于，将所述细胞加入到第二相中。
13.根据前述任一项权利要求所述的工艺，其特征在于，第一和第二相是具有不同固化特性的相似材料。
14.根据前述任一项权利要求所述的工艺，其特征在于，所述相包括聚合物。
15.根据权利要求14所述的工艺，其特征在于，所述聚合物选自聚(α-羟基酸)、聚乳酸或聚乙醇酸、聚交酯聚乙交酯共聚物、聚交酯聚乙二醇(PEG)共聚物、聚酯、聚(ε-己内酯)、聚(3-羟丁酸酯)、聚(s-己酸)、聚(对-二噁酮)、聚(丙烯富马酸酯)、聚(原酸酯)、多羟基/双烯酮乙缩醛(polyol/diketene acetals)加成聚合物、聚酐、聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基双羧苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)、聚[双(对-羧苯氧基)甲烷](PCPM)、SA、CPP和CPM的共聚物、聚(氨基酸)、聚(假氨基酸)、聚磷腈、聚[(二氯)磷腈]、聚[(有机)磷腈]聚合物的衍生物、聚磷酸酯；聚乙二醇聚丙烯嵌段共聚物、天然聚合物、丝绸、弹性蛋白、壳质、脱乙酰的甲壳质(chitosan)、纤维蛋白、纤维蛋白原、聚糖(包括胶质)、藻酸酯、胶原质、聚(氨基酸)、肽、多肽或蛋白质、由这些聚合物的单体制备的共聚物、这些聚合物的随机掺和物或者它们的混合物或组合物。
16.根据权利要求14或15所述的工艺，其特征在于，所述聚合物是能够生物降解的。
17.根据权利要求14-16任一项所述的工艺，其特征在于，所述聚合物是交联的。
18.根据前述任一项权利要求所述的工艺，其特征在于，将增塑剂加入到其中一相或两相中。
19.一种组织支架基质，所述基质包括第一、载体相和包含在第一相之内的第二、悬浮相，所述基质还包括细胞。
20.一种根据前述任一权利要求所述的工艺制备的组织支架基质。
21.根据权利要求19或20所述的组织支架基质，其特征在于，第二相包括细胞。
22.根据权利要求19-21任一项所述的组织支架基质，其特征在于，将细胞播种到包含或承载在第二相内的微粒材料中。
23.根据权利要求19-22任一项所述的组织支架基质，其特征在于，所述细胞是动物细胞。
24.根据权利要求19-23任一项所述的组织支架基质，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。
25.根据权利要求19-24任一项所述的组织支架基质，其特征在于，所述细胞是人细胞。
26.根据权利要求23-25任一项所述的组织支架基质，其特征在于，所述细胞是骨、骨先祖细胞、心血管细胞、内皮细胞、心肌细胞、肺细胞或其它呼吸细胞、肠或肠内细胞、软骨、肌肉、肝、肾、皮肤、或专门的细胞例如胎盘、羊膜、绒毛膜或胎儿细胞、干细胞、软骨细胞、或来自身体其它部分的重编细胞诸如重编为软骨细胞的脂肪细胞。
27.根据权利要求19-26任一项所述的基质，其特征在于，所述基质还包括可用于促进组织生长和发育的因子。
28.根据权利要求19-27任一项所述的基质，其特征在于，所述基质还包括上皮生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子和骨形成蛋白、细胞因子，包括干扰素、白细胞介素、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、雌激素、睾丸激素、激酶、化学激酶、葡萄糖或其它糖、氨基酸、石灰化因子、多巴胺、富胺寡肽例如在诸如纤连蛋白和层粘连蛋白之类的粘合蛋白中发现的肝素结合域、其它胺类三苯氧胺、顺式铂、肽和某些类毒素。
29.根据权利要求19-28任一项所述的基质，其特征在于，所述基质在两相中还包括药物、激素、酶、抗生素、营养物或其它治疗剂或因子或它们的混合物。
30.根据权利要求19-27任一项所述的基质，其特征在于，所述基质的每个相包括不同的药物、激素、酶、抗生素、营养物或其它治疗剂或因子或它们的混合物。
全文摘要
本发明描述了一种适合用作组织支架的多孔基质。所述基质在插入到靶组织部位处或其内之前进行成型，或经危害最小的侵入式方法进行注射。基质可与靶组织细胞一起播种或用来支撑局部内源性组织的生长。基质可含有生长因子或其它药物可接受的部分例如抗生素。
文档编号A61L27/36GK1816360SQ200480007759
公开日2006年8月9日 申请日期2004年3月29日 优先权日2003年3月27日
发明者理查德·梅尔维尔·弗朗斯, 罗宾·安德鲁·奎克 申请人:瑞根泰克有限公司