专利名称：一种茶叶活性单体组合物及其在防治肿瘤中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中医药领域，具体地说涉及一种防治肿瘤的纯天然药物组合物。
背景技术：
恶性肿瘤是危及人类生命的最严重的疾病之一，是仅次于心血管病的第二高死亡率的疾病。利用信号转导系统的靶分子为靶点进行抗癌药物筛选，尤其是天然产物中提取的抗癌药物的作用机制研究，正在成为一个人们密切关注的新领域，在中国，一片片的茶园，使茶叶成为了资源最丰富的植物之一，茶叶活性成分的开发与利用已成为一个热门的课题，其药用价值的研究具有广泛的前景。
茶叶中茶多酚类化合物含量高，诸多研究表明茶叶具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗畸变、降血压、降血脂、降血糖、防辐射等多种保健功能。茶叶成分中，具有较高活性的儿茶素在癌症的启动、发生、发展等各个阶段均有作用，目前儿茶素抗癌的主要机制是通过抗氧化途径，直接清除自由基或增强抗氧化酶的活性而间接产生作用。用儿茶素单体进行抗癌的实验已有不少的报道，证实了儿茶素具有较好的抗癌作用。中国专利申请号为02111627.X，名称为表没食子儿茶素没食子酸酯在抗肿瘤药物中应用，公开了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在制备抗肿瘤药物中的应用。但其单体纯化合物不但价格昂贵，且来源并不丰富，大大限制了这些单体化合物在医药上的应用。如果用茶多酚混合物，其抗肿瘤活性又大大不如单体，因此如何从儿茶素单体化合物中通过合理的、科学的组合，得到活性较高、成本较低的组合物的研究则未见报道，这方面的研究是对茶叶在医药上的应用所迫切的课题。
细胞凋亡是肿瘤学研究的热点，尤其是在肿瘤药物的筛选及机制研究方面为人们提供了新思路。茶多酚是茶叶中最具抗肿瘤的酚性化合物，尽管流行病学、体内和体外实验证实了茶多酚的抗肿瘤活性，但仍有待深入研究，而几种儿茶素单体组合在一起组成药物组合物的实验则未见报道。
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是疱疹病毒家族的一员。已证明EB病毒是一种DNA致癌病毒。EB病毒感染与鼻咽癌的发生和发展相关。在鼻咽癌患者的血清中VCA-IgA多为阳性，且其滴度改变与病情呈正相关。研究发现大多数鼻咽癌标本中存在EB病毒基因。EB病毒的基因也高频出现在Burkitt’s淋巴瘤RAJI细胞增生性疾病中。EB病毒基因组为双链DNA，它包含17.2万碱基对，包括其内部重复序列(IR)和位于基因组两端的末端重复序列(TR)以及独特序列(U)。其中BNLF-1编码的潜伏性膜蛋白(Latent Membrance Proteinl，LMP1)作为首先被证实具有瘤基因功能的基因，涉及到细胞增殖、转化、凋亡及分化反应，因而一直是病毒致癌机制甚为关注的领域。
目前研究表明LMP1以不同的作用机制参与了细胞信号转导，产生抗凋亡作用LMP1通过NFKB调控其下游靶基因的表达，在细胞增殖、分化、转化与凋亡中发挥着重要的生物学作用，因而在鼻咽癌发病机制的研究中备受瞩目。它可通过NFKB调节Survivin——NFKB介导信号通路中的效应分子。Survivin是用效应细胞蛋白酶受体EPR1(effector cell protease receptor 1，EPR1)cDNA在人类基因组文库中筛选克隆出的细胞凋亡抑制基因。Caspases(半胱氨酸蛋白酶)是近年来发现的与细胞凋亡关系极为密切的一组蛋白酶。目前认为Caspases是细胞凋亡的执行者。正常情况下它是以无活性的酶原形式存在。在某些凋亡启动诱导因素的作用下，凋亡信号传递至Caspases并使其发生层层激活，即“瀑布式”激活，导致终末效应——细胞凋亡。
人Survivin基因与EPR1基因的编码区序列高度互补，位于染色体(17q25)的同一基因族。Survivin在正常成人组织中是一个“关闭”的基因，在肿瘤组织中被激发表达，而且它的过度表达与肿瘤的预后不良、复发以及多药耐药的形成密切相关，有望成为一个应该说的肿瘤诊断标志物。新近确定Survivin是IAPs(Inhibitor of apoptosisi proteins)成员之一，它存在于大多数转化细胞系和癌细胞中，通过直接Caspases抑制或Caspases酶原活化以及通过调节转录因子NFKB等抑制细胞凋亡。
实验研究报道茶多酚对肿瘤的生长具有抑制作用。在离体细胞实验中，EGCG能明显抑制人前列腺癌细胞的增殖，细胞周期发生阻滞。茶多酚可使转染了LMP1的人鼻咽癌细胞CNE1-LMP1分裂相细胞减少，细胞存活率显著降低，且呈明显的量效关系。用绿茶提取物处理鼻咽癌株，发现其对DNA拓扑异构酶II有显著的抑制作用，出现了DNA的降解，即癌细胞凋亡的典型特征。茶多酚能通过抑制细胞周期素的表达和促使CDK抑制的表达，最终导致CDK活性降低，从而通过细胞周期素激酶抑制子-细胞周期素-细胞周期素依赖的激酶机制阻滞细胞周期，继而诱导细胞凋亡。这些研究机制表明茶多酚作为天然产物中提取的抗癌有效成分对信号转导通路有干预作用。而LMP1是EB病毒这种环境致癌因素编码的蛋白，它通过多种信号传到通路促进细胞的增殖和抗凋亡。研究中发现茶多酚能抑制与EB病毒相联系的信号转导通路，表明这种途经可能是茶多酚抑制与EB病毒相关的肿瘤分子机制之一。研究发现EB病毒的LMP1可通过Survivin促增殖和抗凋亡。对Survivin的抗凋亡机制的研究，表明Survivin通过抑制凋亡事件中的主要执行者Caspases-3而产生抗凋亡作用。在干预作用中国内学者提出茶多酚通过诱导Caspases-3的活性上调，达到促进肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖的抗癌作用。
目前关于在细胞周期信息通路中，茶多酚或儿茶素干预Survivin与Caspases-3相互调控作用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有儿茶素单体化合物在防治肿瘤上存在的问题，提供一种防治肿瘤效果好、活性高、成本低的茶叶活性单体药物组合物。
本发明的另一个目的是提供上述茶叶活性单体药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用具体技术方案是一种茶叶活性单体药物组合物，由如下五种单体和重量份组成EGCG250～350ECG 250～350EGC 150～250EC 50～150TFG 0.5～1.0。
EGCG(英文名为(-)-epigallocatechin-3-gallaet；中文名为表没食子儿茶素没食子酸酯)、ECG(英文名为(-)-Epicatechin-3-gallate；中文名为表儿茶素没食子酸酯)、EGC(英文名为(-)-Epigallocatechin；中文名为表没食子ER儿茶素)、EC(英文名为(-)-Epicatechin；中文名为表儿茶素)、TFG(英文名为theaflavin gallate；中文名为茶黄素没食子酸酯)。
本发明考察了活性单体经组合后形成的药物组合物体外抑制CNE2、RAJI、SUNE1细胞增殖的作用，观察了药物组合物对RAJI癌细胞形态上的改变、癌细胞凋亡反应、癌细胞中Survivin和Caspase-3蛋白表达水平以及细胞周期阻滞作用，结果表明单体药物组合物具有体外抗肿瘤作用，其作用能力比最强的单体要高得多，能抑制CNE2、RAJI、SUNE1细胞的生长，致使癌细胞发生形态上的改变，出现细胞凋亡现象，抑制癌细胞中Survivin蛋白水平的表达，使Caspase-3蛋白表达上调，从而使癌细胞RAJI出现周期阻滞，促进肿瘤细胞凋亡。表明药物组合物具有预防、治疗肿瘤的作用。
药物组合物对癌细胞增殖抑制作用的实验表明，药物组合物能抑制CNE2、Raji、SUNE1等癌细胞的增殖，并随其浓度升高而逐渐增强，其IC50(mg/L)分别是4.17、4.45、4.79，比最强的单体EGCG的抑制能力强得多(EGCG对三种癌细胞的IC50(mg/L)分别是11.34、13.02、18.01)。
药物组合物诱导RAJI细胞凋亡的形态学实验表明，药物组合物可诱导RAJI细胞胞核内出现浓染致密的颗粒荧光，产生新月型改变，固缩或片段化的核以及凋亡小体，其诱导凋亡的程度比EGCG强。TUNEL实验表明RAJI细胞凋亡的阳性反应主要在凋亡细胞核，部分在细胞质。
流式细胞仪检测细胞周期实验表明组合物与EGCG一样可诱导RAJI细胞周期阻滞在G0/G1期。
药物组合物对RAJI细胞中Survivin、Caspase-3表达的影响实验表明，药物组合物能抑制细胞内Survivin的阳性反应，表达减少，其表达水平比EGCG的表达更低。而对细胞内Caspase-3显强阳性反应，表达增加，其表达水平比EGCG的表达更高。
上述的结果表明，由五种茶叶活性单体组合后的组合物能抑制CNE2、RAJI、SUNE1细胞增殖，改变RAJI癌细胞形态，使癌细胞出现凋亡现象，癌细胞中Survivin表达下降，而Caspase-3表达升高，从而使癌细胞RAJI出现周期阻滞，促进肿瘤细胞凋亡。所以，本发明的药物组合物可用于制备防治肿瘤的药物。
本发明的茶叶活性单体药物组合物在抗肿瘤中疗效显著。本发明的茶叶活性单体药物组合物可以采用药剂学上允许的任何剂型，包括口服剂型如片剂、胶囊、口服液等，也可以采用注射剂如输液、粉针等，还可以采用外用剂型如软膏等。当采用口服剂型及外用剂型时，组合物可采用茶叶的水提物或醇提物的未经纯化的混合提取物的方式，但其组合的份量是在上述范围内。本发明的药物组合物可以与其他防治肿瘤的药物制成复方制剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1、五种儿茶素单体的组合，使得抗肿瘤活性大大增强。
2、由于具有抗肿瘤活性的儿茶素单体的成本昂贵，五种单体的组合降低了药物的成本。
3、该药物组合物来自于植物，副作用小。
4、制备工艺简单。
图1为RAJI细胞对照组48小时后，DAPI荧光染色，在400倍荧光显微镜下的照片；图2为4.0mg/L药物组合物处理RAJI细胞48小时后，DAPI荧光染色，在400倍荧光显微镜下的照片；图3为4.0mg/L EGCG处理48小时RAJI细胞后，DAPI荧光染色，在400倍荧光显微镜下的照片；图4为RAJI对照组48小时TUNEL，在400倍荧光显微镜下的照片；图5为4.0mg/L药物组合物处理48小时后诱导RAJI细胞凋亡(TUNEL)，在400倍荧光显微镜下的照片；图6为4.0mg/LEGCG处理48小时后诱导RAJI细胞凋亡(TUNEL)，在400倍荧光显微镜下的照片；图7为EGCG和药物组合物对RAJI细胞株周期的影响图(FCM)；图8为RAJI48小时对照组，免疫组化法检测组细胞核和核周胞质，在400倍显微镜下的照片；图9为RAJI经4.0mg/L药物组合物处理48小时后，免疫组化法检测细胞核和核周胞质，在400倍显微镜下的照片；图10为RAJI经4.0mg/L EGCG处理48小时后，免疫组化检测细胞核和核周胞质，在400倍显微镜下的照片；图11为RAJI对照组48小时，免疫组化检测细胞浆内，在400倍显微镜下的照片；图12为RAJI经4.0mg/L药物组合物处理48小时后，免疫组化法检测细胞浆内，在400倍显微镜下的照片；图13为RAJI经4.0mg/L EGCG处理48小时后，免疫组化法检测细胞浆内，在400倍显微镜下的照片；其中，在图7中，A、B、C分别为未经处理、经EGCG、药物组合物处理RAJI24小时后的细胞周期；D、E、F分别为未经处理、经EGCG、药物组合物处理RAJI72小时后的细胞周期；COMPLEX为药物组合物。
具体实施例方式
实施例1 药物组合物的制备取EGCG 260克，ECG 280克，EGC 150克，EC 60克，TFG 0.5克，混合均匀，磨碎即可得到药物组合物。
实施例2 药物组合物的制备取EGCG 350克，ECG 320克，EGC 150克，EC 100克，TFG 1.0克，混合均匀，磨碎即可得到药物组合物。
实施例3 药物组合物的制备取EGCG 300克，ECG 350克，EGC 250克，EC 150克，TFG 0.8克，混合均匀，磨碎即可得到药物组合物。
实施例4 药物组合物对癌细胞增殖抑制作用细胞株与培养细胞株人Burkitt’s淋巴瘤RAJI、人低分化鼻咽癌SUNE1和人鼻咽癌CNE2细胞株由中山大学肿瘤防治中心提供，RAJI可表达EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1。
细胞培养各细胞株接种于含10％小牛血清(Gibco，经56℃，30min灭活)，100U·ml-1青霉素及100μg·ml-1链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃含5％CO2及饱和湿度的培养箱内培养传代。实验所用的细胞均是对数生长期的细胞。
MTT法测定肿瘤细胞存活率将对数生长期细胞稀释成1×105cells·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，同时分别加入2.0mg/L，4.0mg/L，8.0mg/L，16.0mg/L，32.0mg/L浓度梯度的试验样品处理，每浓度平行6孔，同时设0.1％DMSO溶剂对照组和生理盐水对照组置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养48h。实验终止前4h每孔加入MTT磷酸缓冲液(MTT浓度为5mg·ml-1)10μl。培养结束后每孔加入100μl DMSO(二甲基亚砜)，振荡10min，使MTT还原产物完全溶解。用550Model酶标仪，以570nm为实验波长，450nm为参考波长测定其吸收度，按下式计算肿瘤细胞抑制率并计算半数抑制浓度IC50。肿瘤细胞存活率＝实验孔测定值/对照孔测定值×100％；肿瘤细胞抑制率＝1-肿瘤细胞存活率。再按Bliss公式计算(BIO-RAD model 500所带软件)程序求出半数抑制浓度IC50。
药物组合物对癌细胞增殖抑制结果经不同浓度的药物组合物作用后，CNE2、RAJI、SUNE1细胞的抑制率见表1(表2为EGCG的作用结果)。表中的结果表明3种细胞抑制率随组合物浓度升高而逐渐增强，并以浓度依赖性关系抑制癌细胞增殖。由这些结果可计算其半数抑制浓度IC50见表1。
药物组合物对癌细胞的抑制作用是CNE2＞RAJI＞SUNE1，表明它对不同的癌细胞的抑制效果是不相同的，但比较接近。而EGCG对3种癌细胞的抑制率则相差较大；药物组合物对癌细胞的抑制能力比最强的单体EGCG大得多。
结论药物组合物能抑制癌细胞的增殖，其抑制能力比EGCG强。
表1、药物组合物对CNE2、RAJI、SUNE1细胞增殖的抑制率
注表中的数据均为三次重复的平均值，±后标出的数据均表示标准误(S.E)表2、EGCG对CNE2、RAJI、SUNE1细胞增殖的抑制率
注表中的数据均为三次重复的平均值，±后标出的数据均表示标准误(S.E)实施例5 药物组合物诱导RAJI细胞凋亡的形态学改变DAPI荧光染色实验取处于对数生长期的细胞，稀释成1×104个细胞·ml-1接种于6孔板上培养，设0.1％DMSO溶剂对照组和4.0mg/LEGCG及药物组合物。处理组，48小时后，收集细胞，用DAPI-甲醇工作液(1μg·ml-1)洗涤1次，再用DAPI-甲醇工作液(1μg·ml-1)重悬并37℃孵育15分钟，离心收集细胞，弃去染色液，甲醇洗涤，PBS重悬，置于荧光显微镜下观察。
DAPI荧光染色结果DAPI荧光染料结果显示，经EGCG及药物组合物处理的RAJI细胞胞核内可见浓染致密的颗粒荧光，典型细胞可见新月型改变，固缩或片段化的核以及凋亡小体(图2，3)。未经处理的细胞胞核呈弥散均匀的、较弱的荧光(图1)。EGCG及药物组合物诱导RAJI细胞凋亡的形态学改变是相似的，但诱导RAJI细胞凋亡的程度药物组合物(图2)比EGCG(图3)强。
结论药物组合物可诱导RAJI细胞胞核内出现浓染致密的颗粒荧光，产生新月型改变，固缩或片段化的核以及凋亡小体，其诱导凋亡的程度比EGCG强。实施例6药物组合物诱导RAJI细胞凋亡的反应原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞实验收集48小时经0.1％DMSO溶剂对照组和4.0mg/LEGCG及药物组合物处理组的RAJI细胞，采用Cytospin细胞甩片后，经4％的多聚甲醛固定40分钟，采用原位细胞凋亡检测试剂盒，按说明书操作。普通光镜观察、照相。
凋亡细胞实验结果RAJI细胞经4.0mg/L EGCG处理48小时，TUNEL阳性的棕褐色反应主要在凋亡细胞核，部分在细胞质。细胞核内可见有TUNEL阳性的棕褐色颗粒点状不均匀染色质浓聚，染色质边集以及固缩，可见凋亡小体(图6)。RAJI细胞组合物处理48小时，TUNEL阳性的棕褐色反应与EGCG一样，也是主要在凋亡细胞核，部分在细胞质。图5显示细胞核内也可见有TUNEL阳性的棕褐色颗粒点状不均匀染色质浓聚，染色质边集以及固缩，可见凋亡小体，细胞凋亡比EGCG要多。RAJI对照组，细胞核呈淡蓝色，可见少量散在的TUNEL阳性棕褐色颗粒(图4)。
结论TUNEL实验表明RAJI细胞凋亡的阳性反应主要在凋亡细胞核，部分在细胞质。
实施例7 药物组合物对RAJI细胞周期阻滞的影响流式细胞仪检测细胞周期实验收集0.1％DMSO溶剂对照组和4.0mg/LEGCG及药物组合物分别在24小时和72小时处理后的RAJI细胞，PBS洗涤两次。加入0.5mlPBS制成单细胞悬液和体积分数为70％冷乙醇3ml固定，4℃冰箱过夜后，取1×106已固定的细胞，用PBS洗两遍，去上清后加入300μl DNA染液(内含碘化丙啶(PD100μg·ml-1和RNA酶20U·ml-1)，室温30分钟。上机分析检测其细胞周期。
流式细胞仪检测细胞周期实验结果经4.0mg/L的EGCG和药物组合物处理RAJI 24和72小时后检测其细胞周期，得图7，将图中的相关数据整理得表3。图7和表3的结果表明EGCG处理RAJI后，与对照组细胞比较G0/G1期从34.7％增加到50.5％，S期从44.4％下降到37.9％，处理72小时后，G0/G1期从50.5％增加到56.5％。故流式细胞仪检测细胞周期表明EGCG可诱导RAJI细胞周期阻滞在G0/G1期，RAJI细胞周期阻滞24小时已较明显。在4.0mg/L药物组合物处理RAJI 24小时后，与对照组比较G0/G1期从34.7％增加到59.4％，S期从44.4％下降到27.3％，处理72小时后发生更明显的变化，G0/G1期从59.4％增加到70.1％。经药物组合物处理后，RAJI细胞周期阻滞24小时比EGCG更明显。因此，流式细胞仪检测细胞周期表明EGCG和药物组合物均可诱导RAJI细胞周期阻滞在G0/G1期。
表3、EGCG和药物组合物对RAJI细胞株周期影响的结果
结论流式细胞仪检测细胞周期实验表明药物组合物与EGCG一样可诱导RAJI细胞周期阻滞在G0/G1期，但药物组合物的效果更明显。
实施例8 药物组合物对RAJI细胞中Survivin、Caspase-3表达的影响免疫细胞化学技术观察Survivin、Caspase-3蛋白表达实验分别取经4.0mg/LEOCG及药物组合物处理48h和0.1％DMSO溶剂对照组48h的RAJI细胞，用Cytospin细胞甩片后中性福尔马林固定15分钟，PBS洗(3min×3)，3％H2O2室温孵育3分钟，PBS洗(5min×2)，滴加正常山羊血清封闭孵育10min(室温)，滴加兔抗人Survivin/Caspase-3多克隆抗体(1∶100)孵育过夜(4℃)，PBS洗(3min×3)，滴加二抗山羊抗小鼠IgG抗体一生物素多聚体孵育30min(37℃)，PBS洗(3min×3)，滴加链霉卵白素-HRP多聚体孵育30min(37℃)，PBS洗(3min×3)，滴加新鲜配制的DAB 10min，自来水冲洗，苏木素复染1min，自来水冲洗，树脂封片，普通光镜观察、照相。每份样品重复3次实验，同时用正常山羊血清取代第一抗体，作为阴性对照。光镜下观察结果，以镜下所见胞膜或胞浆出现棕褐色颗粒者为阳性细胞，观察指标定位Survivin定位于细胞核、核周胞质内；Caspase-3定位于细胞浆内；定性出现深棕褐色颗粒，为强阳性；出现棕褐色颗粒，为中等阳性；出现淡褐色颗粒，为弱阳性。
实验结果图8-10分别是经4.0mg/LEGCG及药物组合物处理48h和0.1％DMSO溶剂对照组48h的RAJI细胞，用免疫组化法检测细胞核和核周胞质内Survivin所得到的图片。图中显示，与对照组(图8)比较，用药物组合物处理过的RAJI实验组细胞内Survivin显弱阳性反应，表达减少(图9)；对照组Survivin表达较高，细胞内呈强阳性反应(图8)；用EGCG处理过的RAJI实验组细胞内Survivin也显弱阳性反应，表达也减少(图10)。这些结果表明EGCG和组合物对RAJI细胞中的Survivin表达水平减少，药物组合物的表达水平比EGCG的表达更低。
图11～13经免疫组化法检测细胞浆内Caspase-3所得到的图片。图中显示，对照组细胞浆内Caspase-3表达减少(图11)，用组合物处理过的RAJI实验组细胞浆内Caspase-3显强阳性反应，表达增加(图12)；用EGCG处理过的RAJI实验组细胞浆内Caspase-3则呈中等阳性反应，表达有所增加(图13)。这些结果表明EGCG和药物组合物对RAJI细胞浆内Caspase-3表达水平上升，药物组合物的表达水平高于EGCG。
结论药物组合物对RAJI细胞中Survivin、Caspase-3表达的影响实验表明，药物组合物能抑制细胞内Survivin的阳性反应，表达减少，其表达水平比EGCG的表达更低。而对细胞内Caspase-3显强阳性反应，表达增加，其表达水平比EGCG的表达更高。
权利要求
1.一种茶叶活性单体药物组合物，其特征在于由如下组分和重量份组成EGCG250～350ECG 250～350EGC 150～250EC 50～150TFG 0.5～1.0。
2.权利要求1所述茶叶活性单体药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物组合物在制备抗淋巴瘤或鼻咽癌药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物组合物在制备抗淋巴瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种茶叶活性单体组合物及其应用。本发明针对现有儿茶素单体在抗肿瘤上疗效显著但价格昂贵的问题，提供一种茶叶活性单体组合物，其由如下单体和重量份组成EGCG 250～350，ECG250～350，EGC 150～250，EC 50～150，TFG 0.5～1.0。本发明药物组合物的抗肿瘤活性比单体好，成本大大降低，副作用小，制备工艺简单，应用前景广阔。
文档编号A61K36/185GK1732917SQ20051003686
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者罗一帆, 许旋 申请人:华南师范大学