专利名称：一种用于治疗急性肾衰的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗急性肾衰的组合物，尤其是指一种用于治疗急性肾衰的组合物在制药领域中的用途。
背景技术：
在临床实践中，常见病人由于创伤、休克、及大手术后出现急性缺血性肾功能障碍。病人的肾脏排泄功能在短期内迅速减退，肾小球滤过功能下降到正常值50％以下，血肌酐和尿素氮水平迅速升高并引起水、电解质及酸碱平衡失调和急性尿毒症症状。急性肾功能衰竭，虽发生率低，但至今病死率仍高达49％-71％。如何减轻和预防急性肾功能衰竭，一直是人们对肾损伤保护的主要研究课题。
近年来关于应用药物预防和治疗急性肾功能障碍时的细胞损伤和促进细胞修复与再生的报道日益增多。常见有腺嘌呤核苷酸类药物、氧自由基清除剂、钙离子阻滞剂、钙镁锌等两价阳离子、血管紧张素转换酶抑制剂、前列腺素。氨基酸对肾功能保护作用的机理尚未阐明。若甘氨酸、丙氨酸用量过高(125umol/kg·min)，GFR下降32％，说明甘氨酸、丙氨酸用量过高有潜在肾毒性。低至中剂量的氨基酸可引起肾血管扩张及GFR的增加。Weinberg JM等发现存在甘氨酸和L-丙氨酸增加肾近端小管细胞耐受缺氧损伤，保护作用不依赖细胞内的ATP的水平，和氨基酸的代谢无关。认为高度的特异受体和配体的作用在维持细胞的完整性起关键作用。Paller Ms等发现甘氨酸和丙氨酸对培养肾近端小管细胞的缺氧再供氧有保护作用。Silva p等2mM的甘氨酸加入离体灌注大鼠肾模型中，甘氨酸能保护髓攀粗升支的缺氧损伤，丙氨酸也有同样作用，与NO和降低细胞活动无关。Baines AD等发现在离体灌注肾模型中检查氨基酸的保护作用发现甘氨酸和丙氨酸等中性氨基酸的保护不需代谢，和它们稳定膜蛋白的三级结构有关。
丹参和降香，唇形科植物丹参干燥根及根茎和豆科植物降香檀的树干和根的干燥心。主要具有1、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量，改善心肌缺血状态；2、扩张血管，改善微循环障碍；3、抑制血液凝固，促进纤溶，改善血液流变性；4、清除自由基，抗脂质过氧化损伤；5、降低血脂，防止动脉粥样硬化。
现有两者的组合制剂，香丹注射液，主要用于治疗临床可用于治疗中风、脑供血不足、冠心病、心肌梗塞、心肌炎、肺心病、慢性肾功能不全，肾病综合症等。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗急性肾衰的药物组合物，由香丹注射液、甘氨酸、生理盐水组成，各组分的重量比为20％香丹注射液 10.0-25.0甘氨酸 1.0-5.0生理盐水 70.0-88.0。
本发明提供的用于治疗急性肾衰的药物组合物，其组分优选重量比为20％香丹注射液 15.0～20.0甘氨酸 2.0～4.0生理盐水 75.0～85.0。
本发明提供的用于治疗急性肾衰的药物组合物，其组分优选重量比为20％香丹注射液 20.0甘氨酸 2.2生理盐水 80.0。
组合物中20％香丹注射液是由原生药丹参、降香配制而成，可用市售香丹注射液，也可通过以下步骤获得由丹参的酚酸类提取物精制液的0.2-4.0％、降香的蒸馏液0.2-4.0％，滴注液常规辅料的一定比例组成。在制备过程中，取丹参水煎煮，浓缩水液至相对密度为1.04-1.06，再冷却至50度左右，加入一定量的明胶溶液，直至不产生沉淀为止，将上清液浓缩至相对密度为1.15-1.17时，加入乙醇达50-60％，然后于室温条件下静置并过滤，滤液回收乙醇后的浓缩液，加注射用水稀释至1ml相当于丹参生药1-3g，过滤后再调节pH至酸性，用等量的醋酸乙酯萃取多次，合并醋酸乙醋萃取液，回收醋酸乙醋，得丹参酚酸提取物浸膏，加注射用水稀释至相当于含丹参生药3g，加入若干倍量的注射用水于室温条件下静置后，过滤去除沉淀，滤液加热浓缩至1ml相当于含丹参生药10g，再过滤去除沉淀，加入活性炭，加热煮沸，制得丹参苯酚酸提取物精制液。
蒸馏降香，蒸馏液至1ml相当于含降香生药0.5g，低温静置后除去油层，水层重蒸馏，收集重蒸馏液至1ml相当于含降香生药2.5g。
把所取得的丹参酚酸类提取物精制液、降香蒸馏液，与滴注液常规辅料混合，调节PH至弱酸性即为香丹注射液。
本发明的另一个目的是提供上述组合物在制备预防或治疗缺血导致的急性肾功能障碍的药物中的应用。
由本发明提供的组合物制备的药物，为下列之一的剂型注射剂、粉剂、片剂、胶囊。
本发明由于采用上述方案，因而具有以下优点1.本发明的组合物对肾缺血再灌注损伤具有保护作用。
实验研究表明本发明的组合物能增加缺血性肾功能障碍时的肾小球滤过率，尿流率；减缓血肌酐和尿素氮升高；减轻肾小管细胞损伤程度。
2.本发明的组合物可以避免单种甘氨酸用于预防和/或治疗急性肾功能障碍时甘氨酸用量过高存在潜在肾毒性。
3.本发明使用的各种组成成分来源丰富，价格实惠。
4.本发明的组合模式较新。
具体实施方案为了更好地理解本发明的实质，下面将本发明的氨基酸组合物对肾功能保护的实验以及结果来说明其用途，但这些具体实施方案不是要以任何方式限制所要求保护的发明范围。
实施例1香丹注射液制备称取丹参10g、降香10g，取丹参水煎煮，浓缩水液至相对密度为1.04-1.06，再冷却至50度左右，加入一定量的明胶溶液，直至不产生沉淀为止，将上清液浓缩至相对密度为1.15-1.17时，加入乙醇达50-60％，然后于室温条件下静置并过滤，滤液回收乙醇后的浓缩液，加注射用水稀释至1ml相当于丹参生药1-3g，过滤后再调节pH至酸性，用等量的醋酸乙酯萃取多次，合并醋酸乙醋萃取液，回收醋酸乙醋，得丹参酚酸提取物浸膏，加注射用水稀释至相当于含丹参生药3g，加入若干倍量的注射用水于室温条件下静置后，过滤去除沉淀，滤液加热浓缩至1ml相当于含丹参生药10g，再过滤去除沉淀，加入活性炭，加热煮沸，制得丹参苯酚酸提取物精制液。
蒸馏降香，蒸馏液至1ml相当于含降香生药0.5g，低温静置后除去油层，水层重蒸馏，收集重蒸馏液至1ml相当于含降香生药2.5g。
把所取得的丹参的酚酸类提取物精制液0.2-4.0％，降香蒸馏液0.2-4.0％，与滴注液常规辅料混合，调节PH至弱酸性即为香丹注射液。
本发明的组合物配制取20％香丹注射液20ml，然后再与甘氨酸2g、生理盐水80g配制成本发明组合物。
实施例2称取甘氨酸1g丹参10g、降香10g、生理盐水80g；参照实施例1的方法先把丹参与降香制成浓度为20％的香丹注射液，取20％香丹注射液20ml，然后再与甘氨酸、生理盐水配制成本发明组合物。
实施例3称取甘氨酸0.5g、丹参10g、降香10g、生理盐水80g；参照实施例1的方法先把丹参与降香制成浓度为20％的香丹注射液，取20％香丹注射液20ml，然后再与甘氨酸、生理盐水配制成本发明组合物。
实施例4称取甘氨酸2.2g丹参10g、降香10g、生理盐水80g；参照实施例1的方法先把丹参与降香制成浓度为20％的香丹注射液，取20％香丹注射液20ml，然后再与甘氨酸、生理盐水配制成本发明组合物。
实施例5组合物对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用实验方案 健康成年雄性Wistar大鼠40只，体重(250±18)g。随机分A组假手术组，B组对照组，C组香丹甘氨酸治疗组，D组香丹治疗组，E组甘氨酸治疗组。每组8只。
2％戊巴比妥钠60mg/kg腹腔注射麻醉。左股静脉插管，接微泵持续输注生理盐水，速度7ml/h维持1.5h。膀胱造瘘，接以预先称重1.5ml微量离心管，收集尿标本，计算尿流率。输注液体1h后，行腹部正中切口，无损伤动脉夹阻断双肾蒂30min。假手术组不夹闭。在开放肾血流前8min，A和B组注射生理盐水、C组注射香丹甘氨酸合剂(组合物)(20％香丹、2％甘氨酸)、D组注射香丹注射液(20％香丹)、E组注射2％甘氨酸，注射量各5ml。后继续相应的注射液7ml/h维持1h，于再灌注30、60、90、120min留取尿标本，2h时断尾取血0.5ml。再灌注24h时，取门静脉血3ml，切取双肾。血标本离心后-20℃冻存。测定血清和尿液的肌酐、尿素氮浓度。计算出2h尿肌酐排出、120min内生肌酐清除率、尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶测定评估肾小管的损伤程度。肾脏标本10％中性甲醛固定，HE(苏木素—伊红)常规染色，常规光镜检查，按Paller标准评分。透射电镜检查肾脏去包膜，矢状面切成1mm厚的组织切片，置4％戊二醛液中4℃固定，超薄切片作透射电镜观察其超微结构变化。免疫组化检测iNOS蛋白的表达。
通过对上述4组不同配比的组份所制备所得的用于治疗急性肾衰的组合物，应用于动物实验，所得结论具有较大差异，其中第4组所列组份组成的组合物具有较好的实验效果，通过实验可以如下实验结果。
结果如下1.尿量的变化在再灌注30min时尿量3组无显著性差异。对照组在再灌注60min开始尿量明显增加，90、120min与假手术组比较有显著性差异。香丹甘基酸合剂治疗组(C组)在60min开始尿量明显增加，高于其他组；30、60、90、120min时与其他组比较有显著性差异。香丹治疗组(D组)在再灌注60min开始尿量明显增加，与对照组比较差异无显著性。甘基酸治疗组(E组)在再灌注60min开始尿量明显增加，30、60min时与对照组比较有显著性差异，90、120min时与对照组比较差异无显著性。2小时总尿量，C组与其他组比较差异有显著性，B、D、E组间差异无显著性。见表1。
表1.大鼠急性缺血再灌注后尿量(ml)的变化组别 30min 60min 90min 120min 2h总量A0.20±0.140.21±0.140.19±0.120.17±0.120.77±0.19B0.22±0.170.65±0.200.60±0.100.47±0.181.94±0.20C0.39±0.132.19±0.941.77±0.750.83±0.335.18±1.88D0.17±0.160.83±0.230.77±0.240.47±0.182.23±0.66E0.36±0.161.10±0.350.91±0.270.56±0.282.93±0.862.再灌注2、24h血肌酐、尿素氮浓度的变化对照组(B组)与假手术组(A组)比较，2、24h血肌酐、尿素氮浓度B组高。香丹甘氨酸治疗组(C组)，2、24h血肌酐低于B、D、E组，有显著性差异。2、24h血尿素氮低于B、D、E组，有显著性差异。香丹治疗组(D组)与对照组比较，2h血肌酐、尿素氮差异有显著性。24h血肌酐、尿素氮差异无统计学意义。甘氨酸治疗组(E组)与对照组比较，2h、24h尿素氮差异有显著性。2h、24h血肌酐与对照组比较差异无显著性。见表2。
表2大鼠急性缺血后血肌酐和尿素氮的变化组别 2h Cr 2h BUN 24h Cr 24h BUN(μmol/L)(mmol/L) (μmol/L)(mmol/L)A103.76±12.638.10±2.20 75.68±15.02 8.38±2.97B140.18±10.4213.10±1.53115.51±14.4717.24±3.09C122.43±18.4717.20±1.6695.01±22.09 11.76±3.23D125.96±13.3910.81±2.39100.95±13.7414.83±2.63E131.33±12.0417.95±1.53104.83±26.0110.74±2.213.2h尿肌酐排出，120min内生肌酐清除率变化对照组(B组)与假手术组(A组)比较，2h尿肌酐排出，120min内生肌酐清除率不B组低。香丹甘氨酸治疗组(C组)，2h尿肌酐排出，120min内生肌酐清除率低于B、D、E组，有显著性差异。香丹治疗组(D组)与对照组比较，2h尿肌酐排出，120min内生肌酐清除率差异有显著性。甘氨酸治疗组(E组)与对照组比较，2h尿肌酐排出，120min内生肌酐清除率差异有显著性。见表3。
表3大鼠急性缺血后尿肌酐排出和内生肌酐清除率的变化组别2h肌酐排出 2h肌酐清除率(nmol/min) (μl/min)A 49.15±2.98 476.97±38.94B 31.71±1.64 227.19±17.93C 49.23±5.83 414.07±96.51D 43.95±2.80 352.55±43.19E 42.18±5.41 324.84±57.164.尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)的变化对照组(B组)与假手术组(A组)比较，B组60min 120min尿液NAG活性明显增高，差异有显著性。香丹甘氨酸治疗组(C组)与B组比较，60min120min尿液NAG活性明显降低，差异有显著性。C组与D、E组比较，60min120min尿液NAG活性差异无显著性。香丹治疗组(D组)、甘氨酸治疗组(E组)与对照组比较，60min 120min尿液NAG活性明显降低，差异有显著性。见表4。
表4大鼠急性缺血后尿NAG活性的变化(U/L)组别 60min 120minA5.80±1.74 6.17±1.94B48.50±5.5149.67±7.20C19.33±1.9719.17±2.14D19.25±1.7118.75±0.96E21.00±3.7420.00±1.835.肾组织学检查假手术组(A组)大鼠肾脏HE切片未发现明显的形态学改变。光镜下对照组(B组)近曲小管上皮细胞空泡变性和坏死，肾小管腔扩张，内可见管型和坏死脱落的细胞损伤累及近曲小管所有细胞；可见明显管周血管的扩张淤血间质中性粒细胞浸润。香丹甘氨酸治疗组(C组)、香丹治疗组(D组)、甘氨酸治疗组(E组)近曲小管上皮细胞部分肿胀、颗粒变性和小空泡变性罕见细胞坏死和管型。三组中以C组损伤程度最轻，E组居中，D组最重。Paller评分C组低于对照组(103.9±13.2vs 172.6±16.5，p＜0.01)。
6.肾组织透射电镜检查对照组(B组)线粒体明显肿胀变形，细胞内排列不整齐，嵴稀疏断裂，排列紊乱，有的已失去正常内部结构而成为均匀的一团，基底褶及刷状缘微绒毛减少消失，细胞浆内变性严重，区域溶酶体增多，粗面内质网扩张成大小不一的囊泡。香丹甘氨酸治疗组(C组)、香丹治疗组(D组)、甘氨酸治疗组(E组)线粒体轻度肿胀，嵴损伤较轻，细胞内排列整齐，细胞基部可见质膜反褶，细胞游离缘微绒毛丰富，个别细胞溶酶体略多，内质网和高尔基体轻度扩张或正常。三组中以C组损伤程度最轻，E组居中，D组最重。
7.肾组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平的变化用免疫组化技术检测发现，iNOS表达细胞在胞质或胞核中着色，呈弥漫性或棕黄色颗粒。对照组(B组)与假手术组相比iNOS表达明显增加，而香丹甘氨酸治疗组(C组)、香丹治疗组(D组)、甘氨酸治疗组(E组)iNOS表达明显低于对照组，三组中以C组表达水平最低，E组居中，D组最高。采用高倍视野记数法结果显示对照组iNOS蛋白免疫反应强度明显高于假手术组(3.55±0.62 vs 1.04±0.31 P＜0.01)，而C组iNOS蛋白免疫反应强度明显低于对照组(1.79±0.75 vs 3.55±0.62，p＜0.05)。iNOS是引起缺血性肾损害发生的的重要因子。本合剂的保护机制之一可能是通过抑制iNOS蛋白表达起保护作用。
综上实验结果可知，香丹甘氨酸组合物能增加缺血性肾功能障碍时的肾小球滤过率，尿量；减缓血肌酐和尿素氮升高；减轻肾小管细胞损伤程度；减低肾小管细胞iNOS蛋白表达。本发明的组合物对肾缺血再灌注损伤具有保护作用。本发明组合物具有良好的开发和临床应用前景。
当然，上述所列例子只是本发明所列举的具体实施例，显然，本发明包括但并不限于上述实施例，只要本领域普通技术人员从本发明中不再需要创造性劳动即可获取的所有情形，都应当列入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种用于治疗急性肾衰的药物组合物，其特征是由香丹注射液、甘氨酸、生理盐水组成，各组分的重量比为20％香丹注射液 10.0-25.0甘氨酸 1.0-5.0生理盐水70.0-88.0。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗急性肾衰的药物组合物，其特征是其组分重量比为20％香丹注射液 15.0～20.0甘氨酸 2.0～4.0生理盐水75.0～85.0。
3.根据权利要求1或2任一所述的药物组合物，其特征是其组分的优选重量比为20％香丹注射液 20.0甘氨酸 2.2生理盐水80.0。
4.根据权利要求1或3任一所述的一种用于治疗急性肾衰的药物组合物在制备急性肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
5.根据权利要求5所述的一种用于治疗急性肾衰的药物组合物在制备预防或治疗肾缺血再灌注损伤的药物中的应用，其特征是所述的药物为下列之一的剂型注射剂、粉剂、片剂、胶囊。
全文摘要
本发明提供一种用于治疗急性肾衰的药物组合物，由重量比为10.0－25.0的香丹注射液、1.0－5.0的甘氨酸、70.0－88.0的生理盐水组成。本发明组合物对急性肾脏缺血再灌注损伤的病人，具有良好预防和/或治疗作用，适用于制备预防和/或治疗由缺血导致的急性肾功能障碍的药物，包括注射剂、粉剂、片剂、胶囊等多种剂型。本发明的组合物可以避免单种甘氨酸用于预防和/或治疗急性肾功能障碍时甘氨酸用量过高存在潜在肾毒性。实验研究表明本发明的组合物能增加缺血性肾功能障碍时的肾小球滤过率，尿流率；减缓血肌酐和尿素氮升高；减轻肾小管细胞损伤程度。可用于预防和/或治疗由缺血引起的肾功能障碍等疾病。
文档编号A61K9/10GK1720959SQ20051005046
公开日2006年1月18日 申请日期2005年6月27日 优先权日2005年6月27日
发明者谢立平 申请人:浙江大学, 江志祥