低剂量促红细胞生成素用于刺激内皮祖细胞、器官再生以及减缓末端器官损伤进程的应用的制作方法

专利名称：低剂量促红细胞生成素用于刺激内皮祖细胞、器官再生以及减缓末端器官损伤进程的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及促红细胞生成素(EPO)(特别是低剂量)的单独应用或是与其它化学、热力、机械以及生物制品的联合使用，用于诱导内皮祖细胞的生理迁移、增殖和分化，用于刺激血管生成，用于治疗与内皮祖细胞机能障碍相关的疾病，以及生产治疗这些疾病的药物组合物，此外还可以用于生产含有EPO和其它适合的活性成分的药物组合物，用于刺激内皮祖细胞、器官保护作用和器官再生(特别是促进新血管和组织的生成)以及减缓器官损伤的发展。
本发明还涉及EPO(特别是本发明提出的低剂量的EPO)和/或其它适合的活性物质在美容处理方面的应用(特别是外用)，即对于人或动物的“美容护理”，特别是用于预防或减少皱纹和细纹，增强结缔组织，护肤和紧肤(特别是面部肌肤)，抵御有害的环境因素，以及用作化妆品的粉底。此外，本发明的EPO的外用还能阻止老年斑的形成和进一步发展，改善肤质，支持细胞复壮过程以及加快头发生长速度。
本发明还涉及EPO，特别是低剂量的EPO，特别是以后面“与本发明要求相符的EPO剂量”这一段落中所规定的剂量EPO，用于生产适合以EPO在人体或动物体内的自然生理节律的方式使用的药物组合物的应用。人体内源性EPO在下午较晚的时候有一个峰值(每天的最高值)，因此前述的创造性的低剂量EPO最好在上午，特别是在上午6:00～10:00的时段内使用，从而达到最大的生物学和治疗效果。在这个时段内，EPO以单一剂量或多种剂量使用。根据本发明，基于过去所有的使用案例，单一剂量或多种剂量的使用被认为是特别适合的，尤其是在人体和动物体或者细胞的美容和治疗方面。
根据本发明，在EPO应用的另一个实施例中，在以低剂量EPO、特别是创造性的低剂量EPO进行体外预培养后，内皮祖细胞和其它可用作细胞治疗的细胞群共同使用，或者在体内局部或系统使用低剂量、特别是本发明的低剂量EPO，通过该方法以确保可用于细胞治疗的组织细胞充分结合到血管系统。因此，本发明还涉及EPO(特别是低剂量的EPO)在体内与内皮祖细胞和至少一种细胞治疗的细胞群的联合应用，特别是在上午6:00～10:00的时段内，以增加可用于细胞治疗的细胞群的沉淀，从而充分地结合到血管系统。本发明还涉及EPO在体外的应用，特别是在低剂量下，用于与内皮祖细胞和至少一种可用于细胞治疗的细胞群的培养，以促进可用于细胞治疗的细胞群的沉淀，从而充分的结合到血管系统。
本发明还涉及EPO，特别是低剂量的EPO的应用，特别是用于生产可预防或治疗疾病的药物组合物或试剂盒，或者在移植或植入的过程中，连续地或按时间先后顺序地与至少一种其它的化学、热力、机械或生物制品(特别是一种药理学活性物质)联合使用，以提升内皮祖细胞的数量和功能，和/或促进再生，或者是减缓组织损伤的发展。
本发明还涉及EPO的应用，特别是在生产预防或治疗疾病的药物组合物或试剂盒方面的应用，或者在移植或植入的过程中，特别是低剂量的情况下，连续地或按时间先后顺序地使用EPO以及至少一种其它的化学、热力、机械或生物制品，特别是一种药理学活性成分一起使用，以提升内皮祖细胞的数量和功能和/或刺激再生，或者是减缓组织损伤的进程。
因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及连续地、按时间先后顺序地或同步地使用低剂量的EPO以及一种或多种其它的药物活性物质，例如VEGF，GM-CSF，M-CSF，血小板生成素，SDF-1，SCF，NGF，PIGF，HMG共还原酶抑制剂，ACE抑制剂，AT-1阻断剂和NO供体，通过这种方式可以提升内皮祖细胞的数量及功能，和/或诱导再生，或者是减缓组织损伤的进程。关于这一点，本发明的目的是影响以下过程A)优化骨髓内或干细胞的特定组织小环境中干细胞和/或内皮祖细胞的数量和质量；B)干细胞和/或内皮祖细胞从骨髓或其它“干细胞”小环境向外周血中的迁移；C)优化在外周血中和/或体外选择性培养条件下，最好是在氧浓度为0.1～10％的低氧条件下，干细胞和/或内皮祖细胞的数量和质量；D)干细胞和/或内皮祖细胞向损伤部位的定位；E)干细胞和/或内皮祖细胞向靶组织的黏附和迁移；F)内皮祖细胞引导的新血管生成。
因此，本发明还涉及连续地、按时间先后顺序地或同步地使用低剂量EPO，可以是体内的或体外的，必要的话可同时使用一种/多种化学、热力、机械或生物制品，通过这种方式提升内皮祖细胞的数量和功能，和/或诱导再生，或减缓组织损伤的进程。上文中已描述了的一个可选的和较好的应用方法，是以适合内源性EPO产生的自然生理节律的方式，即在上午6:00～10:00这一时段内使用EPO。
本发明还涉及低剂量EPO的应用，用于刺激内皮祖细胞的生理迁移、增殖和分化，刺激血管生成，治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病，以及用于生产治疗这些疾病的药物组合物，该含有EPO以及其它用于刺激内皮祖细胞的适当的活性成分的药物组合物，适用于具有以下症状的病人a)内皮祖细胞功能障碍；b)具有至少一种心血管危险因子，例如高血压、高胆固醇血症、非对称二甲基精氨酸(ADMA)水平升高、胰岛素抵抗、高同型半胱氨酸血症；和c)至少一种末端器官损伤，如左心室肥大，微量白蛋白尿，认知功能障碍，颈动脉内膜中层增厚，蛋白尿或肾小球滤过率(GFR)＜80ml/min，特别是30，最好是40～80ml/min。本发明涉及前述低剂量EPO在上面a)到c)所描写的患者群的应用，在一个实施例中，适合使用EPO的时段是上午的6:00～10:00。
背景技术：
血管内皮层是衬附于血管内壁的一层细胞。内皮层使血液与其他血管层分隔。但是，内皮层不仅是一个完全被动的屏障，它还活跃地参与血管舒缩状态的调节。这种功能也被称为内皮依赖性血管扩张。因为其位置，内皮层始终承受着血液流动的压力以及新陈代谢的压力。在致病条件下，例如高血液压力，高LDL水平，非对称二甲基精氨酸(其作为NO合成酶的内源性抑制剂)水平升高，高胆固醇血症，肾功能受限至肾小球滤过率在30、特别是40～80ml/min，胰岛素抵抗，或高血糖，经常可以导致内皮层功能缺失，随后可能会发生形态学上可检测到的损伤，例如动脉粥样硬化斑的形成，和/或更进一步的末端器官损伤，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，蛋白尿，神经疾病或微循环损伤。内皮功能变化或减弱、以及内皮功能障碍的非常早期的信号是内皮依赖性血管舒张降低。
在冠心病的情况下，或者无冠心病而危险因子存在的情况下，特别是高血压，肾功能受限，高脂蛋白血症，高同型半胱氨酸血症，胰岛素抵抗或糖尿病，内皮功能缺失明显表现为NO(内皮细胞源性舒张因子)生成减少和内皮素生成增加。高血浆内皮素水平导致细胞的异常增生、炎症、血管瘤和严重的血管变窄。内皮功能障碍还表现为ICAM-1和VCAM-1之类黏附分子生成的增加，导致血小板和单核细胞对内皮黏附程度增加，从而导致了血管压力的增加。在各种不同系统中，这种不均衡促进了血管收缩、黏附、聚集、血液凝固，动脉粥样硬化以及粥样动脉血栓塞症的发生。甚至连精神压力导致的内皮功能障持续长达4个小时。
内皮细胞也参与新血管的生成。血管生成在很多过程中都是非常重要的，例如胚胎形成、女性生殖周期、创伤愈合、肿瘤生长以及缺血区域的新血管生成。最初，出生后的血管构建主要是血管新生过程。血管形成可以理解为由已存在的血管系统以毛细血管出芽的方式形成新血管的过程。在血管形成过程中，首先是环绕在血管周围的基底膜被蛋白水解酶降解，然后血管周围的细胞外间质被分割成碎块。血管形成刺激因子的释放导致已分化的内皮细胞向趋化刺激因子迁移，在该过程中它们同时进行增殖和变异。然后相邻内皮细胞环接并形成具有毛细血管基本结构的新血管管腔。随后开始了新的基底膜的合成。
然而，近期的研究显示，成人机体的新血管形成不仅依赖于脉管生成机制，而且还依赖于血管生成机制。众所周知，在血管生成过程中，新血管由内皮祖细胞在原位分化而形成。血管生成局限于胚胎形成过程中的理论被在健康的人和动物外周血中发现内皮祖细胞(EPC)的事实驳倒。通过动物模型证实，来源于骨髓的内皮祖细胞活跃地参与了新血管形成。同时还发现，一个表达内皮细胞特异性抗原的特异性CD34+白细胞亚群在缺血区域形成。此外，对成年机体内血管形成起重要作用的内皮祖细胞可以通过体外培养CD133+和CD34+细胞获得(Asahara et al.，Science，275(1997)，964-967；Corsby et al.，Circ.Res.，87(2000)，728-730；Gehling et al.，Blood，95(2000)，3106-3112)。此外还发现，单独注射CD34+细胞或经培养的内皮祖细胞能加速糖尿病鼠的血流恢复(Schatteman et al.，J.Clin.Invest.，106(2000)，571-578)以及改善体内新血管生成(Asahara et al.，Circ Res.，85(1999)，221-228；Crosby et al.，Circ.Res.，87(2000)，728-730；Murohara et al.，J.Clin Invest.，105(2000)，1527-1536)。还有资料显示，CD34+细胞诱导的新血管生成能增强心脏功能(Kocher et al.，Nat.Med.，7(2001)，430-436)。除CD34+细胞之外，相应地分化转化后的CD34-单核血细胞也能作为内皮祖细胞的来源。
然而，内皮祖细胞迁移和分化的机理尚未完全阐明。分子生物学和细胞生物学的研究显示，不同的细胞活素类和血管新生因子对骨髓中的内皮祖细胞的迁移具有促进作用。例如，众所周知的如VEGF和GM-CSF之类的促血管新生因子能增加内皮祖细胞的数量(Asahara et al.，EMBO，J.，18(1999)，3964-3972；Takahashi et al.，Nat.med.，5(1999)，434-438)。VEGF(血管内皮生长因子)是一种存在多种异构体的蛋白，它能与两种酪氨酸激酶受体VEGF-R1(flt1)和VEGF-R2(fit2)结合，这两种受体可存在于正生长的内皮细胞的表面(Wernert et al.，Angew.Chemie，21(1999)，3432-3435)。VEGF受体通过Ras-Raf-Map激酶途径激活，导致在内皮细胞或内皮祖细胞表面上蛋白激酶和特异粘合素的表达，并最终导致这些细胞向脉管生成促进因子的增殖和迁移。GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)是迄今已知的主要用于刺激白血球(包括嗜中性粒细胞，巨噬细胞和嗜酸性粒细胞)的细胞因子。PIGF(胎盘生长因子)已知是一种内皮祖细胞的迁移刺激因子而不是增殖刺激因子。根据Llevadot等人的研究(J.Clin.Invest.，108(2001)，399-405)，HMG-CoA还原酶抑制剂，尤其是作为降脂药物使用并且能降低冠心病发病率和死亡率的他仃类降脂药物，能够促进内皮祖细胞的迁移。Dimmeler等人的研究(J.Clin.Invest.，108(2001)，391-397)进一步显示象阿托伐他汀和辛伐他汀等的他仃类降脂药物显著提高了在单核细胞中内皮祖细胞及外周血中分离得到的CD34+干细胞的分化(体内和体外)。例如，用他仃类药物处理小鼠，可导致已分化的内皮祖细胞数量增加，而且，他仃类降脂药物显示出和VEGF同样强的作用。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供手段和方法，用于提高对内皮祖细胞的刺激作用和治疗机体功能障碍、特别是和内皮祖细胞相关的功能障碍，还在于提供用于不同组织的保护和再生的方法和手段。
为解决这些技术问题，本发明指出，促红细胞生成素(EPO)和/或其衍生物，特别是低剂量的EPO，可以用于刺激人体或动物体内的内皮祖细胞的生理迁移，内皮祖细胞的增殖，内皮祖细胞向内皮细胞的分化，和/或内皮祖细胞向脉管生成和/或血管生成刺激因子的迁移。对于内皮祖细胞的迁移和/或分化的创造性的刺激再次提出了一种重要的新治疗策略，用于增加出生后的新血管生成、特别是脉管生成，用于治疗与内皮祖细胞和/或内皮细胞功能障碍相关的疾病，以及通过化学、热力、机械和生物制品用于受损的不同组织的保护和再生。
本发明所解决的技术问题还包括，低剂量的EPO和/或其衍生物用于治疗与内皮祖细胞和/或内皮细胞相关的疾病或病理状态的应用。
此外，本发明所解决的技术问题还包括，低剂量的EPO和/或其衍生物用于处于病态的不同组织类型的保护和再生、或治疗与不同的组织功能障碍相关的病理状态的应用。
通过连续地、按时间先后顺序地或同步地使用低剂量的EPO以及一种或者多种其它的化学、热力、机械或者生物制品还解决了潜在的技术问题。
因此，本发明特别涉及下列A)～K)的单独或组合的实施例A)EPO的应用，优选的是用于生产预防或治疗疾病的药物组合物，其中所述EPO和/或药物组合物适合于在上午6:00～10:00的时段内用于人或动物体内。
B)EPO的应用，优选的是与实施例A)相结合，特别是用于生产预防或治疗疾病的药物组合物，其中所述药物组合物是低剂量的，适合用于预防或治疗具有以下病理表现的人或动物a)至少一种内皮祖细胞功能障碍，b)至少一种心血管危险因子，例如高血压、高脂蛋白血症，胰岛素抵抗、ADMA水平升高或高同型半胱氨酸血症，和c)至少一种末端器官损伤，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，认知功能障碍，颈动脉内膜增厚，蛋白尿或肾小球滤过率＜80ml/min、特别是30～80ml/min。
C)EPO的应用，优选的是与实施例A)、B)或A)和B)相结合，用于人或动物的美容护理，特别是用于去除皱纹，增强结缔组织，护肤和紧肤，免受有害环境因素影响，去除老年斑，促进表皮再生，加快头发生长速度和/或作为化妆品的粉底。
D)EPO的应用，优选的是与实例A)，B)或A)和B)相结合，用于生产化妆品，特别是外用的化妆品，用于人或动物的美容护理，特别是用于去皱，增强结缔组织，护肤和紧肤，免受有害环境因素影响，去除老年斑，促进表皮再生，加快头发生长和/或作为化妆品的粉底。
E)EPO的应用，优选的是与实施例A)，B)，C)或D)中的任一种或多种相结合，用于生产含有EPO和由内皮祖细胞与至少一种可用于细胞治疗的细胞群的混合物组成药物组合物，用于人或动物的组织或器官的再生，其中所述混合物在使用前即与EPO在体外进行接触。
F)EPO的应用，优选的是与实施例A)，B)，C)，D)或E)中的任一种或多种相结合，和/或一种由内皮祖细胞与至少一种可用于细胞治疗的细胞群组成的混合物的应用，用于生产一种含有EPO和由内皮祖细胞与至少一种可用于细胞治疗的细胞群组成的混合物的药物组合物，其中EPO在人体或动物体的使用在所述混合物之前、之后或同时使用。
G)EPO的应用，优选的是与实施例A)～F)中的任一种或多种相结合，和/或至少一种化学、热力、机械或生物制品，特别是一种药物活性成分的应用，用于生产含有EPO和至少一种化学、热力、机械或生物制品、用于预防和或治疗疾病的药物组合物或试剂盒，其中所述的药物组合物适合用于连续地，按时间先后顺序地或者同时地使用EPO以及至少一种化学、热力、机械或生物制品。因此，本发明还涉及以上文G)所描述的方式使用EPO，其中所述机械制品为人工假肢，优选用作替代牙齿、骨骼或者韧带/腱的植入支持物。因此，本发明还涉及以上文G)所描述的方式使用EPO，其中所述生物制品为实体器官，例如肝脏、肾脏、心脏、胰腺或皮肤。在这个意义上，头发移植体也可以被理解为生物制品。在一个特别优选的实施例中，本发明还涉及EPO用于生产药物组合物或试剂盒，该药物组合物或试剂盒可系统使用，也可在前述形式的生物制品或人工假肢的植入位点局部使用，所述人工假肢可以是牙齿的植入支持物，牙齿替代物，牙齿植入体，骨骼替代物，骨骼植入体(例如髋关节修补物)，韧带/腱替代物(例如交叉韧带)，其中所述EPO在所述生物或机械制品植入前系统或局部使用，以人工假肢为例，在植入前几个星期系统或局部使用EPO，再实施植入。在另一个实施例中，所述生物或机械制品，例如人工假肢的植入，可以在使用EPO的同时进行。在另一个实施例中，EPO的使用可以在所述人工假肢或者是生物/机械制品植入之后进行。根据这些实施例，将要植入如牙齿或骨骼修补物的植入体的组织或机体结构被动员和调节，这样可以使生物或机械制品(例如植入体)更好、更快的融合，例如通过长在机体结构之上或之内。
H)根据A)～G)中的一个或多个实施例的EPO的应用，其中所述药物组合物在使用过程中不会导致人或动物血球比容值的增加，特别是不超过EPO使用前血球比容值的10％。
I)根据A)～H)中的一个或多个实施例的EPO在药物组合物中的应用，其中所述EPO适合用于所述疾病的预防、处理和治疗，以一个不会激活红血球生成的低剂量应用，特别是0.001～90IU/kg人体体重/周，优选的是50IU/kg人体体重/周。
K)根据A)～I)中的一个或多个实施例的EPO的应用，其中所述病变可以是高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抵抗，内皮介导的慢性炎症，内皮增生(包括网状内皮增生)，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性病变，子痫前症，雷诺氏症，肝脏疾病(如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭)，骨骼和软骨失调或损伤，粘膜失调或损伤(特别是在胃肠道中)，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭，特别是晚期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高或创伤及其后遗症。
本发明还涉及含有EPO，内皮祖细胞以及至少一种可用于细胞治疗的细胞的试剂盒的生产，其中所述的EPO优选的以低剂量存在。
本发明中，令人惊奇的发现，低剂量EPO可导致内皮祖细胞的生理迁移，同时增加循环内皮祖细胞的数量，并诱导其分化。除此之外，在这种病理条件下出现的内皮祖细胞功能不足得到了补偿。根据本发明，晚期的慢性肾衰竭患者体内的循环干细胞数量虽然和健康的试验人员一样多，但是这些患者体内的干细胞丧失了经内皮祖细胞分化为内皮细胞的能力。因此，和健康的试验人员相比，慢性肾衰竭患者体内能够黏附并且表现出内皮细胞显型的细胞数量明显减少(de Groot et al.，Kidney Int.2004；66641-6)。肾小球滤过率为30、主要是40～80ml/min的中度肾功能受限患者即可表现出这种内皮祖细胞功能下降。根据本发明，在使用本发明的低剂量EPO后，无论是肾功能障碍的患者还是肾功能正常的患者和/或试验人员体内，循环干细胞的数量都显著增加了50％以上。尤其是内皮显型的细胞数量显著增加。细胞培养试验结果显示，应用低剂量EPO处理后，肾小球滤过率为30、特别是40～80ml/min的慢性肾衰竭患者体内内皮祖细胞减弱了的粘附能力增加了3倍。对于肾健康的试验人员和/或患者，其黏附能力则增加了2～3倍。已分化的内皮祖细胞以及内皮细胞的黏附能力是形成新的组织和/或血管的基本先决条件之一。通过这个方式，EPO能够诱导组织或器官中的新血管生成、特别是血管生成，在这里肾脏是一个特例，在肾脏中对应血管生成或脉管生成的刺激被释放了。
根据本发明，在人或动物体内，特别是在成熟的机体内，低剂量EPO可以刺激内皮祖细胞的生理迁移，内皮祖细胞的增殖，诱导内皮祖细胞分化成为内皮细胞，和/或诱导内皮祖细胞迁移以利于血管生成和血管新生。在这个意义上讲，根据本发明，低剂量EPO利于刺激发生血管病变的组织或器官中通过新血管生成作用刺激新血管形成。此外，也可以通过使用低剂量EPO对内皮祖细胞的刺激来诱导形成内皮组织。根据本发明，低剂量EPO因此也可以用于治疗人或动物与内皮祖细胞和/或内皮细胞功能障碍相关的各种疾病。表现出这种功能障碍的患者群体通常具有某些心血管风险因子，例如高血压、高胆固醇血症、胰岛素抵抗、高同型半胱氨酸血症、ADMA水平升高，以及末端器官损伤，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，蛋白尿或肾小球滤过率(GFR)为30ml/min、特别是40～80ml/min。
本发明还涉及低剂量EPO在组织功能受到化学、热力、机械或生物制品危害时的保护和修复的应用。根据本发明，低剂量EPO的外用还涉及预防和减少皮肤、特别是面部肌肤上的皱纹，保护肌肤以及减少老年斑。根据本发明，这种低剂量EPO或其衍生物的使用可以与一种或者多种其它的化学、热力、机械或者生物制品持续地、按时间先后地或同步地使用。根据本发明，在治疗上，低剂量EPO可以适合其生理节奏的方式使用，以取得最大的生物学效应。在本发明的一个优选实施例中，内皮祖细胞与用低剂量EPO体外预培养后和/或在体内局部或系统使用低剂量EPO后，与其它可用作细胞治疗的细胞群同时使用，通过这种方式确保可用于细胞治疗的组织细胞的沉淀并充分的结合到血管系统上。
根据本发明，“促红细胞生成素”或“EPO”应理解为这样一种物质，其在适当的高剂量下控制干细胞的生长，由成红血球细胞向红血细胞的成熟过程。
EPO是一个糖蛋白，166个氨基酸组成，有3个糖基化位点，分子量约为34000Da。EPO诱导内皮祖细胞的分化过程中，可诱导球蛋白的合成，增加亚铁血红素复合体的合成，同时增加铁蛋白受体的数量。这样，细胞就可以携带更多的铁并合成有功能的血红蛋白。在成熟的红细胞中，血红蛋白携带氧。因此，红细胞及其所含的血红蛋白在机体供氧过程中起着关键的作用。这些过程是由EPO和内皮祖细胞表面的相应受体之间的相互作用而启动的(Graber and Krantz，Ann.Rev.Med.29(1978)，51-56)。
这里使用的术语“促红细胞生成素”包括每一种来源的EPO，特别是人和动物的EPO。这里使用的这一术语不仅包括天然存在的、即野生型EPO，还包括具有野生型EPO同样的生物学效应的EPO衍生物、类似物、修饰体、突变蛋白、突变体，或其它形式。
根据本发明，“衍生物”功能性等同物或者EPO的衍生物应该理解为，在保留了EPO基本结构的同时，通过一个或多个原子或分子基团以及残基的取代、特别是例如乙二醇之类的糖链的取代而得到，和/或氨基酸序列与天然存在的人或动物的EPO蛋白至少在一个位点上不同，但是在氨基酸水平和可比的生物学活性方面具有很高的同源度。本发明中使用的EPO衍生物可以是来源于WO 94/25055、EP 0148605B1、WO 95/05465或其他来源。
“同源性”特别的是指序列的同一性至少达到80％，优选的是达85％，最好是达到90％、95％、97％以及99％以上。因此，本领域的技术人员都知道，术语“同源性”是指两个或多个多肽分子之间关系的密切度。这种一致性可以是完全的一致，也可以是氨基酸的保守互换。
根据本发明，术语“衍生物”还包括融合蛋白，其N端或C端联结了其它蛋白的功能性区域。在本发明的一个实施例中，这个其他蛋白可以是例如GM-CSF、VEGF、PIGF、他仃类降脂药物或一种内皮祖细胞的刺激因子。在本发明的另一个实施例中，所述的其它蛋白也可以是一种对已分化的内皮细胞具有刺激作用的因子，例如血管生成素，VEGF(血管内皮生长因子)或bGFG(碱性成纤维细胞生长因子)。bGFG和VEGF这些生长因子对内皮细胞有很强的趋化作用和促有丝分裂作用。
EPO衍生物与天然EPO之间的区别可以通过突变表现出来，所述突变例如缺失、取代、插入、增加、碱基交换和/或对EPO的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列的重组。根据本发明，EPO优选为(EPO-)α，(EPO-)β，Aranesp(阿法达贝泊汀)或者CERA(持续EPO受体拮抗剂)。当然，这种区别也可以是自然发生的序列突变，例如来自其它生物的序列，或者是发生自然突变的序列或用本技术领域熟知的常规方法(例如使用化学制剂或物理制剂)在编码EPO的核苷酸序列上选择性诱导突变得到的序列。因此，根据本发明，术语“衍生物”还包括突变的EPO分子，即突变蛋白。
根据本发明，EPO的多肽或蛋白类似物也可以使用。根据本发明，术语“类似物”包括与EPO具有不同氨基酸序列的化合物，但其三级结构与EPO却非常相似，因此具有相似的生物活性。举例来说，EPO类似物可以是这样的化合物，其氨基酸残基在适合的空间构型下可以使EPO与其受体相结合，因此能够模拟EPO结合区域的基本表面特性。这类化合物在例如Wrighton等的文献(Science，273(1996)，458)中已经作了描述。根据本发明，所使用的EPO可以用很多方法生产，例如可以从正常人的尿液或再生障碍性贫血患者的尿液或血浆(包括血清)中分离得到(Miyake et al.，J.B.C.252(1977)，5558)。人EPO可以通过人体肾癌细胞的组织培养物得到(JA未审查的申请55790/1979)，从具有产生人EPO能力的人淋巴母细胞获得(JA未审查的申请40411/1982)，还可以从通过人细胞系的融合得到的杂交瘤细胞培养物中获得。EPO也可以用基因技术的方法获得，即通过基因工程方法在细菌、酵母或植物、动物或人的细胞系中通过编码相应EPO氨基酸序列的DNA或RNA来合成目的蛋白。这些方法在例如EP0148605 B2、EP0205564 B2和EP0411678 B1中已被描述。
本发明特别涉及低剂量EPO和/或其衍生物的应用，用于在人或动物(特别是在成熟机体内)，可以刺激内皮祖细胞的生理迁移、增殖、诱导内皮祖细胞分化成为内皮细胞，和/或诱导内皮祖细胞向血管生成或脉管生成刺激物的迁移。
本发明还涉及顺序连用低剂量EPO和至少一种合适的化学、热力、机械或生物制品、特别是一种药理学活性成分，从而提高内皮祖细胞的功能和数量，同时加强低剂量EPO对器官的保护和再生作用。
此外，本发明涉及连续地、按时间先后顺序地或同步地使用低剂量EPO以及一种或多种其它药理学活性物质，例如VEGF，GM-CSF，M-CSF，血小板生成素，SCF，SDF-1，NGF，PIGF，HMG辅酶抑制剂，ACE抑制剂，AT-1阻断剂以及NO供体，目的是提高内皮祖细胞的功能和数量和/或诱导组织再生以及减缓组织损伤的进展。关于这一点，本发明的目的在于影响以下进程A)优化骨髓或干细胞特定组织小环境中干细胞和/或内皮祖细胞的数量和质量；B)干细胞和/或内皮祖细胞从骨髓或其它“干细胞”小环境向外周血中的迁移；C)在外周血和/或体外选择性培养，特别是氧浓度为0.1～10％的低氧培养条件下，优化干细胞和/或内皮祖细胞的数量和质量；D)干细胞和/或内皮祖细胞在损伤部位的定位；E)干细胞和/或内皮祖细胞向靶组织黏附和迁移；F)内皮祖细胞引起的新血管形成。
本发明因此涉及低剂量EPO离体预培养后，同时或不同时间使用内皮祖细胞以及一种或多种有治疗作用的细胞群，特别是肝细胞、肌细胞、心肌细胞或胰岛移植物，和/或在体内局部或系统使用低剂量EPO，从而提高和加速这些可用于细胞治疗的细胞群的功能，定位，血管生成，以及与接受者血液循环的连接。
本发明涉及EPO(特别是低剂量)的应用，或者是用于“美容护理”的外用活性物质应用的，特别是用于预防和及时减少皱纹和细纹，增强结缔组织，护肤和紧肤(特别是面部皮肤)，阻止有害的外部环境因素，还可用作化妆品的粉底。外用EPO还可以阻止老年斑形成和进一步发展，改善肤质，促进皮肤复壮过程和再生。此外，EPO还可以加速头发生长。
本发明还涉及低剂量EPO用于生产适合以适应其生理节律使用的药物组合物的应用。内源性EPO的分泌在下午较晚的时候达到最高峰(每天的最高值)，因此低剂量EPO的使用最好在上午，特别是在6:00～10:00的时段内进行，以达到其生物学、治疗或美容的最佳效果。
本发明涉及低剂量EPO的应用，目的在于刺激内皮祖细胞的生理迁移，和/或刺激增殖和分化，和/或诱导新血管生成，和/或用于治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病，和/或用于生产治疗这些疾病的药物组合物，以及生产包括EPO和其它适合的、用于刺激内皮祖细胞的活性物质的药物组合物，针对具有以下特征的病患a)内皮祖细胞功能障碍；b)至少一种心血管危险因素，如高血压、高胆固醇血症，胰岛素抵抗或高同型半胱氨酸血症，ADMA水平升高；和c)至少一种末端器官损伤，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，认知功能障碍，颈动脉内膜增厚，蛋白尿或肾小球滤过率(GFR)＜80ml/min、特别是30、主要在40～80ml/min。
在一个优选实例中，本发明还涉及到连续地、按时间先后顺序地或同步地使用低剂量EPO以及一种或多种其它的化学、热力、机械或生物制品。通过这种方式提高内皮祖细胞的功能和增加内皮祖细胞的数量，和/或诱导再生或减缓组织损伤的进程。这些机械制品可以是人工假肢，优选用于替代牙齿，骨头或者韧带/肌腱的植入支持物。此外，所述生物制品可以是实体器官，例如肝脏、肾脏、心脏、胰腺、皮肤，甚至是头发移植物。因此，本发明提出，为了使同时、之前或之后植入的机械制品(例如人工假肢)，或生物制品更好，更快，更有效地生长和融合入周围机体组织，可以使用EPO、特别是低剂量的EPO。本发明还涉及EPO用于生产药物组合物或试剂盒的应用，用于改善，特别是提高或加快生物制品或人工假肢与周围机体组织的融合，特别是牙齿、牙齿替代物、牙齿植入物或其它人工假肢，例如骨骼替代物、骨骼植入物、特别是髋关节修补物或者韧带/肌腱替代物(例如交叉韧带)。关于这一点，如果需要，EPO可以与有细胞治疗作用的细胞群和/或内皮祖细胞联合使用。在一个更为优选的实施例中，上述EPO用于生产可以改善、提升或加快生物制品或人工假肢与周围机体组织(特别是病人的靶组织、靶标骨骼或靶标软骨)融合的药物组合物或试剂盒，此过程所使用的机械制品可以由钢，陶瓷，塑料或其它基质材料制成。此外，本发明中，成骨细胞，具有成骨潜力的细胞，血小板，血细胞或者类似制品都适合用于细胞治疗。在另外一个优选的实施例中，所述机械制品与有机黏合剂(例如纤维胶)一起包含在药物组合物或药物试剂盒中。
根据本发明，“内皮祖细胞”(EPC)应理解为在血液中循环着的，能分化成为内皮细胞的细胞。胚胎发育过程中出现的内皮祖细胞是成血管细胞。成熟机体中存在的内皮祖细胞是成血管细胞样细胞，可以通过培养单核细胞(特别是CD34+到CD14+单核细胞)获得，和/或从外周血分离得到的CD34+干细胞获得。
根据本发明，“迁移”或者“生理迁移”应理解为来自骨髓或可替代的“干细胞”小环境的干细胞和/或内皮祖细胞被生长因子激活的过程，其中干细胞或内皮细胞进入血液，特别是外周血。
根据本发明，“增殖”应理解为细胞变大并随后分裂成两个或更多子细胞的能力。因此，EPO介导的对内皮祖细胞的刺激特别地与内皮祖细胞的数量和分裂能力相关。
根据本发明，内皮祖细胞的“分化”应理解为源于骨髓或特定组织小环境的单核细胞经由内皮祖细胞发展为内皮细胞的发育过程。“内皮细胞”应理解为是形成内皮，也就是血管或血浆腔的单层细胞层的细胞。内皮细胞的特征在于能释放血管活性物质例如EDRF(内皮衍生的松弛因子)，或者是收缩物质例如内皮素，以及抑制或激活血液凝结的因子和调节血管渗透能力的因子。内皮细胞还合成内皮下连接组织的成分，特别是IV型和V型胶原蛋白，细胞粘连蛋白(例如层粘连蛋白、纤维结合素、凝血栓蛋白)，生长因子(例如平滑肌细胞生长因子)以及促进形成新血管的因子。
根据本发明，内皮祖细胞的“转移”应理解为血液中的内皮祖细胞向血管生成或血管新生刺激因子移动并在该处聚集的现象。“血管生成刺激因子”应理解为一种在人或动物体的组织或血管中的化学刺激物，可以特定地作用于内皮祖细胞，使其在体内向该化学刺激物的产生位点转移。血管生成刺激因子就是通过这种方式诱导新血管生成。“血管新生刺激因子”应理解为一种在人或动物的组织或血管中的化学刺激物，特定地作用于已分化的内皮细胞，使其在体内向该化学刺激物的产生位点转移。血管生成过程就是通过这种方式由血管新生刺激因子诱导。
在本发明的另一个实施例中，使用低剂量EPO和/或其衍生物以提高正分化的内皮祖细胞的黏附能力。根据本发明，EPO可特别用于提高内皮祖细胞的黏附(也就是细胞间的黏附)能力。正分化的内皮祖细胞或已分化的内皮细胞的黏附作用是构建新血管或形成新内皮组织的基本条件之一。细胞黏附作用是由蛋白质分子介导的。
本发明还涉及低剂量EPO用于刺激新血管构建，特别是脉管生成方面的应用。根据本发明，“脉管生成”应理解为正分化的内皮祖细胞在原位形成新血管的过程。因此，根据本发明，低剂量EPO可以刺激内皮祖细胞更活跃地参与新血管形成或者在局部形成新血管以修复受损的血管区域。因此，根据本发明，低剂量EPO或其衍生物的使用可以促进新血管构建和/或在局部形成新血管以替代受损血管。
本发明的另一个实施例中，提供了低剂量EPO和/或其衍生物用于刺激内皮祖细胞的应用，用于形成内皮组织。
在本发明的一个特别优选的实施例中，提供了低剂量EPO和/或其衍生物在人或动物体内治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的病理状态或疾病或其后遗症的应用。
根据本发明，“疾病”、“病理状态”或“紊乱”应理解为一种器官或整个机体受到损伤的生命过程，可导致主观可感受到的或客观可检测到的身体上的、情绪上的或精神上的变化。根据本发明，这些疾病特别与内皮祖细胞的功能障碍相关，即有这种功能障碍的细胞不是直接导致发病就是间接诱导发病。另外，根据本发明，应理解“疾病”、“病理状态”或“紊乱”，作为器官或整个机体受到损伤的生命过程，可以通过应用低剂量EPO或适当的活性物质来阻止，或者是减慢这些过程。这里的“后遗症”应理解为在原发疾病基础上发生的其他病变。
根据本发明，内皮祖细胞的“功能障碍”应理解为一种重要的细胞功能的损伤，例如新陈代谢能力，应激反应，运动性，分裂行为或分化行为。内皮祖细胞的功能障碍意味着，内皮祖细胞的增殖行为不完全或者不充分。由于EPO可以刺激内皮祖细胞增殖，内皮祖细胞和已分化的内皮细胞的分裂不足可以得到补偿，同时还可以增加内皮祖细胞或内皮细胞的数量。内皮祖细胞的功能障碍可以表现为这些细胞分化成内皮细胞的功能的减弱。也可以表现为其黏附能力的减弱和/或向血管新生或血管生成刺激因子迁移能力的障碍。内皮祖细胞的这些功能障碍可以削弱或阻止新血管组织形成和/或脉管生成。高血压，高脂蛋白血症，ADMA血液水平升高，尿毒症或糖尿病都可以导致内皮祖细胞功能障碍。举例来说，内皮祖细胞的功能障碍可以表现为，在NO合成酶(NOS)催化下L-精氨酸转化为NO减少，内皮素增加和/或ICAM-1和VCAM-1等血管细胞黏附分子增加。
根据本发明，与内皮祖细胞功能障碍相关的病变有高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抵抗，内皮介导的慢性炎症(例如血管炎症)，内皮增生(包括网状内皮增生)，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊乱，子痫前症，雷诺氏症，怀孕导致的高血压，急性或慢性肝衰竭、特别是末期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率在30～80、特别是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高，创伤愈合及其后遗症。
“高胆固醇血症”表现为血液中胆固醇浓度升高。初级高胆固醇血症最常见的表现形式是多基因高胆固醇血症。次级高胆固醇血症则常常伴随糖尿病，肾病综合症，甲状腺机能减退以及肝功能紊乱。
“糖尿病”是具有不同病因和症状的各种形式的葡萄糖代谢损伤。导致糖尿病在血管系统的相关并发症的主要是AGE-RAGE系统。AGE(晚期糖基化终末产物)是经过一系列复杂的多步骤反应，然后将蛋白或脂类长时间暴露在还原糖(例如葡萄糖)而形成的。AGE的形成发生在正常的老化过程中，在糖尿病和阿尔茨海默氏症患者中有所增加。结合到AGE导致了氧化应激，激活了NF-κB转录因子，从而打破了内皮系统的自我平衡。
“胰岛素抵抗”应理解为各种机体细胞的信号传输障碍，从而阻滞胰岛素的生理信号级联，受此影响的病人因此出现葡萄糖代谢障碍。
“内皮介导的慢性炎症”是指由于人或动物的机体及其组织对有害刺激的抵抗反应而导致的的紊乱或疾病。特定的信号分子改变了内皮细胞的特性，其结果就是，通过与其它细胞类型启动的相互作用使白细胞黏附在内皮细胞上，最终渗透进组织并在该处引发炎症反应。内皮介导的炎症的一个例子就是白细胞血管炎症。在内皮介导的炎症反应中起关键作用的是NF-κB转录因子。导致内皮介导的慢性炎症的另一个系统是AGE-RAGE系统。
“内皮增生”应理解为在非血小板减少性紫癜中，内皮的退化和增殖改变。“网状内皮组织增生”应理解为网状组织细胞系统疾病，例如网状组织、网状细胞增生，网状组织细胞增生和韩-薛-柯氏病(Hand-Schüller-Christian)。
“雷诺氏症”应理解为由于血管收缩(即血管痉挛)引起的阵发性缺血状态，通常发生在手指动脉。初级的雷诺氏疾病是四肢末梢部分供血小血管的单纯性功能损伤，而次级的雷诺氏疾病则伴随其它疾病，例如血管炎症。
“子痫前症”是一种母性机体的内皮和血管疾病，似乎是由来源于胎盘的内皮物质作用所引起的一种多系统功能紊乱，可导致多个器官的功能损伤，并表现出不同的症状。其特有的循环损伤是由于血管压力变化增加在局部剧烈变化所引起的。对于子痫前症的发病机理，已证实内皮功能障碍是其重要组成部分。
根据本发明，“肾衰竭”应理解为肾脏排泄尿液中所含物质的受限。到晚期，肾脏也丧失了调节电解液，水和酸碱平衡的能力。末期肾衰竭的特征是肾脏排泄和内分泌功能的崩溃。
根据本发明，肾衰竭可以是急性肾衰竭，也被称为急性肾功能不全，肾休克或精力衰竭休克。急性肾衰竭通常由一种可逆的肾损伤所引起的肾脏排泄功能突然地部分或全部丧失。其起因可能是血容量过低引起的低灌注，失血(多发伤，胃肠或产后出血，心脏、血管、腹部或前列腺部位的外科大手术)引起的低血压和脱水，休克(心肌梗塞、栓塞)，严重的感染(脓血症，腹膜炎，胆囊炎)，溶血(溶血-尿毒综合症，突发性血红蛋白尿，输血反应)，肌肉分解(挤压综合症，横纹肌分解，肌炎，烧伤)，水和电解质损失(剧烈呕吐，腹泻，过多发汗，肠梗阻，急性胰腺炎)。其它的原因则可能是肾毒性物质，例如外源性毒素如苯胺、乙二醇化合物，甲醇及类似物，或者是内源性毒素如肌血球素和草酸盐。急性肾损伤的另一个原因是肾功能紊乱，例如肾炎或肾移植后的排斥反应。急性肾衰竭也可能是由于尿流受阻导致的尿滞留所引起。根据本发明，在治疗急性肾衰竭时创造性的使用EPO、特别是低剂量EPO，可以防止或至少是减缓急性肾衰竭的发展。
根据本发明，肾衰竭也可以是慢性肾衰竭。慢性肾衰竭的起因是肾的血管，肾小球及肾小管间质性肾功能紊乱，感染以及先天性或获得性组织缺陷。慢性肾衰竭的病因除此之外还包括慢性肾小球病，慢性肾盂肾炎，止痛药性肾病，梗阻性尿路病，动脉硬化和小动脉硬化。慢性肾衰竭发展到末期就是尿毒症。根据本发明，使用低剂量EPO治疗慢性肾衰竭，可以减缓其发展进程。
本发明因此特别地涉及EPO、特别是低剂量EPO在生产药物方面的应用，所述药物可以用于防止、减少或减缓肾组织损伤，和/或促进急、慢性肾衰竭引起肾组织损伤的再生。
根据本发明，肾功能受限状态应理解为肾小球滤过率降至＜80ml/min的情况。肾功能受限涉及早期肾小球病变，肾小管间质性和血管性肾损害。根据本发明，使用低剂量EPO治疗肾功能受限可以减缓其进程或促进受损肾组织和/或功能的再生。
根据本发明，“微量白蛋白尿”应理解为一种患者排泄的尿液中自蛋白的含量超过30mg/24hr的非正常生理现象的临床表现。这种白蛋白排泄的增加是肾功能恶化的一个早期症状，是伴随肾脏结构改变的最初病理变化，随之而来的是肾脏构造的结构变化。
根据本发明，“蛋白尿”应理解为一种患者排泄的尿液中蛋白质的含量超过150mg/24hr的非正常生理现象的临床表现。这种尿液排泄的蛋白的增加(＞150mg/24hr)是病态的，需要进一步的内科检查和治疗。
根据本发明，“ADMA水平升高”应被理解为患者血中ADMA浓度超过1.3umol/l的临床症状。这种ADMA浓度升高与内皮功能障碍相关，是内皮组织新陈代谢功能障碍导致的结果。
根据本发明，“创伤愈合”应理解为受损伤组织的再生和创口愈合，特别是新结缔组织和毛细管形成的生理过程。创伤愈合涉及一期创伤愈合(初级概念的修复)，在创伤整齐的情况下，快速，无并发症的愈合，基本上完全愈合。这是由于在伤口边缘形成的新结缔组织最少，有良好的血液供应。在创伤边缘较远，特别是粉碎性或坏死性的创伤边缘，并且创伤发生感染的情况下，则需要进行后续的二期创伤愈合(次级概念的修复)。在这些情况下，肉芽组织形成并填充进缺损组织(细菌感染的结果)，形成的伤疤组织面积更大。从边缘开始的上皮形成，意味着创伤愈合完成。这种创伤愈合分为潜伏期，增殖期和修补期三个阶段。潜伏期又被分为血痂形成的渗出期(特别是创伤发生的头几个小时)和自溶分解代谢的吸收期(创伤发生后1～3天)。增殖期的特点是由成纤维细胞产生胶原蛋白进行合成代谢修复，该过程发生在创伤形成后的4～7天。修复期在创伤形成后第8天开始，其特征为肉芽组织转变为疤痕组织。
根据本发明，“创伤”应理解为伴随或不伴随物质损失的机体组织连贯性的破坏，可以由机械伤害或身体上相关的细胞损伤引起。根据本发明，创伤也是一种病变。创伤的类型包括由机械，热力，化学性因素、辐射和疾病引起的创伤。机械性创伤是由外力引起，特别是切伤和刺伤，挤压伤、割裂伤、撕裂伤以及擦伤，抓、咬伤，和射伤。热力创伤是暴露于热或冷所引起的。化学创伤主要是由于酸或碱导致的灼伤。辐射所引起的创伤是例如光化学或电离辐射导致的。疾病引起的创伤主要是充血性创伤，外伤性创伤，糖尿病性创伤等。根据本发明，使用低剂量EPO(特别是外用或静脉注射给药)，可以促进创伤修复。
本发明涉及低剂量EPO的应用，用于治疗高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抵抗，内皮介导的慢性炎症，内皮增生(包括网状内皮组织增生)，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性疾病，子痫前症，雷诺氏症，肝脏疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨质和软骨失调或损伤，粘膜失调或损伤(特别是在胃肠道中)，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭，特别是晚期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率＜80、特别30～80ml/min、优选的是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，或创伤及其后遗症。
根据本发明，给病人使用的EPO的剂量应该达到治疗上有效的剂量，即该剂量应该足以治愈一种前述的疾病(特别是与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病)，或预防该疾病的发生，停止该疾病的发展，和/或减轻该疾病的症状。给病人使用的剂量大小取决于很多因素，例如病人的年龄、体重、性别、疾病的严重程度等等。
“创造性的EPO剂量”根据本发明，上文所提出的所有应用，方法和组合物，优选使用的EPO都是少量的，少于已知的通常用于治疗肾性贫血所使用的剂量。根据本发明，特别是在体内，低剂量或用量，即对每个病人来说，EPO的剂量为1～2000，优选的是20～2000单位(IU；国际单位)/周，更优的是20～1500IU/周，更优的是20～1000IU/周，更优的是20～950IU/周，更优的是20～900IU/周，更优的是20～850IU/周，更优的是20～800IU/周，更优的是20～750IU/周，更优的是20～700IU/周，更优的是20～650IU/周，更优的是20～600IU/周，更优的是20～550IU/周，更优的是20～500IU/周，更优的是20～450IU/周，更优的是20～400IU/周，更优的是20～350IU/周，更优的是20～300IU/周，更优的是20～250IU/周，更优的是20～200IU/周，更优的是20～150IU/周，视病变的严重程度和肾功能而定。根据本发明，可以使用的剂量为1～450，更优的是1～9IU/周。所有前述的与本发明相关的剂量，例如1～2000单位(IU)/周/病人，更优的是500～2000IU/周/病人，都是适用于亚红细胞增多性的剂量，也就是说该剂量不会引起血细胞比容的增加，而且与EPO使用前相比，血细胞比容的增加不会超过10％，特别是5％，更好的是2％。根据本发明，亚红细胞增多性的剂量对应于每周约1～90单位(IU)EPO/kg体重的剂量，更优的是1～45IU EPO/kg体重，更优的是1～30IU EPO/kg体重，更优的是1～20IU EPO/kg体重，更优的是1～15IUEPO/kg体重，更优的是1～10IU EPO/kg体重，更优的是1～4IU EPO/kg体重，或者等同于Aranesp的剂量为每周0.001～0.4μg/kg体重，0.001～0.3μg/kg体重，0.001～0.25μg/kg体重，0.001～0.2μg/kg体重，0.001～0.15μg/kg体重，0.001～0.1μg/kg体重，0.001～0.09μg/kg体重，0.001～0.08μg/kg体重，0.001～0.07μg/kg体重，0.001～0.06μg/kg体重，0.001～0.05μg/kg体重，0.001～0.04μg/kg体重，0.001～0.03μg/kg体重，0.001～0.02μg/kg体重，0.001～0.01μg/kg体重，0.001～0.009μg/kg体重，0.001～0.008μg/kg体重，0.001～0.007μg/kg体重，0.001～0.006μg/kg体重，0.001～0.005μg/kg体重，0.001～0.004μg/kg体重，0.001～0.003μg/kg体重，0.001～0.002μg/kg体重。Aranesp是一种双重聚乙二醇化的EPO。
根据本发明，这里所提出的所有应用，方法和组合物，特别优选使用的EPO是低剂量的，少于已知的通常用于治疗肾性贫血所使用的剂量。根据本发明，低剂量或低用量用药(特别是在体内)，即对每个病人，应理解为EPO的剂量为0.001～90，优选的是0.001～50单位(IU；国际单位)/kg体重/周，特别是0.05～45IU/kg/周，特别是0.05～40IU/kg/周，特别是0.05～35IU/kg/周，特别是0.05～33IU/kg/周，特别是0.05～31IU/kg/周，特别是0.05～29IU/kg/周，特别是0.05～27IU/kg/周，特别是0.05～25IU/kg/周，特别是0.05～23IU/kg/周，特别是0.05～21IU/kg/周，特别是0.05～19IU/kg/周，特别是0.05～17IU/kg/周，特别是0.05～15IU/kg/周，特别是0.05～13IU/kg/周，特别是0.05～11IU/kg/周，特别是0.05～9IU/kg/周，特别是0.05～7IU/kg/周，特别是0.05～5IU/kg/周，特别是0.05～3IU/kg/周，特别是0.05～1IU/kg/周，取决于紊乱的严重程度和肾功能。根据本发明，可以使用的剂量为0.001～20，首选的是0.05～10IU/kg/周。根据本发明，所有前述剂量，例如0.01～90单位(IU)/kg/周/病人，特别是例如0.01～50IU/kg/周/病人，是亚红细胞增多性的剂量，或者换句话说该剂量不会引起血细胞比容的增加，特别是与EPO使用前相比，血细胞比容的增加不会超过10％，特别是5％，更好的是2％。根据本发明，亚红细胞增多性的剂量对应于每周约1～90单位(IU)EPO/kg体重的剂量，特别是0.001～50IU EPO/kg体重，特别是0.001～45IU EPO/kg体重，特别是1～15IU EPO/kg体重，特别是1～10IUEPO/kg体重，特别是1～4IU EPO/kg体重，或者等同于Aranesp的剂量为每周0.000005～0.45μg/kg体重，0.00025～0.250μg/kg体重，0.00025～0.225μg/kg体重，0.00025～0.2μg/kg体重，0.00025～0.175μg/kg体重，0.00025～0.165μg/kg体重，0.00025～0.155μg/kg体重，0.00025～0.145μg/kg体重，0.00025～0.135μg/kg体重，0.00025～0.125μg/kg体重，0.00025～0.115μg/kg体重，0.00025～0.105μg/kg体重，0.00025～0.095μg/kg体重，0.00025～0.085μg/kg体重，0.00025～0.075μg/kg体重，0.00025～0.065μg/kg体重，0.00025～0.055μg/kg体重，0.00025～0.045μg/kg体重，0.00025～0.35μg/kg体重，0.00025～0.025μg/kg体重，0.00025～0.015μg/kg体重，0.00025～0.005μg/kg体重。Aranesp是一种双重聚乙二醇化的EPO。与最初通常用于治疗肾性贫血的90～150IU/kg体重/周的剂量(开始作为标准的剂量为4000～8000IU/周，如果治疗效果不佳甚至更高)相比，本发明所提供的用于治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病或病理状态的上述的低剂量——例如0.001～90单位/kg/周/病人，特别是0.001～50单位/kg/周/病人的剂量——是极其低的。
除非发特别说明，以上提到的剂量是每周使用一次的剂量，尽管该剂量也可以在一周内分成多个单一剂量，即多剂量使用。
在一个特别优选的实施例中，本发明涉及低剂量EPO和/或其衍生物、即前面的章节所定义的“创造性的EPO剂量”的应用，作为活性物质用于生产药物组合物，或者治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的病理状态和疾病的药物。
根据本发明，“活性物质”应理解为一种内源性或外源性物质，该物质能以不同的方式与靶分子或靶细胞或靶组织接触，影响组织、器官或有机体的特定功能。因此，根据本发明，EPO作为创造性的药物组合物的活性物质，一旦与内皮祖细胞接触，能够在人或动物体内影响内皮祖细胞的增殖、分化和迁移行为，通过这种方式，内皮祖细胞的功能障碍能够得到补偿，并且能够有效控制、减轻/消除，或者有效预防由此所引起的疾病。低剂量EPO的使用不仅可以诱导器官再生，而且可以减缓不同器官和系统功能受限的发展进程。
根据本发明，“药物组合物”或“药物”应理解为一种用作诊断、治疗和/或预防用途的混合物，换句话说，是一种促进或恢复人或动物健康的混合物，该混合物包含至少一种天然或人工合成的具有治疗效果的活性物质。该药物组合物既可以是固体混合物，也可以是液体混合物。例如，含有所述活性成分的药物组合物可能含有一种或多种药理上容易吸收的组分。另外，所述药物组合物还可以含有专业领域常用的添加剂，例如稳定剂，修饰剂，释放剂，分解剂，乳化剂，或其它在生产药物组合物常用的物质。
本发明特别提供了一种EPO(特别是低剂量的EPO)和/或其衍生物作为一种活性物质用于生产药物的应用，所述药物可以用于治疗高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抗性，内皮介导的慢性炎症(例如血管炎症)，内皮增生(包括网状内皮组织增生)，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性疾病，雷诺氏症，肝脏疾病(如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭)，骨质和软骨失调或损伤，粘膜失调或损伤(特别是在胃肠道中)，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，子痫前症，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭(特别是晚期肾衰竭)，肾功能受限至肾小球滤过率＜80ml/min、特别是30，优选的是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高或创伤及其继发症。
该药物组合物根据本发明既适合局部使用，也适合系统给药。
在本发明的一个优选实施例中，该药物组合物作可用作注射给药，特别是静脉内、肌肉内、皮内或皮下注射。更适宜的，含有EPO的药物有注射或灌输剂型。
在进一步的应用中，含有EPO的药物组合物还可以口服给药。举例来说，含有EPO的药物的剂型可以是液体剂型，例如溶液、悬液或乳液，或者是固体剂型，例如药片。
在进一步的应用中，所述药物组合物还适合肺部给药或吸入式给药。因此根据本发明，EPO可以以治疗上有效的形式直接向病人的肺部给药。这种方式不需注射，而且给药快速。通过肺部给药，相对数量的EPO可以通过肺部吸收到血液中，使血液中EPO的浓度升高。在本发明的一个优选实施例中，肺部给药的药物组合物可以是水溶液或非水溶液，或粉剂。如果是粉剂，则最好含有EPO的颗粒，颗粒的直径最好小于10μm，这样的话，药物就能到达患者肺叶，甚至深达肺泡。在本发明的一个特别优选的实施例中，需要通过肺部途径给药的药物是气雾剂。
本发明的一个特别优选的实施例涉及EPO在生产治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病的药物组合物方面的应用，该药物组合物不仅含有活性物质EPO，还含有至少另外一种刺激内皮祖细胞的活性物质。
该活性物质最好能够刺激骨髓中或其它干细胞小环境中的内皮祖细胞的迁移。根据本发明，上述物质可以是一种能够刺激内皮祖细胞的分裂行为也就是增殖的活性成分。根据本发明，还有另外一种可能性是，该活性物质能够诱导内皮祖细胞分化和/或迁移行为。上述刺激内皮祖细胞的活性物质特别优选为VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA还原酶抑制剂，特别是他仃类降脂药物如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制剂，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻断剂，例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，和/或NO供体，特别是L-精氨酸。
根据本发明，所述至少一种另外的活性成分可以并不刺激内皮祖细胞，而是特别作用于已分化的内皮细胞，即诱导其增殖和/或迁移。特别的，所述该活性成分是bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或血管生成素。
本发明的另一个实施例涉及EPO和/或其衍生物作为活性成分在生产药物组合物方面的应用，该药物组合物可以刺激内皮祖细胞，特别是可以刺激内皮祖细胞迁移，增殖，分化为内皮细胞和/或向血管生成或脉管新生刺激物的转移。根据本发明，EPO和/或其衍生物可以作为活性成分用于生产药物组合物，用于刺激的血管生成和/或内皮形成，特别是人或动物体内。
本发明因此还涉及药物组合物，该药物组合物用于刺激内皮祖细胞、特别是刺激内皮祖细胞的迁移，增殖，诱导其向内皮细胞的分化和/或向血管生成或脉管生成刺激因子的转移，用于刺激新血管生成和/或内皮形成，以及治疗人或动物与内皮祖细胞和/或内皮细胞的功能障碍相关的疾病。特别的，本发明涉及含有活性物质EPO和至少一种刺激内皮祖细胞和/或已分化的内皮细胞的其它活性成分的药物组合物或药物。在一个优选实施例中，本发明涉及含有EPO和至少一种其它活性成分的药物组合物，所述另外的活性成分选自VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA还原酶抑制剂，特别是他仃类降脂药物如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制剂，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻断剂，例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，和/或NO供体，特别是L-精氨酸，bFGF和血管生成素。
本发明的另一个优选实施例涉及EPO在生产可移植内皮细胞制品方面的应用。根据本发明，在这个实施例中，内皮细胞的生产可以通过先在EPO作用下对内皮祖细胞进行离体培养，然后移植到受体的机体中，特别是患有与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病的机体。例如，单核细胞(MNC)可以通过密度梯度离心从血液分离，并在体外以合适的培养基培养。单核细胞的分离和体外培养方法已有描述，例如Asahara在Science，275(1997)，964-967；Dimmeler等在J.Clin.Invest.，108(2001)，391-397和Llevadot等在J.Clin.Invest.，108(2001)，399-405的文章。紧接着在EPO作用下进一步培养单核细胞，刺激MNC中所含的内皮祖细胞的增殖和分化行为，特别是增加已分化的黏附性内皮细胞的数量。根据本发明，MNC可以在有EPO和至少一种另外的能刺激内皮祖细胞的增殖和分化的活性物质存在的情况下培养。特别优选的，该所述的另外物质有VEGF，PIGF，GM-CSF，NO供体，例如L-精氨酸，ACE抑制剂，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻断剂，例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，HMG-CoA还原酶抑制剂，例如他仃类降脂药物，特别是辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀。
在本发明的另一个优选实施例中，在低剂量EPO作用下离体预培养和/或体内局部或系统性使用低剂量EPO后，内皮祖细胞可与其它有细胞治疗作用的细胞群同时给病人使用，所述可用于细胞治疗的细胞群，例如肝细胞、肌细胞、心肌细胞或胰岛细胞。这种方法可以促使用于细胞治疗的组织细胞沉淀并充分黏附到血管系统上。
本发明的另一个实施例涉及EPO在生产药物组合物或试剂盒方面的应用，所述药物组合物或试剂盒用于连续地、按时间先后地或同步地使用低剂量EPO以及一种或多种其它的化学、热力、机械或生物制品，以增加内皮祖细胞的功能和数量，诱导再生以及减缓组织损伤进程。所述机械制品可以是人工假肢，例如替代牙齿，骨头，韧带/肌腱的植入支持物。所述生物制品可以是实体器官，例如肝脏、肾脏、心脏、胰腺、或皮肤，甚至是植入式头发。因此，本发明的EPO、特别是低剂量EPO的使用，为了使之前、同时或之后植入的机械制品(如人工假肢)或者生物制品能够更好、更快、更有效地生长以及与周边的组织结构融合。因此，本发明还涉及EPO在生产药物组合物或试剂盒方面的应用，所述药物组合物或试剂盒用于改善，特别促进和/或加快生物制品或人工假肢与周围机体组织的融合，特别是牙齿，牙齿替代物，牙齿植入物或其它人工假肢，例如骨骼替代物，骨骼植入体，特别使髋关节修补物，韧带/肌腱替代物(如交叉韧带)。关于这一点，如果需要，EPO可以与适合用于细胞治疗的细胞群和/或内皮祖细胞一起使用。在上述EPO在生产药物组合物或试剂盒的应用中，所述药物组合物或试剂盒用于改善，特别是促进和/或加快生物制品或人工假肢与周围机体组织(特别是靶组织，靶骨骼或靶软骨组织)的融合。在另一个优选实施例中，所述机械制品可以由钢，陶瓷，塑料或其它材料制成。此外，在本应用中，成骨细胞，具有成骨潜力的细胞，血小板，血细胞或者类似制品可用作适合用于细胞治疗的细胞群。在一个更为优选的实施例中，所述机械制品特别地与有机黏合剂(例如纤维胶)一起成为药物组合物或药物试剂盒的组成成分。
在本发明的一个优选实施例中，EPO或适合的活性物质以外用的方式应用，即所谓的“美容护理”，特别用于预防和及时减少皱纹，增强结缔组织，护肤和紧肤(特别是面部皮肤)，阻止有害的外部环境因素，以及作为化妆品的粉底。而且，EPO外用可以阻止老年斑的形成和进一步发展，改善肤质，不仅能促进皮肤复壮过程(特别是表皮再生)，还能加速头发生长。
此外的一个应用形式中，低剂量EPO以适应生理节律的方式使用。内源性EPO的产生在下午较晚的时候有一个最高点(每天的最高值)，因此低剂量EPO的使用最好是在上午进行，特别是在上午6:00～10:00的时段内，通过这种方式以期达到生物学的最大效果。
在本发明的另一个优选的实施例中，用低剂量EPO对被移植的组织或器官进行预处理和/或进一步处理。在该例中，移植体在移植前，特别是即将移植但还在供体体内的时刻可以用低剂量EPO处理。受体机体在移植前一刻也可以用低剂量的EPO处理。根据本发明，通过在移植前或移植后对被移植的器官或组织以EPO进行处理，可以确保在移植后，通过诱导新血管生成在移植处快速生成新血管，这些新形成的血管可迅速连接到受体的血管系统。内皮可以通过这种方式迅速形成。低剂量EPO对移植器官或组织的处理能够促进其在体内迅速生长，从而显著降低发生排斥反应的风险。此外，低剂量EPO还可以刺激器官的再生功能。
在本发明的另一个实施例中，移植器官或组织在移植前可以用低剂量EPO和至少一种内皮祖细胞刺激因子的混合物处理。上述刺激因子优选至VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA还原酶抑制剂，例如他仃类降脂药物，特别是辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制剂，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻断剂，例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，或NO供体，特别是L-精氨酸。在另一个实施例中，器官或组织在移植前不仅用EPO处理，还用另一种能刺激已分化的内皮细胞增殖和迁移的物质处理。所述物质特别优选的是血管生成素或bFGF。在另一个实施例中，EPO对移植器官或组织的预处理可以通过单独使用内皮祖细胞实现，如果需要，所述内皮祖细胞可以进行体外扩增。
在本发明的又一个特别优选的实施例中，低剂量EPO被用来制造可植入或可移植的、含有细胞的体外器官或组织。根据本发明，体外生产的器官或组织可以在植入或移植前用低剂量EPO处理，以刺激受体内的内皮祖细胞，特别是刺激内皮祖细胞的迁移、转移、增殖和分化行为。在体外器官或组织植入或移植后，受体机体最好进一步以与本发明相适应的低剂量EPO处理。根据本发明，体外器官或组织在移植或植入前以EPO处理，以及必要的时候以EPO对受体进行后处理，可以确保在体内进行移植或植入后，通过诱导体外器官或组织的新血管生成快速形成新血管，这些新形成的血管可以迅速连接到受体的血管系统。通过这种方式还能够实现内皮快速形成以及内皮再生。因此，这种用低剂量EPO对体外移植器官或组织系统的处理能够促进其向受体内快速生长，从而显著降低排斥反应的风险，而且还能保护移植体。
“体外器官或组织系统”应理解为一种可移植或可植入的，含有细胞的组织或者器官。该组织或器官通过使用规定的细胞和/或组织在规定的离体培养条件下生产。“可植入的体外器官或组织系统”应理解为一个除了含有细胞外，还含有外源性材料的系统。“可移植的体外器官或组织系统”应理解为一个含有细胞的系统，不仅含有相同或不同个体的细胞、组织或器官，而且还含有外源性物质。特别的，体外器官或组织的特征是其与欲取代的身体器官或组织非常相似，使它们在体内能够承担被取代的天然器官或组织的功能。
在本发明的一个实施例中，所述体外器官或组织系统在植入或移植前，同时用EPO和至少另一种内皮祖细胞刺激因子处理。这种因子优选是一种或多种选自以下群组的物质VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA还原酶抑制剂，特别是他汀类降脂药物如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制剂，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻断剂，例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，以及NO供体。在另一个实施例中，体外器官或组织系统在植入或移植前不仅用EPO处理，还用另一种能够刺激已分化的内皮细胞增殖和迁移的物质处理。特别优选的，这种物质是血管生成素或bFGF。在另一个实施例中，所述体外器官或组织系统还可以含有单独的内皮祖细胞，如果需要，所述内皮祖细胞可以在体外进行扩增。
本发明的另一个优选实施例涉及低剂量EPO用于生产血管修复体或心瓣膜的应用，其中所述血管修复体或心瓣膜在引入机体、特别是人体内之前以EPO涂覆。通过以EPO涂覆血管修复体或心瓣膜，可以确保刺激受体体内的内皮祖细胞。特别是，刺激内皮祖细胞从骨髓的迁移、增殖、分化成内皮细胞以及向植入的血管修复体或心瓣膜的迁移。在以这种方法生产的血管修复体或心瓣膜被引进体内后，该机体可以用EPO、特别是以按照本发明的剂量使用EPO进行进一步处理。这样，在植入的血管修复体上内皮层可以更快形成，向身体相关区域内的生长也更快。在一个优选实施例中，单独的内皮祖细胞(如果需要，可以在体外进行扩增)被另外的用于涂覆血管修复体或心瓣膜。
本发明涉及在体外刺激内皮细胞形成的方法，包括a)通过密度梯度离心的方法从血液中分离含有内皮祖细胞的细胞群；b)在细胞培养基上培养所述分离的、含有内皮祖细胞的细胞群；和c)在低剂量EPO存在的条件下培养所述细胞群。
根据本发明，所述细胞群的培养可在另一种能刺激内皮祖细胞的物质存在的条件下进行。
本发明还涉及一种用于治疗与内皮祖细胞功能障碍相关疾病的方法，其中EPO以“与本发明要求相符的EPO剂量”这一段落中所说明的低剂量，单独的或与至少一种其它的化学、热力、机械或生物制品联合使用。本发明提供的这一方法特别适用于治疗人体的疾病，例如高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抵抗，内皮介导的慢性炎症，例如血管炎症，内皮增生包括网状内皮增生，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊乱，雷诺氏症，肝脏疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨质和软骨失调或损伤，粘膜失调或损伤，特别是在胃肠道中，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，子痫前症，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭，特别是晚期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率＜80ml/min、特别30～80ml/min，优选的是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高或创伤及其后遗症。
在一个优选实施例中，提供了一种用于治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病的方法，即对病人除了使用EPO外，还至少使用另一种活性成分，该活性成分可选自VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA还原酶抑制剂和NO供体。优选的，所述的HMG-CoA还原酶抑制剂是一种他仃类降脂药物，例如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀。优选的，所述ACE抑制剂可以是例如依那普利、雷米普利或群多普利的活性成分。AT-1阻断剂可以是例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦的活性成分。所使用的NO供体最好是L-精氨酸。
在一个优选实施例中，提供了一种治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病的方法，内皮祖细胞可以从人体的血液中分离，使用低剂量EPO在体外扩增并分化成为内皮细胞，然后纯化和分离已分化的内皮细胞或正在分化的内皮祖细胞后，选择性的将其移植到病人由内皮祖细胞和/或内皮细胞功能障碍而引起损伤的身体区域、组织或器官中，从而在该处诱导新内皮的形成。通过这种方式，病人受到损伤的身体区域、组织或器官能够得到更有针对性和更快的治疗。这个实施例的用于治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病的方法包括以下步骤a)用密度梯度离心的方法从血液中分离含有内皮祖细胞的细胞群；b)在细胞培养基上培养上述含有内皮祖细胞的细胞群；c)在低剂量EPO存在的条件下培养含有内皮祖细胞的细胞群，以刺激内皮祖细胞的增殖和/或分化成为内皮细胞；d)分离和纯化已分化了的内皮细胞；和e)把已分化的内皮细胞移植到患有与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病的机体内。
在移植了已分化的内皮细胞后，机体可以进一步用EPO处理，特别是在本发明规定的低剂量下，即“与本发明要求相适应的EPO剂量”这一段落的中所说明的剂量，例如1～90IU/kg/周，最好是0.001～90IU/kg/周或20～2000IU/kg/周。
根据本发明，含有内皮祖细胞的细胞群的体外培养可以在至少一种其它活性成分存在的情况下进行，该种活性成分可选自VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA还原酶抑制剂，ACE抑制剂，AT-l阻断剂和NO供体。优选的，用于培养的HMG-CoA还原酶抑制剂是一种他仃类降脂药物，例如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制剂可以是例如依那普利、雷米普利或群多普利的物质，所述AT-1阻断剂可以是例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦的物质。
根据本发明，含有内皮祖细胞的细胞群可以连续地、按时间先后地或同步地使用低剂量EPO以及一种或多种其它化学、热力、机械或生物制品，通过这种方法可增加内皮祖细胞的数量和增强其功能，和/或刺激再生或减缓组织损伤的进程。
本发明的另一个优选的实施例涉及一种治疗血管紊乱的方法，包括以下步骤a)通过密度梯度离心的方法从血液中分离含有内皮祖细胞的细胞群；b)在细胞培养基上培养含有内皮祖细胞的细胞群；c)在低剂量EPO的条件下培养含有内皮祖细胞的细胞群，以刺激内皮祖细胞的增殖和/或分化成为内皮细胞；d)分离和纯化已分化的内皮细胞；和e)移植内皮细胞到患有血管紊乱的体内。
在内皮细胞移植到患有血管紊乱的体内后，机体可以用EPO，特别是在本发明的低剂量下，即“与本发明要求相适应的EPO剂量”这一段落中所定义的剂量，例如0.001～90单位/kg/周或20～2000IU/kg/周进行进一步处理。
根据本发明，所述含有内皮祖细胞的细胞群可以在至少一种其它活性物质存在的情况下进行培养，所述活性成分可选自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制剂，AT-1阻断剂和/或HMG-CoA还原酶抑制剂。优选的，所述用于培养的ACE抑制剂是例如依那普利、雷米普利或群多普利的物质，AT-1阻断剂可以是例如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦的物质，HMG-CoA还原酶抑制剂是一种他仃类降脂药物，例如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀。
根据本发明，所述含有内皮祖细胞的细胞群可以连续地、按时间顺序地或同步地使用低剂量EPO以及一种或多种其它的化学、热力、机械或生物制品，通过这种方法可增加内皮祖细胞的数量和增强其功能，和/或引起再生或减缓组织损伤的进程。所述机械制品可以是人工假肢，例如用于替代牙齿，骨头，韧带/肌腱的植入支持物。所述生物制品可以是实体器官，例如肝脏、肾脏、心脏、胰腺、皮肤或植入式头发。根据本发明，使用EPO特别是低剂量EPO，可以使同时，之前或之后植入的机械制品(例如人工假肢)，或生物制品更好、更快、更有效地与周边的机体组织融合。因此，本发明还涉及EPO生产药物组合物或试剂盒的应用，所述药物组合物或试剂盒可以改善、特别是促进和/或加快生物制品或人工假肢和周边机体组织的融合，特别是牙齿，牙齿替代物，牙齿植入物或其它人工假肢，例如骨骼替代物，骨骼植入物，特别是髋关节修复体或者韧带或腱替代物(例如交叉韧带)。在一个优选实施例中，EPO与可用于细胞治疗的细胞群和/或内皮祖细胞联合使用。前述EPO用于生产药物组合物或试剂盒，以改善，特别是促进和/或加快生物制品或人工假肢与周围集体组织，(特别是病人的靶组织，靶骨骼或靶软骨组织)的融合。在另一个优选实施例中，所述机械制品可以由钢，陶瓷，塑料或其它材料制成。此外，在本应用中，成骨细胞，具有成骨潜力的细胞，血小板，血细胞或者类似制品可用作适合用于细胞治疗的细胞群。在另外一个优选的实施例中，所述机械制品特别地与有机黏合剂(例如纤维胶)一起包含在药物组合物或药物试剂盒中。
本发明提供了一种治疗血管紊乱的方法，内皮祖细胞可以从人体的血液中分离，使用低剂量EPO在体外扩增并分化成为内皮细胞，然后对分化了的内皮细胞或正在分化的内皮祖细胞进行纯化和分离，然后选择性的移植到受损的血管或肌肉区域，从而在该处诱导血管生成。通过这种方式，受损的血管或肌肉组织能够得到更有针对性和更快的治疗。这个用于治疗血管紊乱的方法特别适合治疗血管性疾病例如局部缺血，特别是大脑缺血，四肢缺血性病变，中风，急性动脉梗塞，动脉梗塞性疾病，雷诺氏疾病和麦角中毒。
本发明其它的优选例子在从属权利要求中给出。
以下结合附图和实施例对本发明作详细介绍。


图1显示了循环的CD34+干细胞(cSC)的FACD分析结果，(A-D)病人样本；(E-F)同型对照；cSC的识别通过CD34标记物(B和F)的补充表达，典型的低到中度CD45抗原表达(C和G)以及典型的光散射性质(D和H)实现。cSC的绝对数量以每100,000个单核细胞和淋巴细胞来计算。
图2显示了流式细胞仪对循环的干细胞进行的定量分析结果。该图显示了使用rhEPO(重组人EPO)处理后0，2，4，6和8周后与时间相关的结果。n＝11，结果对应平均值±标准偏差。中间值以直线表示。
*.p＜0.01，与2周时对照；ψp＜0.05，与4周时对照；#p＜0.05，与8周时对照。
图3显示了培养的内皮祖细胞(EPC)的定量分析结果。该图显示了，rhEPO处理增加了EPC的相对数量。在用rhEPO处理前以及处理2，4，6，8周后分别从病人肾中分离EPC，根据其黏附能力和两种标记物acLDL-Dil和UEA-1 FITC对其进行鉴定。n＝11，结果对应平均值±标准偏差。中间值以直线表示。
*.p＜0.01，与处理前比较；#p＜0.001，与处理前比较。
图4显示了培养的内皮祖细胞(EPC)的定量分析结果。该图显示了，用rhEPO治疗前，与相应年龄和性别的健康个体相比，病人的EPC的绝对数量明显减少。与对照组相比，肾贫血病人表现出明显的EPC功能紊乱。肾贫血病人在用rhEPO治疗8周后，减少了的功能性EPC数量得到了补偿。在用rhEPO治疗前及治疗2，4，6，8周后分别从病人肾中分离EPC，根据其黏附能力和两种标记物acLDL-Dil和UEA-1 FITC对其进行鉴定。n＝11。作为例子该图给出了8周的疗程和所有的对照。绝对值以单一数据形式显示。而且，还给出了框图(90％、75％、50％、25％和10％以及平均值)。作为健康对照组，相应年龄和性别的试验个体的EPC也进行了分离及类似的分析(n＝11)。
图5显示了健康的年轻试验人群的经培养的内皮祖细胞(EPC)的定量分析结果。该图显示rhEPO治疗(30IU依泊艾汀β/kg体重/周)增加了EPC的相对数量。在rhEPO治疗前从试验者中及治疗1，2，3，4，5，6，7周后的病人体内分别分离了EPC，并根据其黏附能力和两种标记物acLDL-Dil和UEA-1 FITC对其进行鉴定。n＝4，结果对应平均值±标准偏差。
图6显示了培养的内皮祖细胞(EPC)的定量分析结果。这个有代表性的图片显示与相应年龄和性别的健康个体相比，尿毒症病人的EPC的绝对数量明显减少(顶上一行＝体内)。与对照组相比，肾功能受限的病人表现出明显的EPC功能障碍。用尿毒症患者的血清培养健康试验人员的内皮祖细胞，可以发现内皮祖细胞的分化能力降低(底下一行＝体外)。因此，因此，由于尿毒症导致的肾功能受限可以导致内皮祖细胞的功能障碍。
图7显示了46个尿毒症导致的肾功能受限的病人与46个相应年龄和性别的健康对照者的经培养的内皮祖细胞定量分析结果，以框图的形式表示(90％、75％、50％、25％和10％以及平均值)。相对于健康个体，尿毒症病人的内皮祖细胞的数量明显减少。与健康对照组相比，肾功能受限的患者，具有明显的EPC功能障碍。
图8显示了EPO对创伤愈合的作用。该图显示了，用组织打孔器在老鼠身上造成标准的皮肤创伤，在使用EPO处理7～8天后，伤口已完全愈合。作为对照的，用生理盐水处理的伤口到13-14天后依然没有完全愈合。EPO或生理盐水的处理在皮肤创伤前7天即开始进行。重组人EPO每周进行皮下注射一次(0.1mg/kg Aranesp)(每组n＝5)。
图9显示了EPO减少了急性肾衰竭(急性肾机能不全)导致的肾功能的丧失。本研究中使用了Sprague Dawley鼠(250～300g)，以克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)进行麻醉。在诱导急性肾衰竭前，按0.1μg/kg体重的剂量给一组试验鼠注射Aranesp。作为对照，同时给另一群试验动物皮下注射生理盐水。用动脉夹夹住右肾动脉，使流进肾的血流被阻断45分钟。在这段时间内，切除左肾。在另一群对照组中，进行虚假手术。在该过程中，打开腹部露出左肾动脉，在不阻止血液供应的情况下切除对侧的右肾。麻痹所有动物60分钟，并于手术后24小时将其处死。对于以生理盐水处理的动物，右肾长达45分钟的缺血以及随后的重新灌注导致肾功能快速的大规模丧失。这可由血清肌氨酸酐水平在缺血-重灌注后24小时后达到之前的7倍这一事实中得到证明(p＜0.05)。与此相比，对于EPO类似物Aranesp处理过的动物，在缺血和再灌注的诱导损伤1天后，血清中肌氨酸酐水平只增加了4倍。对于左肾被切除，而右肾只进行了虚假手术的动物，肌氨酸酐水平并没有上升。该图显示了在缺血再灌注损伤24小时后，用EPO处理的(IP+EPO)，用NaCl处理的(IR)，以及进行了虚假手术(sham OP)的动物血清中肌氨酸酐的浓度。从图中明显可以看出，用Aranesp处理的动物和没有用Aranesp处理(用NaCl处理)的对照组动物相比，在缺血再灌注损伤24小时后，其血清中肌氨酸酐的浓度几乎只有后者的一半。
图10显示了在诱导急性肾衰竭后分别使用Aranesp和NaCl处理的试验组的Kaplan-Mayer生存曲线。本研究中使用了8周龄的Sprague Dawley鼠，以克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)麻醉。在第0天时切除右肾并立刻置于用于组织学检查的福尔马林中。结扎左肾的上下两极的供血动脉。这样，肾损害出现在相应的肾区域，只有中间三分之一的部分还保持功能。试验鼠每周一次皮下注射Aranesp(0.1μg/kg体重)或NaCl。与用生理盐水处理的动物相比，用EPO类似物Aranesp处理的动物表现出明显的生存优势(p＝0.027；Log rank检验)。
两组试验动物组分别用Aranesp和生理盐水处理，图10是它们的Kaplan-Mayer生存曲线，图11～18则显示在诱导急性肾衰竭6周后，光学显微镜观察到的两个动物组的肾切片图。
图11显示了急性肾衰竭的sprague Dawley鼠经每周一次用NaCl处理后6周内的生理变化，NaCl处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾被切除以及左肾上下两极的部分供血动脉被结扎引起的。该图显示了一个典型的与严重高血压损伤相关的、以洋葱皮状血管壁增生为特征的、中等大小的肾小球前血管增生(即已知的动脉内膜炎引起的Fahr’s恶性肾硬化)。
图12显示了急性肾衰竭的Sprague Dawley鼠经每周一次用NaCl处理后6周内的生理变化，NaCl处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾切除以及左肾上下极的部分供血动脉被结扎所引起。该图显示了florid病灶性节段性肾小球硬化，即所谓的FSGS(右肾肾小球)增生。另一个(左侧)肾小球表现出回旋的缺血性崩溃。在图的下部可以看到一个严重内皮损伤的小血管。观察到的生理改变是高血压导致的器官损伤或与5/6肾切除后的肾负荷过重所引起。
图13显示了急性肾衰竭的Sprague Dawley鼠经每周一次用NaCl处理后6周内的生理变化，NaCl处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾切除以及左肾上下极的部分供血动脉被结扎所引起。该图显示了一个代偿性增大的肾小球几乎完全性的硬化或损伤，以及其传入小动脉明显的透明变性纤维或者蛋白样坏死。
图14显示了急性肾衰竭的Sprague Dawley鼠经1每周一次用NaCl处理后6周内的生理变化，NaCl处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾切除以及左肾的供应肾上下极的部分供血动脉被结扎所引起。该图显示了以洋葱皮状血管壁增生为特征的小型肾小球前血管增生和与严重高血压损伤引起的壁坏死，即所谓的恶性肾硬化(见右图)。正常的(还)未受到损伤的动脉见左图。
图15显示了急性肾衰竭的Sprague Dawley鼠每周一次用Aranesp(EPO)处理(0.1mgAranesp/kg)后6周内的生理变化，Aranesp处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾切除以及左肾上下极的部分供血动脉被结扎所引起。该图显示了一个输入血管还柔软的正常的肾小球。肾小管间质没有病变信号。
图16显示了急性肾衰竭的Sprague Dawley鼠经每周一次用Aranesp(EPO)处理(0.1mgAranesp/kg)后6周内的生理变化，Aranesp处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾切除以及左肾的供应肾上下两极的部分动脉被结扎所引起。该图显示了一个具有柔软的输入血管的正常的肾小球(630倍放大)。肾小管间质没有病理信号。
图17显示了急性肾衰竭的Sprague Dawley鼠经每周一次用Aranesp(EPO)处理(0。1mg Aranesp/kg)后6周内的生理变化，Aranesp处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾切除以及左肾上下极的部分供血动脉被结扎所引起。该图显示了一个具有柔软的输入血管的正常的肾小球。肾小管间质没有病变信号。
图18显示了急性肾衰竭的Sprague Dawley鼠经每周一次用Aranesp(EPO)处理(0。1mg Aranesp/kg)后6周内的生理变化，Aranesp处理在诱导急性肾衰竭后即开始。急性肾衰竭是由于右肾切除以及左肾上下极的部分供血动脉被结扎所引起。该图显示了一个具有柔软的输入血管的正常的肾小球(630倍放大)。肾小管间质没有病变信号。
图19显示了EPO对创伤修复过程的作用。
具体实施例方式
实施例1、EPO对肾性贫血患者的影响研究了EPO对晚期肾病(肾衰竭死亡前；肌氨酸酐清除＜35ml/min)引起的肾性贫血(Hb＜10.5g/dl)的作用。11名患者通过静脉注射或皮下注射的方式，以每周平均5000IUrhEPO(重组人EPO)的剂量进行至少8周的治疗。EPO治疗后，对病人血液中的内皮祖细胞进行超过20周的检验，分别在EPO治疗后的0，2，4，6和8周，通过流式细胞仪和培养测试对内皮祖细胞的数量和分化状态进行分析。
循环的外周血干细胞(CPBSC)代表了一个既表达CD34抗原又表达CD45抗原的小的细胞群。借助流式细胞仪，在ISHAGE方法的基础上人们研制了一种检测CPBSC的数量的方法(Sutherland et al.，J.Hematother.，5(1996)，213-226)。使用该测试方法，确定了CD34和CD45细胞的表达图谱和干细胞的形态学图谱。通过这种方法，也确定了每μl CPBSC的绝对数量和CPBSC在所有白细胞中的百分含量。
图1显示了建立在ISHAGE基础上的循环血中CD34+干细胞的FACS分析结果。
图2显示了用FACE分析超过8周测得的CD34+干细胞的数量。
细胞培养测试根据Asahara的方法(Science，275(1997)，964-967)，通过Ficoll密度离心法从人血样品中分离出外周血单核细胞(PBMC)。细胞被涂布到含有纤维结合素的EC基本培养基的平板上培养。EC基本培养基的组成为EBM-2基本培养基(Clonetics公司)和EGM-2Quots(hEGF；GA-100(庆大霉素，两性霉素B)FBS，VEGF，hFGF-B(w/肝素)，R3-IGF-1，抗坏血酸，肝素)。培养4天后，洗涤平板以除去非黏附细胞。保留下的黏附细胞用胰岛素处理，并再次涂布。继续培养3天。在分离后的第7天，根据两种不同内皮标记物的阳性染色鉴别内皮表型的细胞。这两个标记物分别是Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL-Dil)和荆豆凝集素-1(UEA-1)。该检测的结果如图3所示。
结果显示EPO能使内皮祖细胞迁移并增加循环中内皮祖细胞的数量。同时，该过程中，特定病理状态下出现的功能不足，例如肾性贫血，得到了改善。这些结果如图4所示。
通过流式细胞仪检测发现，在肾病末期患者的循环血液中的CD34+干细胞的数量和健康人群血液中CD34+的数量相当。EPO治疗开始后，血液中CD34+的数量显著增加超过50％。细胞培养测试发现，EPO治疗后，显示出内皮表型的细胞数量显著增加。在一个功能型细胞培养测试中，内皮祖细胞的功能提高了3倍多。
实施例2、通过系统使用rhEPO促进创伤愈合通过吸入麻醉的方式用异氟醚麻痹FVB/N鼠。将两后肢用脱毛液脱毛并用70％酒精消毒。使用4mm的一次性无菌活体组织打孔器在每只试验鼠的右腹部造成皮肤创伤。对侧则作为内部对照。手术后使用青霉素G(20000单位/kg)进行一次性抗生素处理。整个实验过程中，每周一次使用人重组EPO类似物Aranesp(0.1μg/kg体重)进行皮下注射。在组织打孔器制造创伤的前7天开始处理。结果如图8所示。该图显示使用EPO能明显地加快创伤的修复过程。图19显示EPO对创伤修复的影响。该图显示，用组织打孔器在老鼠身上造成典型皮肤创伤，在使用低剂量EPO处理7～8天后(20IU/kg/周)，伤口已完全愈合。与此相比的是，用生理盐水处理的伤口，在13～14天后才完全愈合。使用高剂量的EPO(200IU/kg/周)处理的动物和对照组相比，没有观察到伤口愈合过程的加快。在观察过程中，用高剂量EPO处理的试验动物中有两只死亡。用EPO或生理盐水的处理在皮肤创伤造成的当天就开始进行。重组人EPO以皮下注射方式(20IU/kgEPO或200IU/kgEPO)每周使用一次(每组中n＝5)。
实施例3、通过EPO治疗减缓慢性肾损伤的进程8周龄的Sprague Dawley鼠用克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)麻醉。第0天时切除右肾并立刻置于福尔马林中，用于组织学检查。结扎左肾上下极的供血动脉。这样，肾损害出现在相应的肾区域，只有中间三分之一的部分还保持功能。试验鼠每周一次皮下注射Aranesp(0.1μg/kg体重)，对照组则注射NaCl。
图10显示了两试验组的Kaplan-Mayer生存曲线。与用生理盐水处理的动物相比，用Aranesp处理后的动物表现出明显的生存优势。
图15～18显示了EPO处理过的肾组织没有表现出明显的病理变化，而采用NaCl处理的肾组织可以看到严重的病理变化(和图8～11相比)。进一步的组织学研究表明，和用生理盐水处理的动物相比，使用Aranesp处理的动物的血管密度(CD31)显著增大。
实施例4减缓急性肾衰竭的进程本研究中使用了体重为250～300g的Sprague Dawley鼠。一组试验鼠在诱导急性肾衰竭前，按0.1μg/kg体重的剂量使用Aranesp。试验鼠用克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)麻醉。同时，作为对照的试验动物，每一只皮下注射生理盐水。在对右肾动脉使用动脉夹后，阻断血液流进肾脏45min。同时切除左肾。在另一组对照组进行虚假手术。在该过程中，打开腹部暴露出左肾动脉，但是并不阻止血液供应，对侧的右肾则被切除。所有动物在手术后被麻痹60min，并于手术后24小时处死。
在以生理盐水处理的动物中，对右肾的45min的缺血以及随后的再灌注导致肾功能的大规模快速丧失。这可以由缺血24小时并重新灌注后，血清肌氨酸酐水平超过缺血再灌注前7倍这一事实得到证明(p＜0.05)。相反，用EPO类似物Aranesp处理后的动物，经过缺血再灌注的诱导损伤1天后血清中肌氨酸酐水平只增加了4倍。在进行了左肾切除，而右肾只进行了虚假手术的动物中，肌氨酸酐水平没有上升。该结果显示于图9中。
实施例5、肾功能受限患者体内内皮祖细胞分化能力降低通过培养测试对46名尿毒症患者及其相应年龄和性别的健康对照组的内皮祖细胞的分化状态进行了分析。研究人员惊奇地发现，与健康对照组相比，尿毒症患者的内皮祖细胞数量明显减少(图7)。如果分离健康人的单核细胞，并在尿毒症患者的血清存在的条件下进行培养健康人的单核细胞，则发现这些细胞分化成内皮祖细胞的能力同样降低(图6)。
实施例6、刺激健康人内皮祖细胞分化能力4个健康的年轻男性以30IU/kg体重/周的剂量用依泊艾汀β处理8周的时间。通过培养测试，根据以rhEPO处理前以及处理后第1，2，3，4，5，6和7周他们的细胞的黏附能力和两个标志物(acLDL和UEA)，测定他们的内皮祖细胞的分化能力。结果发现EPC相对增加了50％以上。
权利要求
1.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产预防或治疗疾病的药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周，优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，其特征在于，该剂量的促红细胞生成素适合用于预防或治疗具有以下症状的人类或动物患者a)至少一种内皮祖细胞的功能障碍；b)至少一种心血管的危险因子如高血压、高胆固醇血症，非对称性二甲基精氨酸水平过高，胰岛素抗性增强或高同型半胱氨酸血症；c)至少一种末端器官损伤，如左心室肥大，微量白蛋白尿，认知功能障碍，颈动脉内膜增厚，蛋白尿或肾小球滤过率＜80ml/min、特别是30～80ml/min。
2.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周、优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，其特征在于，该剂量的促红细胞生成素适合用于人体或动物体的美容护理，特别是用于去皱，增强结缔组织，护肤和紧肤，免受有害环境因素影响，去斑，加快表皮再生，加快头发生长和/或作为化妆品的粉底。
3.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周、优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，用于生产化妆品，特别是外敷产品，其特征在于，该剂量的促红细胞生成素适合用于人体或动物体的美容护理，特别是用于去皱，结缔组织的增强，护肤和紧肤，免受有害环境因素影响，去斑，加快表皮再生，加快头发生长和/或作为彩妆粉底。
4.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周、优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，和/或内皮祖细胞和至少一种可用于细胞治疗的细胞群的混合物，其特征在于，该剂量的促红细胞生成素适合用于人体或动物体的组织或器官的再生，且所述混合物在使用前已在体外与促血红生成素接触。
5.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周，优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，和/或内皮祖细胞和至少一种可用于细胞治疗的细胞群的混合物，其特征在于，该剂量的促红细胞生成素适合用于人体或动物体的组织或器官的再生，且所述促红细胞生成素可以在所述混合物使用之前、之后或同时使用。
6.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周，优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，和/或至少一种化学，热力，机械或生物制品、特别是药物活性成分，用于生产防治或治疗疾病的、含有所述剂量的促红细胞生成素以及至少一种化学，热力，机械或生物制品的药物组合物和试剂盒，其特征在于，该剂量的促红细胞生成素适合用于连续地、时控连续地或同时地使用促红细胞生成素和至少一种化学，热力，机械或生物制品。
7.如权利要求6所述的促红细胞生成素的应用，其特征在于，所述机械制品是人工假体，优选用于牙齿，骨头，韧带/肌腱的替代物的植入式支持物。
8.如权利要求6所述的促红细胞生成素的应用，其特征在于，所述生物制品是固体器官，例如肝脏、肾脏、心脏、胰腺、皮肤或植入式头发。
9.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周、优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，其特征在于，该剂量的促红细胞生成素适合用于预防和治疗疾病，所述疾病为高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抗性，内皮介导的慢性炎症，内皮增生包括网状内皮增生，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊乱，子痫前症，雷诺氏症，肝脏疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨质和软骨失调或损伤，粘膜失调或损伤，特别是在胃肠道中，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭，特别是晚期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，或创伤及其后遗症。
10.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物的应用，所述药物组合物含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周，优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，用于生产含有促红细胞生成素，内皮祖细胞和至少一种可用于细胞治疗的细胞群的试剂盒，其特征在于，所述促红细胞生成素优选的以低剂量存在。
11.如权利要求1～10中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物组合物用于促进内皮祖细胞的生理迁移，内皮祖细胞的增殖，内皮祖细胞分化为内皮细胞，和/或内皮祖细胞向血管源性或脉管源性刺激因子的迁移。
12.如权利要求1～11所述的应用，其特征在于，分化过程中内皮祖细胞的附着能力有所提高。
13.如权利要求1～12所述的应用，其特征在于，刺激内皮祖细胞引起内皮组织的形成。
14.如权利要求1～13中任一项所述的应用，其特征在于，刺激内皮祖细胞引起新血管形成。
15.0.001～90IU/kg人体体重/周的低剂量促红细胞生成素用于治疗人体或动物体的与内皮祖细胞功能障碍相关的病理状态或疾病的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述内皮祖细胞功能障碍包括内皮祖细胞的增殖能力减弱，分化成内皮细胞的能力减弱，附着能力减弱和/或向血管源性或脉管源性刺激因子迁移的能力减弱。
17.如权利要求15或16所述的应用，其特征在于，所述内皮祖细胞的功能障碍减弱或防止了内皮组织和/或血管的形成。
18.如权利要求15～17任一项所述的应用，其特征在于，所述内皮祖细胞的功能障碍是一个致病原因。
19.如权利要求15～18任一项所述的应用，其特征在于，与内皮祖细胞功能障碍相关的病态或疾病包括高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抗性，内皮介导的慢性炎症，内皮增生包括网状内皮增生，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊乱，子痫前症，雷诺氏症，肝脏疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨质和软骨失调或损伤，粘膜失调或损伤，特别是在胃肠道中，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭，特别是晚期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，高非对称性二甲基精氨酸浓度，或创伤及其后遗症。
20.低剂量、特别是0.001～90IU/kg人体体重/周的剂量的促血红细胞生成素的应用，其特征在于，用于治疗高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抗性，内皮介导的慢性炎症，内皮增生包括网状内皮增生，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊乱，子痫前症，雷诺氏症，肝脏疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨质和软骨失调或损伤，粘膜失调或损伤，特别是在胃肠道中，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭，特别是晚期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，高非对称性二甲基精氨酸浓度，或创伤及其后遗症。
21.如权利要求1～20中任一项所述的应用，其特征在于，每个星期对每个病人使用的促红细胞生成素的剂量为0.001～90units/kg。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，每个星期对每个病人使用的促红细胞生成素的剂量为0.05～50units/kg。
23.如权利要求1～22中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物适用于胃肠道外给药，特别是静脉内，肌肉内的，皮内或是皮下给药，也可以外敷给药。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂或输液剂。
25.如权利要求1～22中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物适用于肺部给药。
26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型为水溶液，非含水溶液或粉剂。
27.如权利要求25或26所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型为气雾剂。
28.如权利要求1～22中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物适用于口服。
29.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型是溶液、悬浮液、乳液或药片。
30.如权利要求1～29中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物含有至少另一种用于刺激内皮祖细胞的活性成分。
31.如权利要求30所述的应用，其特征在于，所述另一种活性成分是VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制剂，AT-1阻断剂，HMG-CoA还原酶抑制剂和NO供体。
32.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述HMG-CoA还原酶抑制剂是辛伐他汀，美伐他汀，阿托伐他汀之类的他汀类药物，所述ACE抑制剂是依那普利，雷米普利拉，群拉普利之类的活性成分，和/或所述AT-1阻断剂是依贝沙坦，氯沙坦或奥美沙坦之类的活性成分。
33.促红细胞生成素用于生产可移植内皮制剂的应用。
34.如权利要求33所述的应用，其特征在于，内皮细胞是通过在低剂量促红细胞生成素、即0.001～90IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素存在下，由内皮祖细胞体外培养而来的。
35.如权利要求33或34所述的应用，其特征在于，所述内皮祖细胞的培养是在有至少另一种活性成分存在下进行的，所述另一种活性成分选自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制剂如依那普利、雷米普利拉或群拉普利，AT-1阻断剂如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，HMG-CoA还原酶抑制剂，特别是辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，以及NO供体，特别是L-精氨酸。
36.低剂量促红细胞生成素，即0.001～90IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素用于组织和/或器官移植的预治疗和/或进一步治疗的应用。
37.如权利要求36所述的应用，其特征在于，所述组织或器官移植的预治疗使用分离的内皮祖细胞进行。
38.促红细胞生成素用于可植入或可移植的、含细胞体外器官或组织系统的应用，其特征在于，在移植或植入之前所述体外器官或组织系统先用促血红细胞生成素处理，以促使血管生成和/或内皮形成。
39.如权利要求38所述的应用，其特征在于，体外器官或组织系统含有内皮祖细胞。
40.促红细胞生成素用于生产人造血管或心瓣膜的应用，其特征在于，所述人造血管或心瓣膜涂敷促红细胞生成素。
41.如权利要求40所述的应用，其特征在于，所述人造血管或心瓣膜的涂层包含内皮祖细胞。
42.如权利要求1～41中任一项所述的应用，其特征在于，促红细胞生成素是人体或动物的促红细胞生成素。
43.如权利要求42所述的应用，其特征在于，促红细胞生成素是其衍生物、类似物、修饰体或突变体。
44.如权利要求42或43所述的应用，其特征在于，促红细胞生成素是从人体尿液中，再生障碍性贫血患者的尿液或血浆中，人体肾癌细胞的组织培养物中，能生成人体促红细胞生成素的人体淋巴母细胞中，或人体或动物细胞系的细胞融合后获得的杂交瘤细胞培养物中分离而来。
45.如权利要求42或43所述的应用，其特征在于，促红细胞生成素通过DNA重组技术而获得。
46.一种药物组合物，用于刺激内皮祖细胞，刺激内皮组织形成，促使血管生成和/或治疗与内皮祖细胞功能紊乱相关的疾病或病理状态，其特征在于，所述药物组合物包括作为活性成分的促红细胞生成素和/或其衍生物，类似物、修饰体或突变体，以及至少一种更具活性的成分，这种更具活性的成分选自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制剂如依那普利、雷米普利拉或群拉普利，AT-1阻断剂如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，HMG-CoA还原酶抑制剂，以及NO供体，优选的是低剂量，特别是0.001～90IU/kg人体体重/周。
47.一种药物组合物，用于预防和/或治疗用于治疗高胆固醇血症，糖尿病，胰岛素抗性，内皮介导的慢性炎症，内皮增生包括网状内皮增生，动脉粥样硬化症，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊乱，子痫前症，雷诺氏症，肝脏疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨质和软骨失调或损伤，韧带及踺失调或损伤、粘膜失调或损伤，特别是在胃肠道中，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，妊娠高血压综合症，慢性或急性肾衰竭，特别是晚期肾衰竭，肾功能受限至肾小球滤过率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，高非对称性二甲基精氨酸浓度，或创伤及其后遗症，其特征在于，所述药物组合物包括所述药物组合物包括作为活性成分的促红细胞生成素和/或其衍生物，类似物、修饰体或突变体，优选的是低剂量，特别是人体体重的0.001～90IU/kg/星期。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其特征在于还包括至少一种更具活性的成分，该更具活性的成分选自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制剂如依那普利、雷米普利拉或群拉普利，AT-1阻断剂如依贝沙坦、氯沙坦或奥美沙坦，HMG-CoA还原酶抑制剂，以及NO供体。
49.如权利要求46或47所述的药物组合物，其特征在于，所述HMG-CoA还原酶抑制剂是辛伐他汀，美伐他汀，阿托伐他汀之类的他汀类药物，所述ACE抑制剂是依那普利，雷米普利拉，群拉普利之类的活性成分，和/或所述AT-1阻断剂是依贝沙坦，氯沙坦或奥美沙坦之类的活性成分。
50.如权利要求46或47所述的药物组合物，其特征在于，所述NO供体是L-精氨酸。
51.如权利要求1～50任一项所述的促红细胞生成素用于生长预防或治疗疾病的药物组合物的应用，其特征在于，所述促红细胞生成素和/或药物组合物适合人体或动物体在上午6:00～10:00这一时段使用。
52.一种试剂盒，含有促红细胞生成素、内皮祖细胞和至少一种可用于细胞治疗的细胞群，其特征在于，所述促红细胞生成素优选的以低剂量存在。
53.促红细胞生成素和/或其衍生物用于生产药物组合物或试剂盒的应用，该药物组合物/试剂盒中所含的剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周、优选的是0.05～50IU/kg人体体重/周，用于预防或治疗人体或动物体的疾病，其特征在于，所述低剂量的促红细胞生成素适合用于改善、特别是促进和/或加速机械或生物制剂的整合，特别是人工假体，特别是植入体，例如牙齿、牙齿替代物、骨骼植入物，骨骼替代物，特别是关节修复、韧带或腱替代物，例如交叉韧带，或固体器官移植或人工假体周边的机体结构。
54.如权利要求53所述的应用，其特征在于，所述药物制剂或试剂盒还包括细胞治疗剂，特别是内皮祖细胞和/或用于组织和器官再生的细胞治疗用细胞群。
55.如权利要求53或54所述的应用，其特征在于，所述人工假体由钢、陶瓷、塑料或其它基体材料制成。
56.一种试剂盒，其特征在于，含有剂量为0.001～90IU/kg人体体重/周、最好是0.05～50IU/kg人体体重/周的促红细胞生成素，一种人工假体，如必要还含有一种细胞治疗剂，优选内皮祖细胞或其它可用于细胞治疗的细胞群。
全文摘要
本发明涉及低剂量促红细胞生成素的应用，用于刺激内皮祖细胞的生理迁移、增殖和分化，用于促进血管发生，用于治疗与内皮祖细胞功能障碍相关的疾病，以及用于生产治疗这些疾病的药物组合物，还涉及含有促红细胞生成素以及其它适合的、用于刺激内皮祖细胞的活性成分的药物组合物。
文档编号A61P17/02GK1942200SQ200580009425
公开日2007年4月4日 申请日期2005年1月22日 优先权日2004年1月23日
发明者费迪南德·赫尔曼·巴尔曼, 赫尔曼·哈勒尔 申请人:埃博普鲁斯股份有限公司