促红细胞生成素在中风康复中的用途的制作方法

专利名称：促红细胞生成素在中风康复中的用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了不同剂量促红细胞生成素(EPO)的给药方案以促进局部缺血性发作如中风后的康复。
背景技术：
术语中风是指由于颅内或颅外血管的阻塞或破裂而引起脑功能的突发性损伤。其通常是在脑内或通往大脑的一根或多根血管破裂或被血栓、粥样硬化斑块或某些其它颗粒阻塞时发生。结果，导致大脑神经细胞缺氧并在数分钟内死亡。死亡的脑细胞不能再生并被充满液体的腔体所替代，这种被称为梗塞。在中风中，一些脑细胞不可逆并迅速的死亡。其它细胞例如缺血灶周围的那些，也可能遭受急性损伤并在数小时内处于免疫缺乏状态(Compromised State)。本领域还可知，脑损伤在最初的局部缺血性发作后还可能持续数天。
由于病人通常在中风发作后不能迅速到达急诊室，需要甚至在有时发作后的首次给药时也有效的新疗法。
概述本发明提供了局部缺血性发作后EPO的给药方案以及对发作患者的治疗方法。
本发明的一个实施方案就是用以促进局部缺血性发作后康复的促红细胞生成素的给药方案，包括给予所需患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
本发明的另一个实施方案是治疗局部缺血性发作患者的方法，包括给予所述患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种促进患者局部缺血性发作后功能恢复的方法，包括给予所述患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
在另外一个方面，本发明还涉及在减少局部缺血性发作6小时之内最初接触EPO的患者的梗塞面积的方法，包括给予患者每剂量大约1500IU/kg至大约4500IU/kg的EPO，其中在最初接触EPO后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
在进一步的方面中，本发明还涉及抑制患者局部缺血性发作后CNS中的细胞凋亡或炎症，包括给予所述患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
在本发明的某些优选实施方案中，在局部缺血性发作后的大约24小时给予第一剂量EPO。在本发明的另外一些优选实施方案中，在第一剂量后的大约24小时给予第二剂量。优选，在局部缺血性发作后的大约24小时给予第一剂量EPO，在局部缺血性发作后的大约48小时给予第二剂量。进一步而言，可以在局部缺血性发作后的大约20至大约60小时之内给予第三剂量EPO。优选，在第二剂量后的大约8至24小时之内给予第三剂量EPO。
本发明优选的实施方案包括给药方案和治疗方法，其中EPO的每次给药包括皮下、肌内、静脉或腹腔内注射EPO。
本发明优选的实施方案还包括给药方案和治疗方法，其中EPO的每次给药剂量选自大约500IU/kg至大约10000IU/kg。在一个实施方案中，特别是减少局部缺血性发作6小时之内最初接触EPO的患者的梗塞面积中，EPO的每次给药剂量为大约1500IU/kg至大约4500IU/kg。优选，EPO的每次给药剂量选自大约1800IU/kg至大约4000IU/kg。更优选，EPO的每次给药剂量选自大约2000IU/kg至大约3000IU/kg。最优选，EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。在另一实施方案中，EPO的每次给药剂量选自大约2500IU/kg至大约5000IU/kg。优选，至少一次EPO的给药剂量为大约2500IU/kg。更优选，EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
在本发明更优选的实施方案中，局部缺血性发作是中风。特别是，局部缺血性发作是CNS损伤如病灶性局部缺血性中风或急性局部缺血性中风。
本发明的实施方案进一步包括给药方案和治疗方法，其中促红细胞生成素是长效EPO。
附图概述所附附示了本发明的一些方面。附图概述如下附

图1显示了单天给药对梗塞面积或功能性结果无效。方框-须线(Box-whisker)示意图(A)和(B)表示了在发生阻塞时以及在阻塞后1小时给药右啡烷和EPO，其与用载体治疗的动物相比，对于减少7天(A)梗塞面积或改善(B)功能性结果无效；附图2显示了多天给药促红细胞生成素能减少梗塞面积并改善功能性结果。遭受中脑动脉闭塞(MCAO)的鼠在阻塞后0小时、24小时和48小时用EPO进行治疗，其与用载体进行治疗的动物相比，图(A)显示在2500IU/kg，梗塞面积有显著的减少，和图(B)显示在2500和5000IU/kg，功能性结果有显著的改善(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)；附图3显示了EPO的延缓性多天给药改善功能性结果而不依赖于梗塞面积减少。在MCAO后6小时、24小时和48小时给药EPO，是2500或5000IU/kg，对(A)梗塞面积都没有影响；然而(B)这两个剂量水平对功能性结果都有显著的改善(*p＜0.05；**p＜0.01)；附图4显示了在阻塞一开始至晚至24小时给药EPO均能改善功能性结果。在阻塞后推迟EPO的首剂量整整24小时，随后在48小时给予第二剂量的给药方案，在(A)减少梗塞面积上无效，但(B)具有显著改善的功能性结果(*p＜0.01)。
发明详述下述本发明实施例的目的不在于详尽描述或将本发明限至如下详述中所公开的具体实施例中。然而，所述的实施例能帮助本领域技术人员理解本发明原理和实践。如果下文中没有特别提及的话，以下说明书中参考的每份专利、公开的专利申请和公开出版物均全部引入作为参考文献以用于任何和所有目的。
本发明提供了促进局部缺血性发作后康复的促红细胞生成素的给药方案，包括给予所需患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后大约8至大约26小时内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后大约8至大约26小时内给予第二剂量EPO。
如本文中所使用的，″局部缺血性发作″在患者中枢神经系统(CNS)中的血流和/或氧输送暂时性或永久性减少时发生，并可能导致损伤如非灌注区域的坏死或梗塞。局部缺血性发作包括但不限于，急性CNS损伤如中风、外伤如外伤性脑或脊髓损伤、短暂脑缺血发作、梗塞、缺血-再灌注损伤、视网膜损害、及由于器官、组织或细胞移植或其它外科手术造成的局部缺血。具体而言，对于本发明的目的，局部缺血性发作是脑局部缺血性发作，尤其是颅血流的中断。更具体而言，局部缺血性发作是中风，包括但不限于病灶性局部缺血性中风或急性局部缺血性中风。
如本文中所使用的，缺血-再灌注是指流至器官如大脑的血流被中断，和随后通常突然性的血流恢复。
来自急性局部缺血性中风的损伤是动态的。损伤在开始发作后将持续数天。多种机制导致神经细胞和支持细胞死亡区域的扩大，包括离子平衡的丧失、自由基损害、兴奋性中毒、细胞凋亡和炎症(1)。在最初损伤后的几星期至几个月内重建和重塑机制是有效的，目的在于对已经发生的损害补偿至某一程度(2)。所有造成损害和促进康复的事件提供了治疗介入的机会。所需的治疗是一种能阻断引发细胞死亡的机制或增强康复或理论上两者均可的方法。可能的治疗候选者是属于天然造血细胞因子促红细胞生成素系列的具有红细胞生成活性的分子。
近来，促红细胞生成素由于其在非造血系统中的效果包括在神经系统(4)中的功能已经引起了相当的注意。当促红细胞生成素受体被局限于神经元亚型以及星形胶质细胞和小胶质细胞(7，8)时，通过星形胶质细胞对缺氧(5，6)响应而在中枢神经系统(CNS)中局部产生并释放促红细胞生成素。这些细胞类型中促红细胞生成素的功能仍不清楚，但它已经显示出能阻断体外编程性细胞死亡，由许多不同的刺激素包括谷氨酸盐、缺氧(9)和血清撤除(10)诱导，表明其能通过阻断细胞凋亡(11)促进细胞存活。除了促红细胞生成素的神经保护作用，其被报道还可用于调节炎症(12)，即另一个中风治疗的潜在靶点。进一步而言，促红细胞生成素已经显示出能减少动物CNS损伤模型，包括中风(14)、脊髓损伤(15)、外伤性脑损伤(14)和视网膜损害(16)模型中的损害，且近来显示还具有缺血预适应(6)的保护效应。
促红细胞生成素在CNS中的功能已经引起了相当的注意，特别归功于其被报道的神经保护作用。促红细胞生成素限制CNS损伤模型中的有关损害的能力与表明其具有在疾病过程中起到某些机制的潜力的数据相结合，使得促红细胞生成素成为用于治疗神经系统急性疾病包括中风的有吸引力的候选者。然而促红细胞生成素引发这些保护效应的确切机制尚不清楚，促红细胞生成素减少中风(10)、脊髓损伤(15)、和视网膜损伤(16)模型中的细胞凋亡的数据表明其阻断细胞凋亡的能力是关键功能。假设细胞凋亡在最初局部缺血性发作后能持续数天，在损伤后的数天之内连续给药促红细胞生成素是必需的，以最佳化治疗效果。然而迄今为止，没有从事于该问题的临床前研究，据报道在评估促红细胞生成素治疗局部缺血性中风(19)的导向性临床研究中，促红细胞生成素持续给药超过数天的结果呈阳性。
自然或天然的促红细胞生成素是能通过调节红系前体细胞(3)的分化、增殖和存活来控制红细胞生成的30-kDa糖蛋白。如本文中所使用及在权利要求中所定义的，术语″EPO″应包括那些通过天然促红细胞生成素受体介导具有刺激红细胞生成能力的多肽和蛋白。术语″EPO″包括自然或天然的促红细胞生成素以及重组人促红细胞生成素(r-HuEPO)。还包括在术语EPO范围之内的有促红细胞生成素类似物、促红细胞生成素同种型、拟促红细胞生成素、促红细胞生成素片断、促红细胞生成素混和蛋白、融合蛋白寡聚体和上述多聚体、上述同系物、上述糖基化模式变体、上述拟肽和突变蛋白、以及进一步包括不管是通过合成或工业制造方法，包括但不限于，重组(无论是产自cDNA还是基因组DNA)、合成、转基因和基因活性方法获得的那些，以及进一步包括含上述列举物小修饰体的那些促红细胞生成素分子。设计和合成如本领域普通技术人员公知的拟肽的方法，记载于美国专利Nos.4,833,092、4,859,765中；4,853,871和4,863,857所公开的内容在此均全部引入作为参考并用于所有目的。另外，具有红细胞生成活性的多肽和蛋白、具有促进红细胞生成能力的小分子也包括在术语EPO的范围之内，例如，具有促红细胞生成素活性的化合物，如通过上游激活反应刺激促红细胞生成素产生的分子。
特别优选的EPO分子是能刺激哺乳动物红细胞生成的那些。促红细胞生成素的具体实例包括α-红细胞生成素(EPREX、ERYPO、PROCRIT)、新红细胞生成刺激蛋白(NESPTM、ARANESPTM和α-darbepoetin)如专利申请EP640619中记载的重组人促红细胞生成素(Epoetin)的高糖基化类似物。其它预期的EPO分子也在本发明范围之内包括人促红细胞生成素类似物(如记载于国际专利申请WO 99/66054中的人血清白蛋白融合蛋白)、记载于国际专利申请WO 99/38890中的促红细胞生成素突变体、产自记载于美国专利5,688,679中的人促红细胞生成素基因ApaI限制性片断的ω-促红细胞生成素、记载于国际专利申请WO 99/11781和EP1064951中的经改变的糖基化人促红细胞生成素、记载于WO 98/05363、WO 01/76640或美国专利5,643,575中的PEG结合的促红细胞生成素类似物。经修饰用于内源性人促红细胞生成素表达的细胞系的具体实例记载于国际专利申请WO 99/05268和WO 94/12650中。通常优选的EPO形式是纯化的重组人EPO(r-HuEPO)，普遍以商标EPREX、ERYPO、PROCRIT或ARANESPTM制造和销售。本段中所有提及的每份专利和公开的专利申请的全部内容均在此引入作为参考并用于任何和所有目的。
EPO的长效形式也是被预期的并可能优选成为本发明某些实施方案中用作给药区段中第二和第三次接触给药。如本文中所使用的，″长效EPO″包括具有增长的循环半衰期的EPO缓释组合物和制剂，典型的通过修饰如减少免疫原性和清除率获得，并且EPO被包裹在高分子微球中。″长效EPO″的实例包括但不限于，记载于PCT公开WO2002049673(Burg et al.)中的具有聚乙二醇(PEG)的促红细胞生成素共轭物，记载于PCT公开WO 02/32957(Nakamura et al.)中的PEG-修饰的EPO，记载于PCT公开WO 94/28024(Chyi etal.)中的具有红细胞生成活性和具有至少一种与非抗原性聚合物共价连接的经氧化的碳水化物部分的糖蛋白共轭物和其它使用SCM-PEG、SPA-PEG和SBA-PEG制得的PEG-EPO。这些公开的专利申请的全部内容均在此全部引入作为参考并用于所有目的。
优选的聚乙二醇部分是甲氧基聚乙二醇(mPEG)部分。该部分优选使用甲氧基聚乙二醇类的琥珀酰亚胺酯衍生物加入。优选的甲氧基聚乙二醇类的琥珀酰亚胺酯衍生物的实例包括下式的羧甲基化聚乙二醇(SCM-PEG)的琥珀酰亚胺酯， (R是C1-8烷基；n是整数)SCM-PEG下式的聚(乙二醇)丙酸(SPA-PEG)的琥珀酰亚胺酯衍生物，其中R是C1-8烷基；n是整数，(R-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2-CO-OSu)；和下式的聚(乙二醇)丁酸(SPA-PEG)的琥珀酰亚胺酯衍生物，其中R是C1-8烷基；n是整数(R-(OCH2CH2)n-O-CH2CH2CH2-CO-OSu)。
制备SCM-PEG、SPA-PEG和SBA-PEG的方法是本领域公知的。例如，授予Harris等的美国专利No.5672662记载的PEG酸的活性酯类和具有单个丙酸或丁酸部分而没有其它酯链的相关聚合物。SCM-PEG的制备记载于，如Veronese等的(1989)，Journal ofControlled Release，110145-54中。
SPA-PEG包括mPEG-SPA(甲氧基-PEG-琥珀酰亚胺丙酸酯)。SBA-PEG包括mPEG-SBA(甲氧基-PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯)。活性聚合物如SBA-PEG和SPA-PEG，均商业可得并可得自如ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville，Alabama，U.S.A。
SCM-PEG(R-(OCH2CH2)n-O-CH2-CO-OSu；R是C1-8烷基；n是整数)包括羧甲基化的PEG(mPEG-SCM)的甲氧基-PEG-琥珀酰亚胺酯。根据Greenwald et al.的报道，SCM-PEG″与蛋白反应可形成稳定的酰胺，但也报道了tl/2水解[Shearwater Polymers，Huntsville，AL，Jan 1996 catalog，p 46]在pH8时＜1分钟，从而最小化了其在含水溶液中用于蛋白修饰的有效性...″(Bioconjugate Chem.，7(6)，638-641，1996)。
现在，SCM-PEG通常可以由如Delmar Chemicals，Inc，Quebec，Canada合成。
SCM-PEG、SPA-PEG和SBA-PEG主要与赖氨酸的伯氨基和N-氨基末端反应。SCM-PEG5K、SPA-PEG和SBA-PEG5K分别与EPO的反应显示如下，其中OSu代表n-羟基琥珀酰亚胺，和m是1-4，n是整数
为了研究促红细胞生成素可能对于CNS的急性损伤包括中风的治疗是有效的，并且还可能抑制对迟发神经毒性如细胞凋亡和炎症的响应过程的假说，申请人试验了一些给药方案，目的在于最佳化促红细胞生成素在病灶性局部缺血性中风中的活性。申请人在本文中显示了在数天内倍剂量给药能使患永久性中脑动脉闭塞的鼠的梗塞面积减少并改善功能性结果。另外，促红细胞生成素的延缓给药，甚至是在阻塞后的大约24小时给药，也能改善功能性结果而不依赖于梗塞面积的减少。申请人已经发现促红细胞生成素以2500IU/kg的多天给药方案对于改善遭受MCAO鼠的结果是最有效的。在这些研究中，所发现的梗塞面积的减少相对小些(30％)，由于坏死被认为是造成病灶性局部缺血性中风(20)的永久性模型中梗塞量的细胞死亡的基本方法，因此不必惊讶于具有抗细胞凋亡作用机制的分子。
因而，本发明提供了一种治疗患者局部缺血性发作的方法，包括给予所需患者治疗有效量的促红细胞生成素，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量促红细胞生成素，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量促红细胞生成素。优选，对局部缺血性发作患者的治疗包括促进局部缺血性发作造成的任何后果如神经学损害或梗塞的康复。在一个方面，局部缺血性发作的康复通过梗塞面积的减少来表示。在另一个方面，局部缺血性发作的康复通过患者功能性结果的改善来表示，如来自由行为评分系统评估的一个或多个分数的改善。本发明所提供的治疗结果可通过使用本领域公知的评定方法进行评估，包括但不限于医学成像系统如核磁共振成像(MRI)、CTA(计算机断层血管造影术)和CT扫描(计算机断层摄影术)、神经学试验、须触试验和足错试验(19)。
本发明还提供了抑制患者局部缺血性发作后CNS中细胞凋亡或炎症的方法，包括给予所需患者治疗有效量的促红细胞生成素，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量促红细胞生成素，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量促红细胞生成素。
结果证明促红细胞生成素的早期给药是必需的，以获得梗塞面积的减少。如果治疗在阻塞后6小时开始的话就无效了。特别是，在阻塞一开始、24小时和48小时时以2500IU/kg的剂量给予多天剂量的促红细胞生成素会导致减少30％的梗塞面积，而这些没有在5000IU/kg或1250IU/kg的剂量水平上发现。因此，本发明提供了一种减少在局部缺血性发作6小时之内最初接触促红细胞生成素的患者的梗塞面积的方法，包括给予所述患者每剂量在大约1500IU/kg至大约4500IU/kg之内的促红细胞生成素，其中在最初接触促红细胞生成素的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量促红细胞生成素，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量促红细胞生成素。
如本文中所使用的，术语″接触″是指单次剂量、重复的个人剂量或在单次给药后尽可能相对持续给药，如长效EPO，用法如含EPO的透皮贴剂或EPO植入物的植入。
另外，申请人现在惊奇的发现当在损伤后大约24小时时给药EPO，对遭受永久性MCAO的鼠有显著的功能性改善。因而，本发明进一步提供了一种促进患者局部缺血性发作后功能康复的方法，包括给予所述患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
在本发明的一个相关实施例中，EPO能以第三剂量给药患者。第三剂量优选局部缺血性发作后的大约20小时至大约60小时之内给予。其中第三剂量可以在第二剂量后的大约8小时至大约24小时之内给予。
如本文中使用的，术语″功能恢复″是指患者在局部缺血性发作后的行为改善。动物的功能恢复可以被评估，例如，使用经改良的Hernandez-Schallert足错试验(18)，其中将动物放置在配有0.5cm直径金属柱，柱间隔为2cm的网格上，观察2分钟，在此期间记录它们前后肢落下通过间隔的次数。人体的功能恢复可以通过用于测量基本神经系统功能如运动强度、感觉和协调，认知功能如记忆、语言和方向辨别能力，和功能性能力如基本的日常生活自理能力和仪器操作能力的仪器来评估。基本神经系统功能的恢复可用仪器如NIH strokeScale(NIHSS)(31)测量，认知功能的恢复可以通过神经心理测验如Boston命令试验、Trail-making试验和California语言学习试验来测量，日常生活自理能力可以通过仪器如ADCS/ADL(Alzheimer′s病临床研究/日常生活自理能力)测量器或Bristol日常生活自理能力测量器来测量，所有试验在本领域均是公知的。
如本文中所使用的延缓性给药的示例，不会导致梗塞面积的减少。对于该发现的一种可能性解释就是TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色法不能精确的表示梗塞区域。为了证明这种可能性，对代表性动物切片以进行一种更广泛的形态学分析方法与TTC分析法相比较。在TTC染色边缘内没有检测到完整的神经元(数据显示无)，从而表明该现象对我们的观察是不负责任的。因而，通过抑制远离梗塞区的区域内延缓性细胞凋亡或可能通过增强内源性重建或重塑发生，EPO的延缓性给药改善了功能而不依赖于梗塞区域面积的减少。
如上提及的，细胞凋亡可能在局部缺血性损伤后持续发生数天。延缓性细胞凋亡发生在局部缺血性半影中，并导致最终的梗塞量(21，22)。其还发生在远离梗塞区的区域内，最可能是由于供给神经元的营养缺失因而缺乏给梗塞区域的关键投影。由于EPO已经显示出对神经元总体(10，23)是有营养的，对于延缓性EPO给药的可能解释就是阻止解剖学上位于距梗塞区域某段距离的神经元的延缓性细胞凋亡。这些神经元总体的不足可用于解释我们行为评估中所观察到的功能性行为的保护作用。
不能排除另外一种解释，即EPO通过支持所述重建和重塑机制如神经突生长、突触形成、突触强化或暴露而增强了功能恢复过程。这种功能中的改善早至7天时就已经发现而非新长途功能连接的建立，然而两种报道表明至少一种可塑性的开端通过7天就已显而易见了。Kawamate et al.(24)检查了病灶型局部缺血性中风的鼠模型中基本成纤维细胞生长因子(bFGF)的效应和Stroemer et al.(25)查看了在类似模型中的d-苯丙胺治疗，观察到用药物治疗在功能性行为中有改善但并不伴随梗塞面积的减少。值得注意的是，在这些研究中虽然对动物的观察达两个月，然而通过7天行为改善就已经是显著的了。
免疫组织化学分析显示了这些研究中神经突萌发增强的证据，其决定于生长相关蛋白43(GAP43)表达的增加，在阻塞后的第3天达到最高。之前EPO已经显示出促进神经突萌发(26)。收集这些数据，表明在损伤后的最初几天内某些修复过程被抑制，并且EPO可以作用于这些早期过程中以增强功能恢复。其他的组织再生过程如暴露或突触强化能在相当短的时期内发生，但是EPO对这些事件的影响还没有显现。
本领域普通技术人员能容易的决定不同情况下给药的适宜量和方法。任何给药剂量段的任何具体接触量中EPO的给药量是没有限制的，已经证明EPO的给药只要基本上没有毒性效应，每次接触、剂量段或多天给药方案中EPO的任何量都可以给药。也就是说，要是不用于其他的目的就不必要对其进行限制，常规治疗方针表明患者接受每剂量治疗有效量EPO为大约500IU/kg至大约10000IU/kg。优选，患者接受每剂量EPO量为大约1250IU/kg至大约5000IU/kg。更优选，患者接受每剂量EPO量为大约2500IU/kg。如上述提及的，EPO的给药可以以任何本领域已知的或新发展的给药方式。
本发明期望EPO的多种给药途径可用于本发明的实践中。优选，每剂量EPO可以以所期望的使患者尽可能快接触EPO的方式来给药。也就是说，期望多种给药途径，包括但不限于静脉给药、皮下给药、肌内或腹腔内给药。就口服制剂的有效性来讲，所述的给药途径也是值得考虑的而且特别适于本文中所记载的第二次或随后的EPO给药。
对受益于给药方案的患者不作特别的限制，可以包括人和动物患者，优选哺乳动物患者。
如下的实施例用于举例说明本发明，但不能解释为对它的限制。通过参考随后所列的数据和例子可以更好的理解本发明，但是本领域技术人员能容易的理解它们仅仅是作为本发明的例证，完整的描述记载于它们随后的权利要求中。
实施例1材料和方法动物和MCAO外科手术操作中所用的动物经Johnson & Johnson Institutional AnimalCare和Use Committee认可。体重在290g和320g之间的雄性斯普拉-道来氏(Sprague-Dawley)大鼠(Charles River Laboratories，Raleigh，NC)被分别关在温度可控的环境之内，经过12小时(6:00-18:00)光的明暗循环，并给予食物和水ad libidum。用2.5％异氟烷麻醉动物，并使其体温维持在37℃。根据Zimmerman etal.(17)中所记载的进行永久性MCAO。简单的说，在腹侧前开个切口使左右颈总动脉(CCA)直观可见。使用4-0结扎丝线对右CCA进行永久性阻塞。进行开颅手术，在前1mm和侧3-4mm形成卵圆孔以看见右大脑中动脉(MCA)。随后，通过烧灼豆纹动脉的远端将MCA永久性阻塞。随后使用动脉瘤夹将左CCA短暂性阻塞1小时。在阻塞后，用外科缝合线将切口缝合，将布比卡因(0.25％)涂于切口部位。在加温灯下，动物从麻醉中苏醒。
24小时后，用神经学试验、须触试验和足错试验对鼠进行评估。如表1中所示，在阻塞后对遭受MCAO的鼠的损伤严重度评估24小时。完成三种试验神经学评估、须触试验和足错试验(19)。得分超出预定参数的鼠被判定具有太轻或太严重的缺陷，并被排除进行进一步的分析。神经学得分为0或须触得分≥1和足错得分≤2(无损伤)的动物或神经学得分≥2(严重损伤)的动物被排除进行进一步的分析。
7天后分析动物的梗塞面积和功能性结果。
表1.用于评估损伤的行为评分系统

药物和给药将酒石酸右啡烷(Sigma Chemicals)溶于浓度为25mg/ml的EPO载体中(4.38mg/ml NaCl，1.lmg/ml NaH2PO4，1.6mg/ml Na2HPO4，5.0mg/ml甘氨酸，0.3mg/ml溶于蒸馏水中的Tween80，Ph6.9)。在载体溶液中将重组人促红细胞生成素(Epoetin alfa)稀释至最终浓度。所有药物均通过三种给药方案之一以1ml/kg的量由尾静脉静脉给药(i.v.)1)单天给药方案-在左CCA阻塞之前(0小时)迅速给药载体、右啡烷(25mg/kg)或EPO(5000IU/kg)，随后在1小时后在血流恢复后迅速给予第二剂量。
2)多天给药方案-在0小时给药载体或EPO(5000IU/kg，2500IU/kg或1250IU/kg)，在之后的24小时和48小时给予随后的剂量。
3)延缓性多天给药方案-在阻塞后6小时、24小时和48小时给药载体或EPO(5000IU/kg或2500IU/kg)，或在阻塞后24小时或48小时给药。
梗塞面积的测定7天后将动物处死，将大脑移出并置于冰冻PBS中。使用脑基质(Kent Scientific)将大脑切成2mm厚的部分，随后用2％2，3，5-氯化三苯四唑染色，脑部分用与立体显微镜相连的CCD照相机成像，用计算机辅助设备测定梗塞面积。将所有部分的梗塞量相结合用以得到绝对梗塞量。还测定了相对梗塞量(绝对梗塞量/脑半球总量)。
行为分析使用经改良的Hernandez-Schallert足错试验(18)评估动物的功能康复。在该试验中，将动物放置在配有0.5cm直径金属柱，柱间隔为2cm的网格上。对动物观察2分钟，记录它们前后肢落入间隔的次数。
统计分析使用Kruskal-Walis试验进行治疗组的非参数分析，随后通过该分析比较治疗组和载体对照组。
结果外科结果229只遭受MCAO的动物用于这试验。其中28只在第7天分析前死亡，4只被排除用于在24小时的评估(参见材料和方法和表1)。在研究中，为了对照梗塞面积和梗塞位置，具有皮下受累(n-21)梗塞的动物被排除分析。体重或体温不同的治疗组之间没有统计学差异。
单天给药方案EPO的单天给药方案用于减少梗塞量和改善功能性结果的能力已经被试验。当在阻塞后7天分析时，用右啡烷(25mg/kg)或EPO(5000IU/kg)治疗的动物相比较于用载体治疗的，在梗塞量或功能性结果上没有显示出差异(附图1)。当在阻塞后24小时分析时，右啡烷减少了梗塞量(未显示数据)。
多天给药方案试验在阻塞时和阻塞后24小时和48小时给予EPO多天剂量的效果。以2500IU/kg的EPO多天治疗将导致绝对梗塞面积(附图2A)和具有统计学意义(p＜.05)的相对梗塞面积(数据未显示)均减少30％。而在5000IU/kg或1250IU/kg的剂量水平上均不能观察到梗塞面积的减少。行为分析显示，与用载体治疗的动物相比，5000IU/kg时功能恢复显著改善61％，在2500IU/kg时为65％(分别为p＜.01和p＜.001，附图2B)。EPO在1250IU/kg时对功能性结果无效。
延缓性多天给药方案已知在中风发生后将中风患者迅速送入急救室通常是不现实和不可能的。本发明证明了在辅助中风康复中EPO治疗的延缓发生是有效的。在本发明中，阻塞后EPO的最初剂量被延缓了6小时，随后在24小时和48小时给药。对于6小时的治疗延缓，无论是5000IU/kgEPO剂量还是2500IU/kg EPO剂量都不能导致梗塞面积(附图3)的显著减少。意料不到是，在5000IU/kg和2500IU/kg的剂量水平下，其功能分相对于载体分别增加了46％(p＜.05)和56％(p＜.01)。当第一天的给药剂量被清除，在损伤后的24小时和48小时给药，也能观察到类似的结果(附图4)即相对于载体，其在5000IU/kg(49％)和2500IU/kg(68％)梗塞面积没有减少，在功能性结果上显著改善。
与用载体治疗的动物相比，EPO的多天给药方案减少了梗塞面积并改善了功能性结果。延缓EPO的最初剂量至梗塞后24小时对于改善功能性结果是有效的，但不能减少梗塞面积。单天给药方案对于梗塞面积或功能性结果均无效。
这些工作支持了先前报道的EPO在急性局部缺血性中风动物模型中的有效性。而且，这些数据证明了能延长有效的用于EPO改善功能性结果的治疗时间窗，并证明了当考虑EPO用于神经系统疾病的治疗时该给药方案是重要的。
然而上述说明仅教导了本发明的原理，其中的实施例用于举例说明，能理解的是本发明的实践包括了所有通常的变化、改变和/或修饰，它们均包括在如下权利要求及其等同体的范围之内。
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权利要求
1.一种用于促进局部缺血性发作后康复的促红细胞生成素的给药方案，包括给予所需患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
2.权利要求1的给药方案，其中在局部缺血性发作后大约24小时给予第一剂量EPO。
3.权利要求2的给药方案，其中在第一剂量后的大约24小时给予第二剂量。
4.权利要求1的给药方案，进一步包括在局部缺血性发作后的大约20小时至大约60小时之内给予患者第三剂量EPO。
5.权利要求4的给药方案，其中在第二剂量后的大约8至24小时之内给予第三剂量EPO。
6.上述权利要求任一的给药方案，其中至少一次剂量的EPO是通过皮下、肌内、静脉或腹腔内途径给药。
7.上述权利要求任一的给药方案，其中EPO的每次给药剂量选自大约500IU/kg至大约10000IU/kg。
8.权利要求7的给药方案，其中EPO的每次给药剂量选自大约2500IU/kg至大约5000IU/kg。
9.权利要求7的给药方案，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
10.上述权利要求任一的给药方案，其中局部缺血性发作是中风。
11.权利要求10的给药方案，其中至少一次EPO的给药剂量为大约2500IU/kg。
12.权利要求11的给药方案，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
13.上述任一权利要求的给药方案，其中促红细胞生成素是长效EPO。
14.一种治疗局部缺血性发作患者的方法，包括给予所述患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
15.权利要求14的方法，其中在局部缺血性发作后大约24小时给予第一剂量EPO。
16.权利要求15的方法，其中在第一剂量后的大约24小时给予第二剂量。
17.权利要求14的方法，进一步包括在局部缺血性发作后的大约20小时至大约60小时之内给予患者第三剂量EPO。
18.权利要求16的方法，其中在第二剂量后的大约8至24小时之内给予第三剂量EPO。
19.权利要求14-18的方法，其中EPO的每次给药包括通过皮下、肌内、静脉或腹腔内注射EPO。
20.权利要求14-18任一的方法，其中EPO的每次给药剂量选自大约500IU/kg至大约10000IU/kg。
21.权利要求20的方法，其中EPO的每次给药剂量选自大约2500IU/kg至大约5000IU/kg。
22.权利要求21的方法，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
23.权利要求14-18任一的方法，其中局部缺血性发作是中风。
24.权利要求23的方法，其中至少一次EPO的给药剂量为大约2500IU/kg。
25.一种促进患者局部缺血性发作后功能恢复的方法，包括给予所述患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
26.权利要求25的方法，其中在局部缺血性发作后大约24小时给予第一剂量EPO。
27.权利要求26的方法，其中在第一剂量后的大约24小时给予第二剂量。
28.权利要求25的方法，进一步包括在局部缺血性发作后的大约20小时至大约60小时之内给予患者第三剂量EPO。
29.权利要求28的方法，其中在第二剂量后的大约8至24小时之内给予第三剂量EPO。
30.权利要求28-32任一的方法，其中EPO的每次给药包括通过皮下、肌内、静脉或腹腔内注射EPO。
31.权利要求28-32任一的方法，其中EPO的每次给药剂量选自大约500IU/kg至大约10000IU/kg。
32.权利要求31的方法，其中EPO的每次给药剂量选自大约2500IU/kg至大约5000IU/kg。
33.权利要求32的方法，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
34.权利要求28-32任一的方法，其中局部缺血性发作是中风。
35.权利要求34的方法，其中至少一次EPO的给药剂量为大约2500IU/kg。
36.权利要求35的方法，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
37.一种减少在局部缺血性发作6小时之内最初接触EPO的患者的梗塞面积的方法，包括给予患者每剂量大约1500IU/kg至大约4500IU/kg的EPO，其中在最初接触EPO后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
38.权利要求37的方法，其中在局部缺血性发作后大约24小时给予第一剂量EPO。
39.权利要求38的方法，其中在第一剂量后的大约24小时给予第二剂量。
40.权利要求37的方法，进一步包括在局部缺血性发作后的大约20小时至大约60小时之内给予患者第三剂量EPO。
41.权利要求40的方法，其中在第二剂量后的大约8至24小时之内给予第三剂量EPO。
42.权利要求37-41任一的方法，其中EPO的每次给药包括通过皮下、肌内、静脉或腹腔内注射EPO。
43.权利要求37-41任一的方法，其中EPO的每次给药剂量选自大约1800IU/kg至大约4000IU/kg。
44.权利要求43的方法，其中EPO的每次给药剂量选自大约2000IU/kg至大约3000IU/kg。
45.权利要求44的方法，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
46.权利要求37-41任一的方法，其中局部缺血性发作是中风。
47.权利要求46的方法，其中至少一次EPO的给药剂量为大约2500IU/kg。
48.权利要求47的方法，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
49.一种抑制患者局部缺血性发作后CNS中的细胞凋亡或炎症的方法，包括给予所述患者治疗有效量的EPO，其中在局部缺血性发作后的大约8小时至大约26小时之内给予第一剂量EPO，随后在第一剂量后的大约8小时至大约26小时之内给予第二剂量EPO。
50.权利要求49的方法，其中在局部缺血性发作后大约24小时给予第一剂量EPO。
51.权利要求50的方法，其中在第一剂量后的大约24小时给予第二剂量。
52.权利要求51的方法，进一步包括在局部缺血性发作后的大约20小时至大约60小时之内给予患者第三剂量EPO。
53.权利要求52的方法，其中在第二剂量后的大约8至24小时之内给予第三剂量EPO。
54.权利要求49的方法，其中EPO的每次给药包括通过皮下、肌内、静脉或腹腔内注射EPO。
55.权利要求49的方法，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
56.权利要求49的方法，其中局部缺血性发作是中风。
57.权利要求56的方法，其中至少一次EPO的给药剂量为大约2500IU/kg。
58.权利要求57的方法，其中EPO的每次给药剂量为大约2500IU/kg。
全文摘要
本发明证明了EPO在促进患者局部缺血性发作后康复中的有效性。本发明还证明了在治疗局部缺血性中风中最初使用EPO的机会的期限要长于先前所知道的。
文档编号C07K14/505GK1764470SQ200480008333
公开日2006年4月26日 申请日期2004年3月26日 优先权日2003年3月27日
发明者M·戈尔德, M·J·伦茨, K·J·罗德斯, N·蒂鲁马莱, F·法雷尔, L·乔利菲 申请人:詹森药业有限公司