专利名称：土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物的新用途，具体涉及一种土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用。
背景技术：
中药土槿皮为松科植物金钱松(Pseudolarix Kaempferi Gorden)的干燥根皮或近根树皮。最早见于清代赵学敏所著的《本草纲目拾遗》，性温、味辛、有毒。归肺、脾经。具有杀虫、止痒的功效。中医临床用于杀虫止痒、手足癣、神经性皮炎、癌肿等。
土槿皮乙酸是从土槿皮中提取出的一种有效成分，其化学结构为二萜酸。在以往的应用和研究中，土槿皮乙酸主要用于抗真止血和神经性皮炎等方面。有实验报道，土槿皮乙酸能抑制肝癌细胞系的增殖，但作用机制不明确。土槿皮虽然已用于治疗肿瘤，有一定疗效，但由于其活性成分的作用机制尚不明确，限制了其作为抗癌药物的开发以及与其他药物的配伍使用。
土槿皮乙酸化学结构式
发明内容
本发明的目的是提供一种从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用。
上述的目的通过以下的技术方案实现一种从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用。
上述从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物直接作为抗癌药物的应用。
上述从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物作抗癌药物的先导化合物的应用。
这个技术方案有以下有益效果1.本发明，从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸可以与其他药物配伍成抗癌新药进行使用。
2.本发明，从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸也可以直接开发成抗癌药物。
3.本发明，从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为抗癌药物具有剂量小，起效快，效果明显的特点。
4.本发明从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为抗癌药物，其可以抑制肿瘤细胞的生成，促使肿瘤细胞的凋亡。
附图1为在倒置显微镜观察正常的HeLa细胞和加入浓度为5μM的土槿皮乙酸的HeLa细胞的示意图；附图2为在荧光显微镜下观察正常的HeLa细胞和加入浓度为5μM的土槿皮乙酸的HeLa细胞的示意图；附图3为在倒置显微镜观察正常的A375-S2细胞和加入浓度为5μM的土槿皮乙酸的A375-S2细胞的示意图；附图4为在荧光显微镜下观察正常的A375-S2细胞和加入浓度为5μM的土槿皮乙酸的A375-S2细胞的示意图；附图5为土槿皮乙酸诱导HeLa细胞发生凋亡后的HeLa细胞示意图；附图6为土槿皮乙酸诱导A375-S2细胞发生凋亡后的A375-S2细胞示意图。
本发明的
具体实施例方式实施例1本发明采用2种细胞株进行细胞培养，通过形态学观察方法、核荧光染色观察及DNA片段化分析实验证实了土槿皮乙酸诱导HeLa细胞和A375-S2细胞死亡机制为诱导细胞凋亡。土槿皮乙酸可以作为抗癌药物的先导化合物，也可以直接开发成抗癌新药或与其他药物配伍成抗癌新药。
土槿皮乙酸作为抗癌药物具有剂量小，起效快，效果明显的特点。
实验一、细胞形态学观察一、原理本实验从细胞形态学上证实土槿皮乙酸的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的特征。有效的抗癌成分对体外培养的肿瘤细胞有特定的生物学效应，能使提外肿瘤细胞产生形态学上的变化，抑制肿瘤细胞的生成，促使肿瘤细胞的凋亡。在光学显微镜下，凋亡细胞表现出，细胞核固缩，染色体断裂，断片沿核膜浓聚成多形性高密度颗粒区；核膜皱缩，崩解后包裹染色体弥散于细胞浆中；细胞全面皱缩，细胞膜皱缩外突；但细胞膜的结构和功能仍保持完整，内容物无溢出；最后，细胞膜包裹细胞器或核片段形成比细胞小的凋亡小体。体外培养的贴壁细胞发生凋亡时，细胞变小变圆，失去粘附力从附着处脱落。经荧光染料Hoechst 33258染色后，细胞内会有颗粒形成。
实验材料(一)材料和仪器1、人宫颈癌HeLa和人黑色素瘤A375-S2细胞；2、RPMI-1640培养液，10％胎牛血清、2mmol·L-1谷氨酰胺；3、0.25％胰蛋白酶；4、CO2培养箱，5％CO2，37℃；5、倒置显微镜；6、荧光显微镜(二)实验方法1、倒置显微镜观察以每瓶1×105个细胞的密度接种于50mL细胞培养瓶中，培养24h后加入浓度为0和5μM的土槿皮乙酸，分别于0，24h用倒置显微镜观察。
2、荧光染色以每瓶1×105个细胞的密度接种于50mL细胞培养瓶中，培养24h后加入浓度为0和5μM的土槿皮乙酸，培养24h，收集细胞，PBS洗1次，1000×g离心5min，以1mL 3.7％多聚甲醛重悬细胞，室温固定1h，1000×g离心5min，弃上清，用PBS洗1次，将细胞重悬于100μL PBS中，取细胞悬液10μL，加入2μL Hoechst 33258(1mM)，37℃染色15min，荧光显微镜下观察。
三、结果如图1-4所示，光学显微镜下观察5μM土槿皮乙酸作用于细胞24h后细胞变圆，发泡，产生凋亡小体。荧光显微镜下观察正常胞全部蓝染，细胞壁完整，土槿皮乙酸5μM作用细胞24h后，可见明显的粒状荧光体聚集，即凋亡小体，是细胞发生凋亡的典型形态。
实验二酶标仪检测一、原理显色剂噻坐蓝(MTT)能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此现象。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接的反映活细胞的数量。在一定细胞数量范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。本方法灵敏度高、重复性好、操作简单、经济、实惠、易自动化、无放射性污染。
二、实验材料(一)材料和仪器1、RPMI-1640培养液(Hyclone，Logan，UT，USA)；2、MTT；3、DMSO；4、酶联免疫检测仪(Tecan，Salzburg，Austria)(二)实验方法以每孔5×104的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL，培养过夜后分别加入0，0.16，0.8，4，20，100，500μM的土槿皮乙酸，于12，24，36，48h后每孔加入5mg/ml MTT 15μL，继续培养4h后，舍弃上清。每孔加DMSO 150μL，振荡10min，以酶联免疫仪在490nm测定OD值。
结果
实验三DNA片段化电泳实验一、原理细胞凋亡时核内的内切核酸酶活化，活化了的内切核酸酶将DNA链在核小体连接区切成缺口，形成若干180～200bp或其倍数的寡核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈“阶梯状”图谱(DNA ladder)。这被作为判断有无凋亡发生的客观指标之一。
二、实验材料(一)材料和仪器1、RPMI-1640培养液；2、溴化乙锭；3、琼脂糖；4、RNase；5、proteinase K(二)实验方法收集1×106个以上的细胞，1000×g离心10min，用PBS洗2次，加入100μL细胞裂解液(10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM EDTA pH 8.0，0.5％TritonX-100)4℃裂解10min，25000×g离心20min，收集上清液。加入40ng/LRNase，37℃孵育1h，再加入40ng/L proteinase K，37℃孵育1h，加入20μL5M NaCl和120μL异丙醇，-20℃过夜。25000×g离心15min，去上清，再次25000×g离心5min，去上清，用Tris-EDTA(pH7.5)缓冲液溶解沉淀，在加2μL的溴酚蓝。用2％琼脂糖凝胶100V电泳40min，0.5mg/L溴化乙锭染色15min，蒸馏水洗30min，紫外灯下拍照。
三、结果如图5-6所示，2.5，5，10μM土槿皮乙酸作用36h后，可诱导HeLa、A375-S2细胞发生明显的DNA片段化，即诱导细胞发生凋亡。
权利要求
1.一种从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用。
2.根据权利要求1所述从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物直接作为抗癌药物的应用。
3.根据权利要求1或2所述从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物作抗癌药物的先导化合物的应用。
全文摘要
土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用，土槿皮乙酸是从土槿皮中提取出的一种有效成分，在以往的应用和研究中，土槿皮乙酸主要用于抗真止血和神经性皮炎等方面。有实验报道，土槿皮乙酸能抑制肝癌细胞系的增殖，但作用机制不明确。土槿皮虽然已用于治疗肿瘤，有一定疗效，但由于其活性成分的作用机制尚不明确，限制了其作为抗癌药物的开发以及与其他药物的配伍使用。本发明从金钱松根皮中提取的土槿皮乙酸作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用，可以有效的解决以上的问题。本发明适合于与其他药物配伍成抗癌新药进行使用或直接制成抗癌药物使用。
文档编号A61P35/00GK101062026SQ200610009948
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者龚显峰, 安巍巍, 李强, 赵学玲, 王阳, 吴振 申请人:黑龙江大学