专利名称：多巴胺受体新亚型d5b基因及编码的蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一个多巴胺受体新亚型的基因及编码的蛋白与应用。
背景技术：
某些神经精神病(包括Parkinson病、精神分裂症、药物依赖、偏头痛、狂躁、抑郁症和抽动秽语综合征等)、心血管疾病、肾病与多巴胺受体有关，多巴胺受体在中枢神经系统中表达，控制运动功能、情绪、内分泌生理系统。
人们对多巴胺及其受体的作用位置进行了大量的研究。Cools和Rossum通过电生理实验和药理实验提出可能大脑中不止存在一种多巴胺受体，这是多巴胺研究的一个里程碑。20世纪70年代，基于第二信使分析人们研究多巴胺受体，例如cAMP的刺激，以及基于结合分析，都支持不止一个多巴胺受体的思想。1979年Kebabian和Calne在他们的一篇综述中为这种思想奠定了基础，在他的论文中，扩展了Spano的提法，指出多巴胺受体有两类，D1和D2，有不同的生化和药学特性，调节不同的生理功能。D1和D2两个G-蛋白偶联受体作用的G-蛋白和效应器及相关的通路是不同的。尽管生化研究说明这些受体亚型有多么不同，然而，直到20世纪80年代，利用克隆技术，通过对多巴胺受体的克隆，才揭示出这些受体的真正的不同程度。结果表明，至少有5个多巴受体，分为两个亚族，其性质分别类似于通过生化和药理学定义的D1和D2受体，这两个亚族分别称为D1样受体(D1和D5)和D2样受体(D2，D3，D4)。
多巴胺是基底核的主要神经递质，在运动控制和认知功能方面起着非常重要的作用。特别是D1样受体(D1和D5)受体。最近，D1样受体在大脑功能，尤其是在学习和记忆方面的功能，引起了人们巨大的兴趣。D1样受体的刺激太大或太少都会损害工作记忆。D1受体可能调节认知、影响Parkinson病。D1受体是前额皮质工作记忆关键的神经调节的影响因素，这个区域受许多神经疾病的影响。
多巴胺受体为单链蛋白，它的N端在双层类脂膜外侧，C端在膜内侧，在双层类脂膜的中间有7个疏水的跨膜区(TMD)。膜外侧和膜内侧各有3个片段，分别称为外三环(E1-E3)和内三环(11-13)，它们把各个TMD联接起来；膜外侧有2-3个糖基位点，和其稳定结构作用的双硫键。七个跨膜螺旋束在一起在膜上形成配体的结合位点。激动剂可能结合到疏水性的TM结构域上，蛋白质的中央，氨基酸残基高度保守，行成一个狭窄的结合口袋，可能是激动剂的结合位点。C未端可能有一些棕榈酰残基，能形成与膜更多的连接。与D2样受体相比，D1样受体N端为2个糖蛋白；膜内侧第三环小一些，而C端肽链很长。
在脑中，D1受体比其它多巴胺受体的分布广、表达高，在纹状体、伏隔核(nucleus accumbens，NAc)和嗅结节能检测到D1的mRNA，此外，在边缘系、海马和丘脑也检测到D1受体。在内茎核(entopeducular nucleus)、黑质网状部(substantianigra pars reticulata)，D1受体有高水平的表达，但却检测不到mRNA，说明在这些区域D1受体主要以投射存在。D5受体与D1受体相比，在大鼠中的表达要少得多，其表达限于海马、内侧乳头核(1ateral mamillary nucleus)、丘脑的束旁核。在某些嘴侧前脑(rostral forebrain)区域包括大脑皮层、背侧丘脑、斜角带、纹状体能检测到D5受体的mRNA，在黑质、中丘脑和海马能检测少量D5受体的mRNA。用D1和D5抗体检测这两个受体在灵长类动物的脑组织中不同区域的细胞和亚细胞分布，结果表明，D1和D5受体在前额页、前运动皮质(premotor cortex)、扣带皮质、内嗅皮质的锥体神经元以及海马和齿状回中共同表达。在前皮质和海马，D1和D5受体存在于突触前和突触后。在单个的锥体神经元中，D1受体主要集中在树突刺上，而D5主要集中树突骨干上。在嗅球，D1受体限于粒状层、网织层和插入到底外侧核的杏仁体。在尾状核，D1和D5主要位于中等大小的GABAA神经元。D5还存在于类胆碱能中间神经元，而D1不存在。D1受体存在于刺突触后到非对称突触的区域。D1和D5都位于具有多巴胺末端小突触特征的后突触密度。突触前D1和D5受体在轴突上形成不对称突触区。D1位于内茎核，黑质网状部，而D5检测不到，因此，如果D1和D5受体位于有尾的中等突刺神经元，也只有D1受体被转送到纹状体黑质末端。D1受体和D5受体在细胞和亚细胞水平上的位置不同，表明D1和D5受体虽然在药理学上是相同的但其功能上不是完全一样的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的多巴胺受体D5的亚型基因以及编码的蛋白。D5亚型与海马乙酰胆碱释放的调节有关。乙酰胆碱是一种神经递质，参与各种认知过程。D5亚型参与纹状体的信息的整理，能与gamma-氨基丁酸A(GABAA)受体相互作用，两个受体相互抑制其的功能。另外，D5受体调节与血压相关的信号通路，介导血压的响应，其功能对了解人类高血压产生的机制非常重要。
可能还存在没有克隆的D1样受体。其中一个问题是，目前克隆的D1样受体能否偶合磷酸肌醇(PI)的水解，尚不清楚。然而，肾中的D1样受体与PI的水解有关，据报道，D1受体能偶合PI水解。在纹状体，D1偶合PI的更新，不过，仍有争论。另一个争议的问题是，在肾中只检测到低水平的D1受体的mRNA，不能解释为什么在肾组织中D1激动剂有相对高的结合水平。最后，有些实验也揭示，在肾皮质膜或肾衍生的细胞上，与D1选择性激动剂(尤其是SCH23390)的结合存在两阶段的结合曲线。所有这些，说明还可能存在一个没有识别的亚型。
通过PCR方法，以人类基因组DNA和人类SHSY5Y细胞的基因组DNA为模板，筛选到D5受体和与之相似的另一个受体，称为D5B，并对这一基因进行了分析，序列如SEQ ID No.1所示。
Blast分析的结果显示，该基因与D5受体(如SEQ ID No.2所示)98％相同，与D5的两个假基因94％相似。而D5与两个假基因D5ψ1(如SEQ ID No.3所示)和D5ψ2有95％的相同，两个假基因之间98％相同，D5B更接近于D5。
通过对D5B、D5和D5一个假基因D5Ψ(GenBank data base M67440)的序列比较分析发现，在D5B中，与D5不同的地方总是与D5的假基因相同，与D5的假基因不同的地方总是与D5相同，特别是在COOH端，增加的碱基及其周围与D5的假基因完全一样。
我们对照了D5B、D5和D5一个假基因D5Ψ(GenBank data base M67440)的序列，分析核酸测序的结果如下。
编码区不同的氨基酸标注在D5序列上，破折号表示在这个位置上缺失，展开的∧符号表示在这个位置上插入，七个推测的跨膜结构域(TMDs)加上框并标记字母I-VII。推测的N糖基化位点用*标记，蛋白激酶A的磷酸化位点用上划线标记，蛋白激酶C的磷酸化位点用虚上划线标记，一个实方盒表示棕榈酰化的半胱氨酸。
这个核酸序列93.6％与D5一致，但它含有一个框内终止子(用圆圈标出)，因此不能合成功能蛋白受体。分析D5B的序列可以发现它有一个开放阅读框，编码一个含478个氨基酸的G-蛋白偶联受体(比D5多一个氨基酸Glu432谷氨酸)，是一个有功能的基因。分析这三个序列，发现在D5B与D5不同的地方，与D5Ψ相同，而与D5Ψ不同的地方，就与D5相同，在Glu插入点及附近与D5Ψ完全一样。D5与D5B有10处氨基酸不同，不同的氨基酸有氨基端的Gly5/Arg和Phe15/Leu，第二膜内环I2的Tyr148/His，第二膜外环E2的Pro202/Leu以及羧基端的Ile400/Met，Tyr410/Cys，Thr419/Pro，Asn422/Asp，Glu423/Gln和Gly432/Ser433。D5B与D5在羧基端的变化较大，有六个氨基酸不同，而且D5B中有一个Glu432插入，在此位点形成了Glu四聚体，D5受体的羧基端(CT-tail)影响受体的亲和性，推测其亲和性可能与D5有差别。这些氨基酸的变化与以前所报道的D5多态性变化带来的9个氨基酸的不同之间没有一点关联。
通过序列分析发现D5B有许多D5受体保守的位点6个天冬酰胺(星号标出的Asn7、Asn74、Asn199、Asn222、Asn351和Asn388)是潜在的N端糖基化位点。其中在氨基端的Asn7是所有多巴胺受体的所共有的结构特征。研究表明DA受体中，同一家族的氨基酸序列在跨膜区域(TMDs)具有相当高的一致性，如D1与D5亚型在TMDs有80％一致。我们发现D5B与D5在7个跨膜区域内(用黑线标出)也相当保守。其中TM2的Asp87是影响D1家族受体活性的重要因素，并且影响激动剂的结合；TM3的Asp120对于结合儿茶酚胺的胺基有重要作用；TM5的Ser229和Ser233是结合羟基的供氢载体；TM6的Phe有助于受体与芳香族配体的稳定结合；TM7的Asn351是D1家族受体共有的特征。
TM4与TM5间的E2区在D1，D5亚型中有明显差异，D1较短只有27个氨基酸，D5B与D5一样较长有41个氨基酸。膜外环E1，E2两个半胱氨酸位点Cys113，Cys217是多巴胺受体的保守位点，对于受体三级结构的稳定性具有重要作用。通过序列分析还发现一些蛋白激酶磷酸化的靶位点，四个蛋白激酶A的位点用上划线标出的Thr153、Ser260、Ser275和Ser287)，三个蛋白激酶C的位点，用上虚线标出的Thr153、Ser275和Ser283)，其中五个位点在膜内环I3区内，而I3区对于受体与G蛋白的耦联有着重要的作用，有着调节功能。在羧基端的一些Ser，Thr可以被受体激酶磷酸化。Cys375(用正方形标出)可以被棕榈酰基化，使受体的羧基端可以与质膜相铆定结合，此氨基酸在D1样受体中位于羧基端的起始处，而在D2样受体中则往往在羧基端的结尾处。D5B与D5的I3区有50个氨基酸，都属短的袢环结构，D5B与D5在第三膜内环(I3)的一致性，D5B在功能上，属于Gs型受体。
许多Gs-蛋白偶联受体的第三个胞内环较短，D5B的这个环与D5一样，因此，D5B应当是一个Gs蛋白偶联受体(见图1和图4)，实验证明确实如此，D5B是腺苷酸环化酶关联的Gs蛋白偶联受体。文献报道，D5和配体的亲和性与COOH未端有关。D5B与D5最大的区别在于COOH端，因此，可以预计两个受体与多巴胺的亲和性可能不同，实验结果显示，D5B对多巴胺的亲和性比D5高1倍左右。从图2和图3来看，D5和D5B对激动剂Dihydrexine和(±)-Choro-APB差别不大。
表一为D1、D5和D5B的分子特征对比表。
表一
在D5B中，与D5不同的地方总是与D5的假基因相同，与D5的假基因不同的地方总是与D5相同，特别是在COOH端，增加的碱基及其周围与D5的假基因完全一样(如表一所示)。
D5B介于D5与D5假基因之间，更接近D5，很可能是在进化过程中产生的，如果真如前面所说，D5的假基因是3′UTR的Alu序列产生一个长的RNA转录子，导致了D5的复制，随后将这个基因拷贝移到了一个新的位置，从而产生了D5基因的多重性。那么D5B的产生可能是D5复制过程中保存到现在的一个中间产物。
综合以上所述分析，发明人克隆到的D5B基因是一个新基因，是Gs型受体，是腺苷酸环化酶关联的，发明人采用报告基因方法和cAMP测定法，研究了这个基因的药理学功能。转染了D5B基因的细胞浓度依赖性地响应D1激动剂和多巴胺，D5B对多巴胺的亲和性比D5高；D1激动剂Dihydrexidine和(±)-Choro-APB都可以激活D5B受体。
由D5基因与多种疾病有关，可以预见，D5B可能与某些神经精神病(包括Parkinson病、精神分裂症、药物依赖、偏头痛、狂躁、抑郁症和抽动秽语综合征等)、心脏血管、肾病等有关。多巴胺受体在中枢神经系统中表达，控制运动功能、情绪、内分泌生理系统。多巴胺是基底核的主要神经递质，在运动控制和认知功能方面起着非常重要的作用。D5B可能在大脑功能，尤其是在学习和记忆方面的功能，起着重要的调节作用，可以作为研究和开发相关疾病的药物的重要靶点。
图1转染D5B和D5受体基因的D5B/6CRE/Luci/CHO细胞、D5/6CRE/Luci/CHO细胞在不同浓度的多巴胺下孵育6小时后测定荧光酶活性，纵坐标为相关活力，横坐标为多巴胺浓度(nM)图2D5B和D5受体基因药理学性质1D5B/6CRE/Luci/CHO细胞、D5/6CRE/Luci/CHO细胞在不同浓度dihydrexidine下孵育6小时后测定荧光酶活性，纵坐标为相关活力，横坐标为dihydrexidine浓度(nM)图3D5B和D5受体基因药理学性质2D5B/6CRE/Luci/CHO细胞、D5/6CRE/Luci/CHO细胞在不同浓度chloro-APB下孵育6小时后测定荧光酶活性，纵坐标为相关活力，横坐标为chloro-APB浓度(nM)图4HEK293中的D5B受体在不同浓度多巴胺刺激下cAMP的积累转染D5B的HEK293细胞在不同浓度的多巴胺下共孵30分钟，用竞争性ELISA法测定cAMP；纵坐标为cAMP浓度(pmol/ml)，横坐标为多巴胺浓度(nM)具体实施方式
实施例1D5B的克隆方法1用以下引物，以人类基因组DNA为模板，PCR扩增D5。引物中实下划线为EocRI的酶切位点，波浪下划线为HindIII的酶切位点。
Primer 15’-GGCGAA TTCGCG TGT GTG TGC GTG CTT GTC AGT GT-3’Primer 25’-GGGAAG CTTCTG AAG TTG GGA CCG CGC ACA GAC CG-3’在下面条件下进行反应。预变性94℃5min；变性温度94℃30s，退火温度从50到60℃，每2℃一个循环，最后在60℃增加20个循环，共30个循环，每个循环中72℃延伸2min，最后72℃延伸7min。
PCR产物经PCR产物纯化剂盒(vitegene)纯化，得0.025μg/μl PCR产物，然后用HindIII(TaKaRa)和EocRI(TaKaRa)共酶切。载体pcDNA3.1也用同样的方法酶切。
在EP管中依次加入二蒸水、内切酶缓冲液、DNA和内切酶，混合均匀，37℃保温2h。酶切后，用Vitgene的PCR产物纯化试剂盒，按其说明书进行纯化，得40μl浓度为0.0015μg/μl的PCR产物。pcDNA3.1载体酶切后去磷酸化，将酶切后的D5的PCR产物稀释到0.1ng/μl，按以上同样方法连接，转化Top10F’感受态细胞。挑选粗壮的单克隆，于LB培养基中培养，提取质粒并测序。
在所挑选的D5的单克隆中，可以筛选到与D5相近的受体D5B。
实施例2D5B的克隆方法2以人类的SHSY5Y细胞的基因组DNA为模板，用下两对引物进行PCR反应。
Primer 15′-gca gcc caa gcg gat cct gcg gat ctg cag tcc agc ccg aaa tgc t-3’.
Primer 25′-gaa tag ggc cct cta gat gca tgc tcg agc gga tat ctt aat gga atc cat tcc ggg t-3’在下面条件下进行PCR反应，预变性94℃ 5min；变性温度94℃ 30s，退火55℃30s，72℃延伸2min，30个循环。PCR产物用1％的琼脂糖胶电泳分析，回收1.5kb的PCR产物，连接到pMDT-18载体(TaKaRa)，对其中的41个克隆进行了测序，其中有24个克隆是D5受体，12个克隆是D5B受体，4个克隆是D5的假基因ψD51和1个假基因ψD52。
实施例3基因转染和细胞培养将CHO细胞于37℃，含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，使用细胞转染试剂(Lipofectin)试剂，以6CRE响应元件、含TATATA盒(TA)最小化启动子和荧光酶酶基因(Luciferase)构成报告基因，将D5B基因和报告基因转染到CHO细胞内。在含0.8mg/mL G418的培养基中筛选到稳定的转基因细胞D5B/6CRE/TA/Luci。
实施例4D5B药物理学功能测定1——多巴胺将细胞用相应的含600μg/ml G418的完全培养基1640按密度约3×105Cells/ml将D5/6CRE/TA/Luci和D5B/6CRE/TA/Luci细胞分别接种到两个96孔板中，每孔90μl，于37℃，5％的CO2的孵箱中培养24h，然后，加入10μl不同浓度的多巴胺，继续于37℃，5％的CO2的孵箱中孵6h，然后在细胞中，加入100μl萤火虫荧光酶底物Bright-GloTM，用Analyst HTTM进行检测。结果参见图1。
实施例5D5B药物理学功能测定2——D1激动剂按照实施例四的方法，分别用D1激动剂Dihydrexidine和(±)-CHLORO-APB代替多巴胺。结果显示，Dihydrexidine和(±)-CHLORO-APB都能激活D5B受体，Dihydrexidine与D5和D5B结合的EC50分别是4.0nM and 5.3nM，结果参见图2；(±)-CHLORO-APB结合D5和D5B受体的EC50分别是EC502.7nM和1.9nM，结果参见图3。
实施例4、5结果显示D5B/6CRE/TA/Luci细胞浓度依赖性地响应D1激动剂及多巴胺，其亲和性不同，D5B对多巴胺的亲和性比D5高(图2)。Dihydrexidine和(±)-CHLORO-APB都能激活D5B受体，dihydrexidine与D5和D5B结合的EC50分别是4.0nM and 5.3nM(图2)，(±)-CHLORO-APB结合D5和D5B受体的EC50分别是EC50 2.7nM和1.9nM(图3)
实施例6D5B受体在多巴胺刺激后的cAMP的变化在细胞转染前，先用无内毒素的质粒抽提试剂盒，按其说明书，制得超纯无内毒的DNA。HEK293细胞用DMEM(含10％的FBS、1％的双抗和1％的非必需氨基酸)以密度为3×105Cells/ml接种到六孔板，每个孔1ml，37℃，5％的CO2的孵箱中培养24h，细胞达到50％的融合度后，用fuegen 6，按其说明书，将D5B转染细胞HEK293。于37℃，5％的CO2的孵箱中培养24h后，收获细胞，按密度为1×105Cells/ml接种到96孔板中，于37℃，5％的CO2的孵箱中培养过夜后，加入10μl不同浓度的多巴胺，继续于37℃，5％的CO2的孵箱中孵0.5h，然后用cAMP试剂盒(low PH，Immunoassay，R&D)测定cAMP。方法如下移去96孔板中的培养基，每个孔中加入0.1N HCl 200μl，孵育20min，600×g离心，取上清进行下一步实验。在涂有羊抗兔多克隆抗体的96平板的每个孔中加入50μl中和液，加入100μl上述细胞裂解液或标准样品，再加入50μl cAMP与碱性磷酸化酶的交联物，再加50μl cAMP的抗体溶液。封好，室温下摇(500±50rpm)2h。移去上清，用200μl的Wash Buffer洗涤三次，倒立于吸水纸上，完全去除洗涤液。加入200μl的pNPP磷酸化酶底物，室温孵育1h，加入50μl的Stop Solution中止反应。在405nm测定OD值。根据标准值计算cAMP浓度，EC50＝2.75nM，结果参见图4。与报告基因方法基本相符。文献报道D5的EC50＝5nM，D5B对多巴胺的亲和性比D5大1倍。
序列表序列表一<110>申请人<120>多巴胺受体新亚型D5B基因及编码的蛋白与应用<160>2<210>1<211>1437<212>DNA<213>人<400>
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Met Leu Pro Pro Arg Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Pro Gly Gln Leu15Ala Leu Tyr Gln Gln Leu Ala Gln Gly Asn Ala Val Gly Gly Ser30Ala Gly Ala Pro Pro Leu Gly Pro Ser Gln Val Val Thr Ala Cys45Leu Leu Thr Leu Leu Ile Ile Trp Thr Leu Leu Gly Asn Val Leu60Val Cys Ala Ala Ile Val Arg Ser Arg His Leu Arg Ala Asn Met75Thr Asn Val Phe Ile Val Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Phe Val90Ala Leu Leu Val Met Pro Trp Lys Ala Val Ala Glu Val Ala Gly105Tyr Trp Pro Phe Gly Ala Phe Cys Asp Val Trp Val Ala Phe Asp120Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Val Ile Ser135Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Arg Pro Phe Arg His Lys Arg150Lys Met Thr Gln Arg Met Ala Leu Val Met Val Gly Leu Ala Trp165Thr Leu Ser Ile Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu Asn Trp180His Arg Asp Gln Ala Ala Ser Trp Gly Gly Leu Asp Leu Pro Asn195Asn Leu Ala Asn Trp Thr Leu Trp Glu Glu Asp Phe Trp Glu Pro210Asp Val Asn Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ser Leu Asn Arg Thr Try225Ala Ile Ser Ser Ser Leu Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile240Met Ile Val Thr Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Val Gln255
Ile Arg Arg Ile Ser Ser Leu Glu Arg Ala Ala Glu His Ala Gln270Ser Cys Arg Ser Ser Ala Ala Cys Ala Pro Asp Thr Ser Leu Arg285Ala Ser Ile Lys Lys Glu Thr Lys Val Leu Lys Thr Leu Ser Val300Ile Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Leu315Asn Cys Met Val Pro Phe Cys Ser Gly His Pro Glu Gly Pro Pro330Ala Gly Phe Pro Cys Val Ser Glu Thr Thr Phe Asp Val Phe Val345Trp Phe Gly Trp Ala Asn Ser Ser Leu Asn Pro Val Ile Tyr Ala360Phe Asn Ala Asp Phe Gln Lys Val Phe Ala Gln Leu Leu Gly Cys375Ser His Phe Cys Ser Arg Thr Pro Val Glu Thr Val Asn Ile Ser390Asn Glu Leu Ile Ser Tyr Asn Gln Asp Met Val Phe His Lys Glu405Ile Ala Ala Ala Cys Ile His Met Met Pro Asn Ala Leu Pro Pro420Gly Asp Gln Glu Val Asp Asn Asp Glu Glu Glu Glu Ser Pro Phe435Asp Arg Met Phe Gln Ile Tyr Gln Thr Ser Pro Asp Gly Asp Pro450Val Ala Glu Ser Val Trp Glu Leu Asp Cys Glu Gly Glu Ile Ser465Leu Asp Lys Ile Thr Pro Phe Thr Pro Asn Gly Phe His478
权利要求
1.多巴胺受体D5B的基因，是下列核苷酸序列之一a)序列表SEQ ID No.1；b)编码序列表SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸。
2.多巴胺受体D5B的蛋白质，其特征在于，具有序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述基因的表达载体。
4.含有权利要求1所述基因的转染细胞系。
5.权利要求1所述的基因在制备药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种多巴胺受体的新亚型D5B。通过PCR方法得到与多巴胺受体D5相似的一个新亚型D5B基因，它能编码一个含478个氨基酸的G－蛋白偶联受体；与D5受体相比，D5B受体对多巴胺亲和性更高。这一新亚型可作为开发精神、神经疾病、心脏血管、肾病药物的重要靶点。
文档编号A61P25/00GK1944647SQ200610030320
公开日2007年4月11日 申请日期2006年8月23日 优先权日2006年8月23日
发明者许治良, 江南, 胡应和 申请人:华东师范大学