专利名称：一种β－内酰胺酶、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗生素水解酶、其制备方法及其应用，尤其涉及β-内酰胺酶、其制备方法及其在清除残留抗生素方面的应用。
背景技术：
抗生素(Antibiotics)是微生物产生的在低浓度下有抑制或杀死其它微生物作用的化学物质。它是二十世纪最伟大的医学发现之一，种类繁多，可分为十余大类数千种，临床常用的有几百种。自上世纪40年代青霉素(β-内酰胺抗生素)问世以来，抗生素在治疗细菌性疾病中发挥了重要作用，使95％以上由细菌感染引起的疾病得到控制，其挽救的生命不计其数，因此说抗生素是济世良药并不为过。
因抗生素在挽救生命、保障健康中立下的功劳，许多人误认为抗生素能包治百病。事实上，不正确的抗生素使用是有害无益的。利弗在《抗生素的窘境》一书中指出“许多人相信抗生素能包治百病，事实是不必要的服用有害无益。”因此在看到抗生素功绩的同时，不可忽视其存在的毒副作用。
抗生素的毒副作用有①毒性反应这是最多见的一种不良反应，往往是因用药剂量过大或时间过长而对人的神经系统、内脏、造血系统和局部注射处产生毒性作用。如链霉素、卡那霉素、庆大霉素能引起耳蜗前庭器官损害，导致平衡失调，听觉减退或丧失；氯霉素能引起再生障碍性贫血；磷胺类抗生素能引起皮炎、皮疹、血管神经性水肿；大量使用四环素会造成肝脏的损害，小孩使用会影响牙齿和骨骼的发育等。②过敏反应这是一种不正常的免疫反应，几乎每种抗生素都有这种反应。如青霉素、链霉素、先锋霉素将会造成过敏性休克、药物热、皮疹、血管神经性水肿、血液恶病质、胶原性疾病等过敏反应。其中以迟发性过敏反应危险最大，常被疏忽而造成无法弥补的危害。③二重感染也称菌群交替症，指发生于抗生素应用过程中的新感染。发生二重感染的病原菌主要为金葡萄、真菌及肠道革兰氏阳性杆菌。这些病原菌由于反复与青霉素、链霉素、氯霉素等常用抗生素接触而逐渐产生耐药性，而原发病又使患者抵抗力大为下降，所以它们的蔓延与肆虐常会危及生命。④细菌耐药性改变经常使用抗生素会使人体内、体外的细菌产生耐药性。如葡萄球菌、肠道革兰氏阳性杆菌、结核杆菌、痢疾杆菌之所以长期肆虐，就是耐药性改变的结果。
产生耐药性的后果相当严重，它使花费大量人力、物力开发的抗生素失去效果，耐药菌肆虐却无药可治。青霉素最初是非常有效的药物，用量很小，现在即使使用几百万单位效果也不佳。耐药性是由于不合理的药物使用造成的，专家呼吁如再不控制抗生素的使用，人类很有可能回到没有抗生素的时代，人们将再次面临许多感染性疾病的威胁。一方面是病菌横行，一方面却是无药可用，大量的传染性疾病将严重危害人类的健康和生命，这绝非危言耸听。因为耐药性产生的速度远快于新药开发的速度，因此不能单纯依靠开发新抗生素来解决耐药性问题，如沙星类药物，没使用多久细菌就产生了耐药性。
造成耐药菌泛滥的另一重要原因是兽用抗生素。作为预防用药，饲料厂或养殖户一般在饲料中添加1％～2％的抗生素。添加抗生素有利于削弱胃肠内有害微生物；抑制、杀死致病菌，增强抗病能力，以防禽畜病瘟。因此抗生素是现代畜牧业不可或缺的至宝，但其残留又对人体健康构成严重威胁，因而又一直是近年来国际社会争论的焦点问题。
如前所述，抗生素均有毒副作用，经常食用含抗生素的食品，即使是微量的，也能使人出现荨麻疹或造成过敏性休克。长期食用抗生素残留的食物还会引起核黄素缺乏症和紫癜性损伤，特别是氯霉素，极易损害人骨髓的造血功能，引起再生障碍性贫血。
除了对人体的直接损伤之外，残留抗生素还将导致体内耐药菌大量产生。在此过程中，抗生素作为选择压，使耐药菌较敏感菌有生长优势，导致耐药菌株流行。目前在动物饲料中普遍加入土霉素、四环素类药物，实际上等于持续低剂量用药，有利于致病微生物获得耐药性。
随着经济快速发展，动物源性食品所占的比例越来越大，畜产品中的抗生素残留对人的危害也越来越严重。由于目前我国对养殖行业缺乏完善的管理制度，另外养殖从业人员素质较低，缺乏卫生知识，致使动物源性的食品卫生质量每况愈下。控制食品中抗生素的残留已到了刻不容缓的地步。
β-内酰胺抗生素由于具有广谱、便宜的优点，在人和动物身上应用都较多，因而其残留和引发的抗药性都十分严重。如果能使残留的抗生素失活，则可使其失去对人体的毒害作用，还可使其失去选择作用，使耐药菌不再具有选择优势，不再优势繁殖并流行。
发明内容
本发明的目的是寻找一种能灭活残留β-内酰胺抗生素的较为温和的方法，但不引入新的有害因素。
本发明的第一个目的在于提供一种β-内酰胺酶。
本发明所述的β-内酰胺酶编码序列是经密码子优化、化学合成的DNA片断，其序列为SEQ IDNO.1，β-内酰胺酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
本发明的第二个目的在于提供一种β-内酰胺酶的制备方法。
本发明所述的β-内酰胺酶的制备方法，其特征在于该方法包括以下顺序的步骤构建工程菌株、建立发酵工艺、分离纯化。
本发明所述的β-内酰胺抗生素酶的制备方法，其特征在于工程菌是含有基因序列SEQ IDNO.1，表达载体为pET-30a，插入位点为Kpn I和Hind III的BL21(DE3)菌株。
本发明所述的β-内酰胺酶的制备方法，其特征在于工程菌发酵培养的温度为28℃-40℃，诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.5mmol/L。
本发明所述的β-内酰胺抗生素酶的制备方法，其特征在于工程菌发酵培养的温度为30℃-35℃，诱导剂IPTG的浓度为0.4-1.0mmol/L。
本发明所述的β-内酰胺抗生素酶的制备方法，其特征在于工程菌发酵培养的温度为30℃，诱导剂IPTG的浓度为0.5mmol/L。
本发明所述的制备方法，其特征在于分离纯化采用离子交换层析、分子筛层析、疏水层析或亲和层析中的一种或任意两种、任意三种、四种的组合。
本发明的第三个目的在于提供本发明所述的β-内酰胺酶在用于清除畜产品中残留抗生素中的应用。
本发明所述的β-内酰胺酶在用于清除牛奶、食品饮料加工中残留抗生素和环境保护中的应用。
本发明所述的β-内酰胺酶在用于清除生畜、家禽、肉类、医疗用品中残留抗生素中的应用。
β-内酰胺类抗生素是治疗细菌感染的常用药物。β-内酰胺酶(β-lactamase)又称青霉素酶，是细菌分泌的能水解β-内酰胺类抗生素(包括青霉素)的酶。因此，β-内酰胺酶可用于消除残留的β-内酰胺抗生素。本法具有的优点首先，酶是高效催化剂，只需少量的酶就可以灭活相当多的抗生素；其次，酶是蛋白质，不会造成二次污染，经消化后还是营养物质。
本发明用重组DNA技术构建β-内酰胺酶TEM1的融合蛋白表达质粒，通过在大肠杆菌中高效表达获得重组TEM1融合蛋白，经层析分离纯化，获得高纯度、高活性的酶。本发明的具体方法包括以下步骤1.酶分子的选择β-内酰胺酶有几百种，如TEM酶就有上百种，SHV酶也有上百种。作为降解残留β-内酰胺类抗生素来说，这些酶均可以选择。在本发明中，优选TEM1。
2.基因的获得可用PCR从细菌质粒中获得TEM1基因，也可通过化学法合成全长基因。由于TEM1基因中有一些稀有密码子，因此本发明优选化学合成，这样可以对TEM1基因进行优化。经优化后的TEM1基因序列见SEQ ID No.1。
3.蛋白质的表达形式选择可以通过在基因前加上导肽序列，分泌到周质的方式获得产物。也可以通过在基因前加上ATG密码子，在胞质中表达天然的蛋白。还可以通过融合蛋白的方式表达，即在天然酶的N端或C端融合一段标签序列，其中的标签序列可以是谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、His6、S-tag，Dsb A、Dsb C，或其它的融合头及其组合。考虑表达量及后续的提纯工艺，本发明的优选例是表达融合蛋白，其中优选的是在N端融合His6/S-tag组合标签。
4.表达质粒的构建T7启动子驱动的表达能极大地提高蛋白质的表达量，因而本发明优先选择带T7启动子的表达载体，如pET11-pET40。更优地，本发明采用pET30a(+)表达载体。可用pET30a(+)上的多克隆位点插入本发明的基因，更优地，利用pET30a(+)上的Kpn I+HindIII位点，同时也自然引入了His6/S-tag组合标签。
5.重组蛋白的诱导表达本发明的优选例中，其特征在于工程菌发酵培养的温度为28℃-40℃，诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.5mmol/L；次优工程菌发酵培养的温度为30℃-35℃，诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.5mmol/L；最优工程菌发酵培养的温度为30℃，诱导剂IPTG的浓度为0.5mmol/L。
6.重组蛋白的分离提纯在本发明的一优选例中，重组蛋白的分离纯化包括如下步骤i.对发酵样品通过离心或过滤除去培养基，获得菌体；ii.裂解细胞，获得破菌液；iii离心破菌液去除菌体碎片，获得破菌液上清；iv层析纯化，所用的层析选自离子交换层析、分子筛层析、疏水相互作用层析，亲和层析及其任意两种以上的组合；7.残留抗生素的消除此酶可用于消除不同领域中残留的抗生素，如生畜、家禽、畜产品、牛奶、肉类、医疗用品、环境和食品饮料加工等方面。不过在不同领域中的应用方式有所不同。如以肉制品为最终产物的畜类，活体注射酶溶液是比较适合的方式。将酶溶解成适当浓度的溶液，注射入动物的体内，利用动物的循环系统将酶携带到不同的组织，器官，使酶能更有效地降解残留于动物体内的抗生素。当然，也可以用酶溶液浸泡肉类来消除其中的残留抗生素，但显然此法从经济和效率的方面都不如活体注射法。对如牛奶等液态产品来说，可通过将酶溶解成适当浓度的溶液，加入产品中作用一段时间以消除其中残留的抗生素。也可以用固定化酶技术制成酶反应器，将产品通过酶反应器来消除其中残留的抗生素。对于器皿或环境中残留的抗生素，可通过浸泡或喷剂的形式给予消除。
本发明的意义及优点1.从狭义上说，现在国内有些动物源性食品青霉素超标严重，本发明可为人们提供安全的食品。
2.从广义上说，本发明可在一定程度上避免耐药菌的流行，对于维护人们健康，避免出现疾病横行却无药可用的局面。
3.从工艺上说，此发明的表达工艺简单，纯化工艺简单，回收率高。SEQ IDNO.1长度789bp类型脱氧核糖核酸链数双链几何结构线性来源化学合成特征编码TEM1蛋白(序列经优化)。
5’CAC CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA GAT GCT GAA GAT CAGTTG GGT GCA CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT CTC AAC AGC GGTAAG ATC CTT GAG AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGT TTT CCA ATG ATGAGC ACT TTT AAA GTT CTG CTA TGT GGC GCG GTA TTA TCC CGT GTTGAC GCC GGG CAA GAG CAA CTC GGT CGC CGC CTG CAC TAT TCT CAGAAT GAC TTG GTT GAG TAC TCA CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT ACGGAT GGC ATG ACA GTA CGC GAA TTA TGC AGT GCT GCC CTG ACC ATGAGT GAT AAC ACT GCG GCC AAC TTA CTT CTG ACA ACG ATC GGA GGACCG AAG GAG CTA ACC GCT TTT TTG CAC AAC ATG GGG GAT CAT GTAACT CGC CTT GAT CGT TGG GAA CCG GAG CTG AAT GAA GCC CTG CCAAAC GAC GAG CGT GAC ACC ACG ATG CCT GCA GCA ATG GCA ACA ACGTTG CGC AAA CTA TTA ACT GGC GAA CTA CTT ACT CTA GCT TCC CGG
CAA CAA TTA CTG GAC TGG ATG GAG GCG GAT AAA GTT GCA GGA CCACTT CTG CGC TCG GCC CTT CCG GCT GGC TGG TTT ATT GCT GAT AAATCT GGA GCC GGT GAG CGT GGG TCT CGC GGT ATC ATT GCA GCA CTGGGG CCA GAT GGT AAG CCC TCC CGT ATC GTA GTT ATC TAC ACG ACGGGG AGT CAG GCA ACT ATG GAT GAA CGA AAT CGC CAG ATC GCT GAGCTG GGT GCC TCA CTGATTAAG CAT TGG TAA 3’SEQ IDNO.2长度263 aa类型蛋白质几何结构线性特征天然TEM1的氨基酸序列HPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW
图1是重组TEM1融合蛋白的表达分析(1为marker；2为诱导前；3-8为诱导后；可看出诱导后蛋白的表达量约占总蛋白的30％)。
图2是重组TEM1融合蛋白的亲和纯化层析图谱。
图3是重组TEM1融合蛋白的阴离子交换纯化层析图谱。
图4是纯化后的TEM1融合蛋白经电泳鉴定图，显示纯度大于95％。
图5是用TEM1酶消除脱脂奶培养基中的抗生素图谱从左到右，第1管为不含抗生素，第2管含抗生素但不加酶，其余含抗生素并加酶处理。变红者为抗生素残留合格。
图6是重组酶在不同温度下处理相同量青霉素所需的时间，以37℃所需时间为100计算。
图7是重组酶处理不同酸碱度脱脂奶培养基中相同量青霉素所需的时间，以pH7.0时所需的时间为100计算。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。但它们不是对本发明的限定。未注明具体条件的实验方法，通常是指按常规的实验条件或者按厂商提供的条件。
实施例一TEM1融合表达体系的构建表达质粒为pET30a(+)，宿主菌为BL21(DE3)。
化学合成优化后的TEM1基因，在其5’端加上编码肠激酶识别位点的碱基序列和Kpn I限制性酶切位点，以便于必要时释放天然的TEM1蛋白。在其3’端加上终止密码子TAA并引入Hind III位点，克隆在质粒pET30a的Kpn I和Hind III位点间，这样在TEM1的N端自然引入His6/S-tag标签序列。
将构建好的表达质粒直接转化BL21(DE3)感受态细胞，筛选卡那霉素抗性株；碱裂解法小量制备质粒，Kpn I+Hind III双酶切筛选插入有合成TEM1基因的克隆，用T7启动子(promoter)和终止子(terminator)双向测序，证实克隆序列与设计序列完全一致(SEQ ID.NO.1)。
该工程菌培养后，经IPTG诱导4h后，目的蛋白约占总蛋白的30％，详见图1。类似的方法构建天然蛋白表达质粒，并进行表达分析，表达量较融合蛋白体系要低得多，不足10％。
实施例二诱导条件的选择温度和诱导剂浓度是两个影响蛋白质表达量和表达形式(可溶或包含体)的两个重要因素。因此，以LB为培养基，对温度和诱导剂的组合对TEM1融合蛋白表达的影响进行了分析，见下表。
结果表明，在37℃以1mmol/L IPTG诱导时(体系11)，蛋白的表达量最高，但绝大多数(＞90％)存在于包含体中。而在30℃以0.5mmol/L IPTG诱导时(体系6)，表达量虽低一些，但大多数蛋白为(＞80％)为可溶表达。因而优选体系6的条件作为诱导条件。
实施例三重组TEM1融合蛋白的纯化1、参照实施例2的体系6诱导重组蛋白表达。发酵产物4℃，6000rpm离心15分，得菌体。
2、超声波裂解细胞，13000rpm离心30分，收集上清。
3、层析纯化目标蛋白a.亲和层析介质Ni-Chelating Sepharose FF溶液A20mM Tris-Cl，500mM NaCl，5mM咪唑(pH8.0)溶液B20mM Tris-Cl，250mM咪唑(pH8.0)将破菌离心后收集的上清液以150cm/h的流速上柱，用溶液A洗至电导和紫外吸收均不再变化，用100％B洗脱，收集洗脱峰。亲和层析的图谱见图2。
b.阴离子交换层析介质DEAE Sepharose FF溶液A20mM Tris-Cl(pH8.0)溶液B20mM Tris-Cl+1M NaCl(pH8.0)用A液将收集的亲和层析峰稀释4倍，以150cm/h的流速上柱，用溶液A洗至电导和紫外吸收均不再变化，在10倍柱床体积内用线性梯度将溶液从0％B升至50％B，收集TEM1峰。离子交换层析的图谱见图3。
c.分子筛介质Sephadex G-25
溶液A50mM PB(pH7.0)将离子交换层析收集到的TEM1峰上柱，然后用溶液A洗脱，收集TEM1融合蛋白峰。
经过次三个纯化步骤后，得到了纯度达95％，且盐浓度较低的TEM1融合蛋白见图4。
实施例四 用重组TEM1酶消除残留的抗生素1、消除脱脂奶培养基中的残留的青霉素向10ml 12％脱脂奶培养基中加入青霉素至40IU/mL(相应于超过国家青霉素残留标准10000倍)。向其中加入不同量的重组TEM1融合蛋白，室温作用15分钟后，按GB/T 4789.27-2003用TTC法测定牛奶中抗生素是否超标。其中不加青霉素和加入酶量大于0.07微克的培养基变红，表明抗生素残留已经符合国家标准。而加入酶量低于0.07微克的管(包括未加酶的管)培养基未变红，表明抗生素残留超标。因此，根据本发明，用TEM1酶有效地消除了牛奶中残留的青霉素见图5。
2、不同温度时，重组TEM1酶消除牛奶中抗生素的情况为模拟不同季节和不同的地方，在不同的温度条件下用此酶消除脱脂奶培养基中的残留抗生素。方法同1，加入的酶量为0.07微克，所用不同温度包括4℃，10℃，20℃，25℃，30℃，37℃和45℃。以37℃时使抗生素残留合格所需的时间为100，作出不同温度时所需作用时间的柱状图，见图6。结果表明，在不同的环境条件下，此酶均能有效的消除残留的抗生素，只是温度较低时所需时间要相应延长，或所需酶量要相应增加。
3、不同pH时，重组TEM1消除牛奶中抗生素的情况为模拟不同的奶可能的酸碱度波动，在不同的pH下用此酶消除脱脂奶培养基中残留的抗生素。将脱脂奶培养基的pH调为6.5，7.0或7.5，作用温度为室温(25℃)。以7.0时使抗生素残留合格所需的时间为100，作出不同pH时所需作用时间的柱状图，见图7。结果表明，在不同的环境条件下，此酶能有效地消除上述酸碱度脱脂奶培养基中残留的抗生素。
4、消除环境中残留的抗生素我们通过在LB平板表明涂布青霉素以模拟环境中或器皿等固体表面残留抗生素，涂布青霉素的量为40IU/cm2。同样，取0.07微克重组酶稀释在适当体积的PB(pH7.0)中，涂布在平板表面。作用15分钟后，涂布大肠杆菌DH5α细胞，37℃倒置培养14小时。结果表明，未涂布酶的平板无菌落生长，而涂布酶的平板长出很多菌落，以至于连成了一片，长成了菌苔。由于无可用的灭活酶而不破坏平板或不影响细菌生长的方法，所以作用后未对酶灭活处理。
5、用TEM1消除其它一些常用β-内酰胺抗生素我们用重组TEM1酶消除脱脂奶培养基中的氨苄青霉素。向10ml 12％脱脂奶培养基中加入氨苄至100μg/mL。向其中加入不同量的重组TEM1融合蛋白，室温作用15分钟后，按GB/T 4789.27-2003用TTC法测定牛奶中抗生素是否超标。其中不加氨苄和加入酶量大于0.2μg的培养基变红，表明抗生素残留已经符合国家标准。而加入酶量低于0.2μg的管(包括未加酶的管)培养基未变红，表明抗生素残留超标。因此，根据本发明，用TEM1酶有效地消除了牛奶中残留的氨苄青霉素。
序列表<110>杭州北斗生物技术有限公司<120>一种β-内酰胺酶、其制备方法及其应用<160>2<210>1<211>792<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(792)<220>
<221>misc_feature<223>TEM1编码序列<400>1
cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc50acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 100gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 150ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg 200tcgccgcctg cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 250cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag tacgcgaatt atgcagtgct 300gccctgacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 350cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 400taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cctgccaaac 450gacgagcgtg acaccacgat gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa 500actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattactgg 550actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 600ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 650tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 700tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaatcgc 750cagatcgctg agctgggtgc ctcactgatt aagcattggt aa 792<210>2<211>263<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia Coli)<400>2
His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys Asp Ala Glu Asp Gln Leu1 5 10 15Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp Leu Asn Ser Gly Lys20 25 30Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe Pro Met Met Ser35 40 45Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser Arg Val Asp50 55 60Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser Gln Asn65 70 75Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr Asp80 85 90Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser95 100 105Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Phe110 115 120Lys Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr125 130 135Arg Leu Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn140 145 150Asp Glu Arg Asp Thr Thr Met Pro Ala Ala Met Ala Thr Thr Leu155 160 165Arg Lys Leu Leu Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln
170 175 180Gln Leu Ile Asp Trp Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu185 190 195Leu Arg Ser Ala Leu Pro Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser200 205 210Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly215 220 225Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly230 235 240Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn Arg Gln Ile Ala Glu Ile245 250 255Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp260
权利要求
1.一种β-内酰胺酶，其特征在于β-内酰胺酶编码序列是经密码子优化、化学合成的DNA片断，其序列为SEQ IDNO.1，β-内酰胺酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
2.根据权利要求1所述的β-内酰胺酶的制备方法，其特征在于该方法包括以下顺序的步骤构建工程菌株、建立发酵工艺、分离纯化。
3.根据权利要求2所述的β-内酰胺酶的制备方法，其特征在于工程菌是含有基因序列SEQ IDNO.1，表达载体为pET-30a，插入位点为Kpn I和HindIII的BL21(DE3)菌株。
4.根据权利要求2所述的β-内酰胺酶的制备方法，其特征在于工程菌发酵培养的温度为28℃-40℃，诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.5mmol/L。
5.根据权利要求4所述的β-内酰胺酶的制备方法，其特征在于工程菌发酵培养的温度为30℃-35℃，诱导剂IPTG的浓度为0.4-1.0mmol/L。
6.根据权利要求5所述的β-内酰胺酶的制备方法，其特征在于工程菌发酵培养的温度为30℃，诱导剂IPTG的浓度为0.5mmol/L。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于分离纯化采用离子交换层析、分子筛层析、疏水层析或亲和层析中的一种或任意两种、任意三种、四种的组合。
8.根据权利要求1所述的β-内酰胺酶在用于清除畜产品中残留抗生素中的应用。
9.根据权利要求1所述的β-内酰胺酶在用于清除牛奶、食品饮料加工中残留抗生素和环境保护中的应用。
10.根据权利要求1所述的β-内酰胺酶在用于清除生畜、家禽、肉类、医疗用品中残留抗生素中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗生素水解酶、其制备方法及其应用，尤其涉及一种β－内酰胺酶、其制备方法及其在清除残留抗生素方面的应用，其特征是通过基因工程获得高纯度、高活性的酶，其制备方法包括以下顺序的步骤构建工程菌株、建立发酵工艺、分离纯化。用于在清除生畜、家禽、畜产品、牛奶、肉类、医疗用品、环境和食品饮料加工中残留抗生素中的应用，本发明在对免除人体受残留β－内酰胺抗生素毒害和避免耐药菌产生具有积极的作用。
文档编号A61K38/43GK101089178SQ20061005191
公开日2007年12月19日 申请日期2006年6月12日 优先权日2006年6月12日
发明者杨柏成, 侯垠伏, 赵山强, 粱静海, 刘国安, 刘沐荣 申请人:杭州北斗生物技术有限公司