专利名称：丹皮酚在制备抗食管癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，更具体地说是涉及丹皮酚在治疗食管癌中的应用。
背景技术：
食管癌是发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。最新的统计表明，全世界每年新发病例近40万，而死亡高达34万例。我国是食管癌发病率最高的国家，占世界食管癌的50％以上，其死亡率排在所有肿瘤中的第4位。我省是食管癌的高发省份，据安徽省1990-1992年肿瘤死亡原因抽样调查报告食管癌居我省肿瘤死亡原因的第二位，男性肿瘤死亡原因的首位。食管癌患者确诊时至少80％的患者已发生局部侵犯或远处转移，无法手术根治。发病年龄多在40岁以上，男性多于女性，但近年来40岁以下患者有增长趋势，日渐成为我省劳动力人口的主要杀手。
目前，手术仍然是治疗食管癌的首要手段，但是食管癌切除术后3年生存率仅30％～35％，5年生存率不到20％。放疗对于不宜手术的食管癌也是一种重要的治疗方法。早期食管癌往往症状不明显，许多病例一经诊断，已属晚期，预后很差，5年生存率不超过10％。确诊时至少80％的患者已发生局部侵犯或远处转移，无法手术根治。尸检表明，临床出现症状时70％已经有远处转移，其中淋巴结转移为73％～74.5％，其它脏器转移为50％～75％。因而，单纯手术、放疗或手术+放疗亦较难达到满意的根治效果，主要失败原因是远处转移和局部肿瘤未控制及复发。对于防止和治疗全身转移，化疗是目前唯一确切有效的方法，因此化疗已逐步成为食管癌综合治疗的重要组成部分。至于晚期食管癌，由于肿瘤组织以及伴随的炎性水肿所造成的进食梗阻和局部疼痛，严重的影响患者的生存期和生活质量，一般认为，姑息性化疗可以明显地改善患者的生活质量，适当延长其生存时间。
目前，以顺铂(cisplatin，CDDP)为基础的辅助化疗是治疗食管癌的重要手段，其有效率仅在50％左右，但是化疗有较大的毒副作用，部分患者难以耐受。尤其是出现CDDP耐药时尚无理想的化疗药物替代。因此积极寻找一种低毒的化疗药物成为当前亟需解决的问题。食管癌的化疗主要采用以PDD为主的联合化疗，因此，针对我省食管癌发病率高、病期晚、手术不能根治的特点，积极寻找高效低毒的药物是目前面临的亟待解决的难题。
丹皮酚(Paeonol)又称牡丹酚，是毛茛科植物牡丹Paeonia Suffruticosa Andr.根皮和萝摩科植物徐长卿Pycnostelma Paniculatum(Bunge)K.Schum干燥根或全草的主要有效成分。丹皮酚是一种小分子的酚类化合物，呈白色针状结晶，具有熔点低(mp51℃±1℃)、易挥发及水溶性差的特性，其分子量(Mr)为166.18，分子式为C9H10O3，化学结构是
2-羟基-4-甲氧基苯乙酮 。丹皮酚具有抗镇静、催眠、解热、镇痛、抗炎、抗菌等药理作用。现代研究表明，丹皮酚还具有一定的抗肿瘤活性，体外实验发现它对多种肿瘤细胞株有增殖抑制作用，灌胃给药有抗小鼠肝肿瘤作用。但迄今未见丹皮酚对食管癌的报道。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种毒副作用小，长期应用无不良反应，标本兼治的丹皮酚在制备抗食管癌药物中的应用。
发明人经系统研究得出如下结论丹皮酚在0.047～1.504mmol·L-1浓度下对人食管癌细胞Eca-109具有明显的生长抑制作用，药物浓度越高，抑制作用越强，具有明显的浓度依赖关系(r0.964，P＜0.01)，IC50为0.342 mmol·L-1。表明丹皮酚在体外具有良好的抗肿瘤活性以及抗瘤谱广的特点。丹皮酚50mg.kg-1剂量下连续灌胃14天，可抑制裸鼠移植人食管癌Eca-109的生长，其抑制率达到23.54％，随着剂量的增加抗肿瘤作用增强。尤其是，一定剂量下的丹皮酚(100mg·kg-1)与顺铂(5mg·kg-1)联合应用时抑瘤率高达77.91％，较丹皮酚、顺铂单独应用的抑瘤率的差异有显著性，提示丹皮酚与顺铂具有协同作用。实验过程中各组均无裸鼠死亡。实验结果提示丹皮酚在食管癌的治疗上可能具有良好的应用前景。
本发明丹皮酚在制备抗食管癌药物中的应用可以是丹皮酚与药用载体组合而成药用组合物，所制备成的剂型包括干混悬剂、散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、注射剂、注射用冻干粉、栓剂、滴丸剂、糖浆剂、口服溶液剂等药学上可接受的剂型。
本发明丹皮酚与药用载体组合成的药用组合物制备成药物制剂，其用量用法为每日用药1～5次，每次用量以丹皮酚计为50～250mg。
本发明丹皮酚药用组合物最佳的剂型是以甘露醇等为药用载体的干混悬剂。
本发明丹皮酚药用组合物制成抗食管癌的干混悬剂，其药用载体包括甘露醇、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、卡伯姆、聚维酮、蔗糖、木糖醇等。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在其药物用于治疗食管癌的毒副作用小，长期应用无不良反应，标本兼治。
以下动物试验对本发明有益效果作进一步说明药物和试剂丹皮酚注射液购自上海第一制药厂(规格5mg·ml-1)。丹皮酚原料由安徽医科大学临床药理研究所植化室提供；顺铂注射液南京制药厂有限公司(规格1mg·ml-1)；
RPMI1640培养粉购于美国Gibco公司；噻唑蓝购于美国Sigma公司。末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)试剂盒购自美国promega公司。
细胞株和实验动物人食管癌细胞株Eca-109购自中科院上海细胞库。BALB/c裸鼠6～8周龄，SPF级，雌雄兼用，安徽医科大学动物中心提供。
统计学处理实验数据以
表示，组间显著性检验采用方差分析。
1、丹皮酚在体外对人食管癌细胞Eca-109生长的抑制作用1.1实验方法采用MTT法，设不同浓度的丹皮酚组、细胞对照组和空白对照组，取对数生长期的细胞(1～5)×107·L-1接种于96孔板上，每组设6个复孔，每孔接种100μl，置37℃、5％CO2的培养箱培养24小时，弃上清，丹皮酚组每孔分别加入200μl不同浓度的丹皮酚(Pae的终浓度为0.047、0.094、0.188、0.376、0.752、1.504mmol·L-1)；细胞对照组和空白对照组只加入等量培养液，继续培养48h，在终止培养前4h丹皮酚组及对照组每孔加入20μlMTT(5g·L-1)，再培养4h后，小心吸弃上清，并加入150μl DMSO溶解MTT沉淀，用振荡器混匀后，在酶标仪用490nm测定吸光值(A)，按下列公式求出生长抑制率。生长抑制率＝(1-用药组A值/对照组A值)×100％。以药物浓度为横轴，抑制率作纵轴，绘出生长曲线。以药物浓度的对数与抑制率进行直线回归并求出IC50。
1.2实验结果丹皮酚0.047～1.504mmol·L-1对人食管癌细胞Eca-109的生长有抑制作用，抑制率随着药物的浓度升高而升高，Pae 0.047、0.094、0.188、0.376、0.752、1.504mmol·L-1对Eca-109细胞的抑制率依次为5.44％、12.28％、27.99％、39.53％、84.41％、89.98％。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析Paer＝0.964，P＜0.0l。IC50为0.342mmol·L-1。见表1。
表l丹皮酚在体外对人食管癌细胞Eca-109生长的抑制作用
*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较(丹皮酚＝0)2、丹皮酚对裸鼠移植人食管癌细胞Eca-109的抑制作用2.1实验方法2.1.1体内抑瘤试验取对数生长期的人食管癌细胞Eca-109制成细胞悬液，加入培养基制成细胞浓度约为1×107·ml-1，接种于每只裸鼠左侧腋窝皮下，随机将裸鼠随机分成对照组，顺铂5mg·kg-1组，丹皮酚不同剂量组，丹皮酚100mg·kg-1+顺铂5mg·kg-1组。每组6只裸鼠，接种24h后丹皮酚灌胃给药，每日1次，连用14天。顺铂腹腔注射，1周2次，共2周。实验结束时处死裸鼠称体重，剥离瘤体称瘤重。按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率＝(对照组瘤重-用药组瘤重)/对照组瘤重×100％。
2.1.2两药联合作用评价 采用两药相互作用指数(CDI)评价两药相互作用性质，CDI＝AB/(A×B)。根据瘤重进行计算，AB为两药联用组与对照组瘤重的比值；A或B是各药物单独使用组与对照组瘤重的比值。当CDI＜1时两药作用性质为协同；当CDI＜0.7时，协同作用非常显著。
2.1.3HE染色标本制备 4％甲醛固定新鲜肿瘤组织，常规脱水，石蜡包埋切片，脱蜡至水HE染色封片，光镜高倍视野下观察肿瘤细胞形态。
2.1.4透射电镜样品制备 取1mm3肿瘤组织，按常规法2.5％戊二醛前固定，再用1％的锇酸后固定，脱水，包埋后70nm连续超薄切片，醋酸铅铀染色，日立H-800型透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构并摄片。
2.1.5原位细胞凋亡检测 采用TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)介导的dUTP缺口末端标记法-TUNEL法。组织切片常规脱蜡至水，20μg·ml-1蛋白酶K消化30分钟，室温；100μl平衡缓冲液5～10分钟；100μlTdT反应液作用60分钟，37℃；0.3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性；链酶亲和素-辣根过氧化物酶(SP-HRP)作用30分钟，室温；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。实验设加DNase I的为阳性对照，加不含TdT反应液的为阴性对照。普通光学显微镜选取5个高倍视野(×400)，计数其中凋亡细胞数，并算出凋亡细胞占肿瘤细胞的百分比值，即凋亡指数AI(apoptosis index)。
2.2实验结果2.2.1丹皮酚对裸鼠移植人食管癌细胞Eca-109的抑制作用丹皮酚在25mg·kg-1剂量时对裸鼠移植Eca-109抑瘤率为10.67％，与对照组相比无显著性差异。丹皮酚在50mg·kg-1，100mg·kg-1及200mg·kg-1剂量时对裸鼠移植Eca-109的抑瘤率分别为23.54％，27.91％和34.46％；顺铂5mg·kg-1组抑瘤率为58.71％；丹皮酚100mg·kg-1+顺铂5mg·kg-1组的抑瘤率分别为77.91％。此5组与对照组相比，P＜0.05。丹皮酚100mg·kg-1+顺铂5mg·kg-1组分别与顺铂5mg·kg-1组及丹皮酚100mg·kg-1相比有显著性差异(P＜0.05)，且计算CDI＝0.74，提示两药合用具有协同作用。实验过程中各组均无裸鼠死亡。见表2。
表2丹皮酚对裸鼠移植人食管癌细胞Eca-109的抑制作用
*P＜0.05与对照组比较；Δp＜0.05与丹皮酚+顺铂组比较2.2.2光镜形态学观察对照组肿瘤细胞生长旺盛，细胞密度高；丹皮酚不同剂量组、顺铂组以及两药联合(丹皮酚100mg·kg-1+顺铂5mg·kg-1)作用细胞密度减少并可见较多凋亡细胞，表现为细胞体积缩小，核固缩、碎裂、深染，部分形成凋亡小体。
2.2.3透射电镜形态学观察电镜下检测用药组肿瘤组织，可见较多凋亡的肿瘤细胞。电镜下表现出明显的凋亡形态学改变，癌细胞胞膜较完整，细胞器基本完好，细胞核染色质浓缩边聚、胞浆浓缩、核碎裂以及大量凋亡小体形成。
2.2.4TUNEL检测细胞凋亡光镜下见，凋亡细胞明显固缩，核致密，为棕褐色，多叶状或新月状颗粒，常聚集在核周边，非凋亡细胞的核呈蓝色。对照组有少许细胞核深染为棕褐色的凋亡细胞，在丹皮酚不同剂量组，顺铂5mg·kg-1组以及丹皮酚100mg·kg-1+顺铂5mg·kg-1组，凋亡细胞明显多于对照组(见图3)。用药组凋亡指数与对照组相比有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。见表3。
表3对细胞凋亡指数的检测(n＝5，
)
*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group
具体实施例方式丹皮酚，包括与药用载体组合为药学上可接受的剂型，包括干混悬剂、散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、注射剂、注射用冻干粉、栓剂、滴丸剂、糖浆剂、口服溶液剂，在食管癌治疗中进行应用。
其用量用法为每日用药1～5次，每次用量以丹皮酚计为50～250mg。
具体可以按下述组分和方法制成各种药物制剂，但本发明的保护范围，不局限于此。
实施例1组分 量(mg/袋)丹皮酚-β-环糊精包合物1850(相当于丹皮酚150mg)甘露醇2800羧甲基纤维素钠250微晶纤维素100制备方法(1)称取丹皮酚1g，加入适量无水乙醇，水浴加热使溶解；另称取10倍量β-环糊精置三颈烧瓶中，在一定温度下加水溶解制成饱和溶液；将丹皮酚无水乙醇液以2滴/min的速度缓慢滴加至β-环糊精饱和溶液中，待无水乙醇挥干后将三颈烧瓶密封。继续水浴加热并搅拌一段时间，取出，置冰箱内冷藏24h析晶，过滤得包合物，用少量蒸馏水洗涤，置真空干燥箱中50℃以下干燥，得白色疏松状包合物粉末，再用适量石油醚洗涤，挥去石油醚，制得丹皮酚-β-环糊精包合物；(2)在GMP净化车间，将上述丹皮酚-β-环糊精包合物与辅料按比例混合后，分装成每袋5g的干混悬剂。每袋干混悬剂含丹皮酚量为150mg，用水冲服，每次服用1袋，每日服用1-5次。
实施例2组分 量(mg/片)丹皮酚50甘露醇175交联羧甲基纤维素钠23硬脂酸镁 2PVP K30乙醇液 适量制备方法在GMP净化车间，将丹皮酚与上述辅料按比例混合后，依中国药典2005年版一部制备片剂标准，制粒，用自动压片机压片，制成片剂，每粒片剂含含丹皮酚量为50mg，患者每次服用3片，每日服用1-5次。
实施例3组分量(mg/丸)丹皮酚 50植物油 200制备方法在GMP净化车间，将丹皮酚与植物油混合，用胶体磨研匀；另配明胶液(明胶100份、甘油55份、水120份)，备用；用自动压丸机制丸，制成软胶囊剂，每丸含丹皮酚量为50mg，患者每次服用3丸，每日服用1-5次。
权利要求
1.丹皮酚在制备抗食管癌药物中的应用。
全文摘要
丹皮酚在制备抗食管癌药物中的应用，是以丹皮酚为活性成分，包括丹皮酚－β－环糊精包合物与药用载体制备成干混悬剂、散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、注射剂、注射用冻干粉、栓剂、滴丸剂、糖浆剂、口服溶液剂等药学上可接受的剂型的应用。其药物用于治疗食管癌的毒副作用小，长期应用无不良反应，标本兼治。
文档编号A61P35/00GK1935129SQ20061009665
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月14日 优先权日2006年10月14日
发明者孙国平, 桂双英, 王 华 申请人:孙国平, 桂双英, 王 华