专利名称：：作为免疫调节因子的可溶性vOX2蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫调节分子，特别是由卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码的可溶性vOX2蛋白衍生物。
背景技术：
：哺乳动物免疫系统的生理功能是使宿主防御微生物的感染。该防御由先天免疫的早期反应和适应性免疫的延迟应答介导。活化免疫系统最早的抗病毒组分是炎性应答，其特征在于由受损伤细胞(包括内皮细胞)释放趋化中介体，以将白细胞(主要是免疫系统中最为丰富的细胞组分——嗜中性粒细胞)由外周血募集至炎性反应的位点。嗜中性粒细胞在吞噬作用过程中通过消化微生物和受感染细胞来清除它们，从而在先天免疫应答中发挥关键作用。该过程伴随着吞噬体内的效应物"呼吸爆发(respiratoryburst)"的发生，其包括氧化代谢的突然提高，导致产生有毒性的活性氧中间体代谢物(ROI;如02'、'OH、H202)。虽然ROI的产生是为了在细胞内清除病原体，但是它们不可避免地会穿过细胞膜扩散到炎症位点，它们能够在所述炎症位点损伤组织，从而增加了免疫发病。炎性应答中最重要的促炎细胞间中介体为趋化因子、白介素8(IL-8)和巨噬细胞化学引诱物蛋白-1(MCP-1)等。越来越多的证据显示，IL-8和MCP-1分别是急性(嗜中性粒细胞)和慢性(巨噬细胞/单核细胞)炎症的主要中介体(Akahoshi等，1994，Frangogiannis等，2002,Hatano等，1999，Smith等，1997，Villiger等，1992)。CXC-趋化因子IL-8是白细胞的促生存(pro-survival)信号；许多报道显示，包括单核细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞的各种细胞快速地表达IL-8mRNA并合成IL-8蛋白。然而，其主要由单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞合成，并主要募集嗜中性粒细胞(综述于(Baggiolini，2001,Mukaida等，1998))。MCP-1是与细胞的运动和刺激有关的促炎趋化因子，主要作用于淋巴细胞、单核细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞(Mukaida等，1998)。该趋化因子作为对不同刺激如IL-1、肺瘤坏死因子(TNF)和免疫球蛋白(Ig)G的应答而表达于多种细胞类型，包括单核细胞、平滑肌细胞以;^Ajk管内皮细胞(HUVEC)(Rollins等,19卯，Sica等，1990，Yang等，2004)。TNF-a和IgG复合体也是产生ROI的已知刺激因子(Satriano等，1993)。病毒与其宿主一起进化，它们也进而进化出了逃避免疫应答的策略。卡波西肉瘤相关疱渗病毒(KSHV)是最新鉴定出的感染人类的疱渗病毒(Chang等，1994)，它是卡波西肉瘤(KS)的病因，并可能是原发性渗出性淋巴瘤和多中心性卡斯尔曼病的病因(综述参阅(Sarid等,1999))。在包含约卯个KSHV开放读码框(ORF)的基因组中，至少16个确定为可调节宿主免疫应答的蛋白质(Russo等，1996)。可以认为炎性应答是增强病毒感染和散布的免疫调节的关键靶标。事实上，KSHV编码三种CXC趋化因子调节因子(Boshoff等，1997)。在KSHV的裂解周期中合成的另一种蛋白质由名为K14的开放读码框所编码(Jenner等，2001)。这种蛋白质显示出与哺乳动物OX2蛋白(也叫做CD200)的同源性，后者属于膜相关糖蛋白的Ig超家族，表达在许多类型细胞的表面上，包括内皮细胞、B细胞、T细胞、神经细胞和扁桃体嚢泡(tonsilfollicle)(Morris&Beech,1987,Wright等，2001)。细胞内OX2的作用相信是调节髓样细胞活性的一员，可能作为辅助信号(Wright等，2000)。在小鼠和大鼠中OX2表达的升高提高了肾脏和皮肤同种异体移植物的存活(Gorczynski等，1998,Gorczynski等,1999)，提示OX2传递耐受信号(综述于(Gorczynski,2001))。OX2的信号传递可能通过与OX2配体(受体)的结合来实现，该配体(受体)的表达局限于髓样细胞(Gorczynski等，2000,Wright等，2003)。由于这种同源性，该病毒蛋白通常称作vOX2。然而，这只是方侵，的叫法。这两种蛋白在氨基酸水平只有约40%的序列同一性，所以不能假定该病毒蛋白会模拟细胞蛋白的任何活性。而且，该病毒蛋白还与神经细胞粘附分子(NCAM)、Thy-l以及L1具有同源性，所以vOX2也被称作vNCAM和v-adh。
发明内容迄今为止对于vOX2功能的研究结果是互相矛盾的。Chung等(2002)的报道称，表达为可溶性GST融合蛋白的vOX2蛋白能刺激原代单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，并诱导它们产生炎性细胞因子。在该研究中，表达于B淋巴细胞表面的vOX2也显示能够刺激单核细胞产生炎性细胞因子。作者提出，该促炎活性可以使淋巴细胞募集到KSHV感染位点，这提供了更多用于病毒感染的细胞，因此促进将病毒散布到被感染宿主的系统各处。相反，Foster-Cuevas等(2004)得出结论，膜表达的vOX2下调了巨噬细胞的活化。他们提出，Chung的结果可能是由于其可溶性重组蛋白的错误折叠所致，但是这不能解释两个研究中用细胞表面表达的蛋白质得到的矛盾结果。因此，vOX2的生物活性至今仍然未知。本发明人已经发现，可溶性vOX2能够在先天免疫系统中发挥抗炎效应。因此，在最普通的形式中，本发明提供可溶性vOX2作为抗炎剂的用途。在第一个方面中，本发明提供了可溶性vOX2用于抑制炎性免疫应答的用途，包括使免疫系统细胞群与可溶性vOX2接触。在体外、离体或体内进行的所有这些用途都包括在本发明的范围内。所述细胞群通常包括先天免疫系统的细胞，尤其是吞噬细胞，例如嗜中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞，任选地与免疫系统的多种其它细胞组合，包括T淋巴细胞(包括CD4+和CD8+T淋巴细胞)和B-淋巴细胞。不希望限于任何具体理论地，认为可溶性vOX2对吞噬细胞如单核细胞(如巨噬细胞)和嗜中性粒细胞发挥抗炎效应。例如，它可以特异性地降低经干扰素Y处理的巨噬细胞样细胞系U937中的MCP-1和IL-8产生，并且还能抑制嗜中性粒细胞的氧化爆发。因此，该方法可以包括测定对炎性免疫应答的抑制程度的步骤。这可以通过测量炎性细胞因子或趋化因子的产生尤其是巨噬细胞中的产生(例如MCP-1和/或IL-8)和/或活性氧中间体(如02或OH基团或11202)的产生来实现。当然，在体内实施该方法时，可以使用任何适当的炎症症状来监测vOX2蛋白的效果，例如炎性细胞的组织浸润、肿胀、发红等。可溶性vOX2所表现出的抗炎特性使其适用于治疗炎性疾病或其它病症，其中不适宜的或不需要的免疫应答造成患者的症状和/或疾病发病，包括自身免疫病、变态反应和移植排斥。这样的病症包括类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、多发性硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接触性和变应性皮肤病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心脏病)和炎性神经综合征。本说明书中所述的治疗方法可包括将可溶性vOX2递送至炎症位点的任何合适方法。例如，可以将可溶性vOX2蛋白直接施用于有此需要的患者。或者可将编码可溶性vOX2的核酸施用于患者，从而该蛋白通过该患者自身的细胞进行合成和分泌。又或者，可以将能够表达和分泌可溶性vOX2的细胞施用于患者。因此，本发明提供用于医疗方法中的可溶性vOX2蛋白、编码可溶性vOX2的核酸或能够表达和分泌可溶性vOX2的细胞。本发明还提供用于制备预防或治疗炎性疾病的药物中的可溶性vOX2蛋白、编码可溶性vOX2的核酸或能够表达和分泌可溶性vOX2的细胞。本发明还提供预防或治疗炎性疾病的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的可溶性vOX2蛋白、编码可溶性vOX2的核酸或能够表达和分泌可溶性vOX2的细胞。本发明还提供药物組合物，其包含与可药用载体组合的可溶性vOX2蛋白、编码可溶性vOX2的核酸或能够表达和分泌可溶性vOX2的细胞。本发明所述的方法中使用的vOX2蛋白一般通过重组表达和分泌获得，优选来自真核细胞。该vOX2蛋白可以是多价的。也就是说，其在二价的、三价的、四价的或更高价的复合体中包含两个或多个vOX2部分。不希望限于任何特定理论地，多价的vOX2可能比一价vOX2更有效地交联靶细胞表面上的受体，因此能够比一价蛋白更有效地发挥抗炎活性。单个vOX2部分可以以共价或非共价方式在vOX2复合体中结合。这种结合可以是直接的(即在vOX2部分之间)或间接的(通过与vOX2部分相连的异源组分)。例如，vOX2部分可以彼此化学交联。或者，vOX2部分可以表达为在单个多肽链中包含两个(或更多)vOX2部分的融合蛋白，其任选地由适当的多肽接头分开。或者，vOX2部分可以与异源(即非vOX2的)组分连接，所述异源组分彼此相互作用从而引起结合。因此，该复合体可以包含分别与第一和第二异源组分相连的第一和第二vOX2部分，其中所述第一和第二异源组分彼此结合。所述第一和第二异源组分可以是相同的或不同的，并可通过共价或非共价相互作用彼此结合。优选地，每个vOX2部分与其各自的异源组分一起表达为融合蛋白。异源组分的实例包括转录因子的寡聚化结构域，如通过疏水相互作用彼此结合的亮氨酸拉链基序。然而，特别优选的异源组分实例为抗体Fc区。天然构象的vOX2-Fc融合蛋白通常是包含两条多肽链的二聚体，其中每条链由一个Fc部分和一个vOX2部分组成，所述多肽链通过Fc部分之间的二硫键共价结合。所述异源组分可以能够调节vOX2分子的药代动力学特性。例如，它可以能够调节生物利用率、溶解度、稳定性、体内半衰期等。与单独的效应分子相比，包含与抗体Fc区(也叫免疫粘附素)连接的效应分子的融合蛋白通常具有增强的溶解度、稳定性和半衰期。(虽然通常期望提高vOX2部分的这些特性，但应该理解，有时需要降低这些特性中的一些或全部。可以相应地选择适当的异源组分。)也可能期望将vOX2部分与异源组分连接，所述异源组分以期望的方式调节其药代动力学特性,但不介导vOX2部分结合进多价复合体中。在另一方面中，本发明提供可溶性抗炎剂，其包含至少两个vOX2部分的复合体。如上所述，该复合体可以包含分别与第一和第二异源组分相连的第一和第二vOX2部分，其中所述第一和第二异源组分相互结合。当所述异源组分是蛋白质或肽时，其优选与其各自的vOX2部分一起表达为融合蛋白。因此，本发明提供编码这样的融合蛋白的核酸，该融合蛋白优选能够被宿主细胞分泌。还提供包含这些核酸的表达栽体以及包含这些表达栽体的宿主细胞。当所述异源组分相同(即相互结合的相同异源组分)时，通常有可能通过仅从一种这样的核酸构建体表达蛋白产物，从而形成多价复合物。当所述异源组分不同(即一个异源组分与另一个不同类型的异源组分结合)时，则必须从编码每种类型融合蛋白的核酸表达蛋白产物。因此，本发明提供组合物，其包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸编码含有第一vOX2部分和第一异源组分的融合蛋白，所述第二核酸编码含有第二vOX2部分和第二异源组分的融合蛋白，其中在表达为蛋白质时，所述第一和第二异源组分相互结合。所述融合蛋白通常能够被适当的宿主细胞分泌。所述第一和第二核酸可以在分开的表达载体或同一表达载体上。本发明还提供包含所述第一和第二核酸的宿主细胞。在优选的实施方案中，所述异源组分为抗体Fc区。因此，本发明提供可溶性vOX2-Fc融合蛋白。本发明还提供核酸，其编码能够由适当的宿主细胞分泌的可溶性vOX2-Fc融合蛋白。因此，所述核酸通常编码融合蛋白N端的信号肽，从而使该融合蛋白能够被表达它的宿主细胞分泌。本发明还提供包含编码可溶性vOX2-Fc融合蛋白的核酸的表达载体。所述载体一般包含与编码融合蛋白的序列有效连接的适当的转录和翻译调节序列，从而使宿主细胞进行转录和翻译所述蛋白质。本发明还提供含有上述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞优选为真核宿主细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。在某些实施方案中，优选哺乳动物细胞(如CHO细胞或人细胞)。本发明还提供药物组合物，其含有与可药用载体组合的本发明第二方面中所述融合蛋白、核酸、表达载体或宿主细胞。图1:vOX2-Fc的产生和纯化。A.在稳定转染的CHO细胞中产生vOX2-Fc。对收获的经改造CHO细胞的上清液进行Western印迹分析，使用抗人IgG-HRP抗体进行分析，并使用ECL印迹试剂(Amersham)显影。泳道l，未经转染的正常CHO细胞；泳道2，用重组pDR2AEFla质粒衍生物转染的CHO细胞，其表达无关的Fc-融合蛋白，KSHV补体对照蛋白(KCP:Fc);泳道3，稳定转染了pvOX2-Fc的CHO细胞系(CHO-15"69)。分子大小标记的位置标于印迹的左侧。B.蛋白纯化和精制(polishing):对经亲和纯化及"精制"的重组vOX2-Fc进行Western印迹分析。泳道l,未经转染的正常CHO细胞；泳道2，纯化自稳定转染了pvOX2-Fc的CHO细胞系(CHO-15"69)的重组vOX2-Fc。通过亲和层析(HiTrapA蛋白柱)和大小排阻层析(Superdex200)进行蛋白纯化。使用抗人IgG-HRP抗体对经纯化的vOX2-Fc蛋白进行Western印迹分析，并用ECL印迹试剂显影(Amersham)。图2:通过重组的vOX-2:Fc蛋白抑制U937单核细胞中炎性趋化因子的产生。A.MCP-1的水平。B.IL-8的水平。在通过Luminex测定对培养液进行细胞因子定量之前，在存在或不存在重组IFN-Y(5ng)和vOX-2:Fc(10ng/ml)的情况下以1x106的密度培养U937细胞48小时。图3:通过重组的vOX-2:Fc蛋白抑制人原代外周血嗜中性粒细胞中的氧化爆发而不是吞入(engulfment)。A.氧化爆发。B.吞入。通过市售的Bursttest和Phagotest测定(OPREGENPharma;BDBiosciences)以流式细胞术测量全血中这些吞噬活性的组分，对粒细胞设立门控(gating),并获得5000个事件。在进行测定之前，将肝素化的全血与重组vOX2-Fc(10吗/ml)或纯化的人IgG(10吗/ml)—起孵育(卯分钟，37。C，5%C02),或者保持不处理。在收集时，对每个血样进行白细胞分类计数，这使得测定在大肠杆菌嗜中性粒细胞的比例为6:1时进行，并且将每个受试者的数据对平均荧光强度(MFI)进行归一化。显示了三个独立实验中11个健康受试者的13个全血样品研究的累积数据。图4:通过重组vOX-2:Fc在体内抑制角叉藻聚糖诱导的急性炎性应答。通过将海藻提取物角叉藻聚糖施用于每个动物的一只后爪来诱导BALB/c小鼠足垫的产生急性炎症。在施用角叉藻聚糖前30分钟，4组小鼠接受腹膜内(IP)注射的重组vOX2-Fc(80pg/小鼠；翻组)、纯化的人IgG(80吗/小鼠；A组)、地塞米松(500吗/小鼠；參组)或PBS(令组)，然后在施用角叉藻聚糖后6、12和24小时后再进行一次。通过测量足垫的厚度来评估炎症程度，计算为接种角叉藻聚糖的后足垫与同一动物未经接种的后足垫之间的厚度差异。数据合并自三个独立的单盲实验，代表每组的平均值+/-SE(PBS和vOX2-Fc处理每组为24只小鼠，8只小鼠接受纯化的人IgG，16只用地塞米松处理)。组之间的比较数据显示于表中。图5和图6:vOX2-Fc对DBA小鼠中胶原诱导的关节炎的发生和严重性的影响。在每幅图中，图A显示每组10只小鼠的平均关节炎评分。图B显示每个组中关节炎的百分比发生率。图5显示最多至第37天时的疾病发生。图6显示最多至第42天时相同实验的结果。图7:本研究中施用的vOX2-Fc融合蛋白的氨基酸序列。vOX2序列显示为正常字体并有下划线。这代表Russo等提交的全长序列中的78-307位氨基酸。序列AADPI(正常字体，无下划线)是接头区。免疫球蛋白YlFc序列显示为斜体。免疫球蛋白的铰链区(PKSCDKPHTCP)显示为斜体并有下划线。发明详述vOX2vOX2是由KSHV病毒中命名为K14的开放读码框编码的蛋白质(Je證r等,2001)。取自Russo等(PNAS93:14862(1996))的vOX2蛋白示例性序列如下i訓TF度PGRRVVEGGVISSYFLIGAPGRTAIKTEEGVSALQN78LPPTVLPVAGTGSWRPWCAPPWTTPSASRGSMSSLFISLPWVAFIWIALLGAVGGAKVQGPMRGSAALTCAIT,DIVSTOWQKRQLPGPVMVATYSHSYGVWQTQYRHKANITCPGLWNSTLVIHNLAVDDEGCYLCIFNSFGGRQVSCTACLEVTSPPTGHVQVNSTEDADTVTC歐GRPPraVTWAAPWNNASSTQEQFTDSDGI;丁VAWRTVRIjPRGraTTPSE3D7TMGICIjITWGNESISIPASIQGPIAHDLPAAOGTIAGVMTLVGLFGIFALHHCRRKQGGASPTSDtiMDPIjSTQ该病毒蛋白是膜结合蛋白，包含N端胞外结构域、跨膜结构域(具有下划线的)以及C端胞内结构域。所述开放读码框含有两个可能的起始甲硫氨酸，在1位和78位氨基酸处。通常认为78位甲硫氨酸最有可能被用作体内的起始密码子。vOX2在体内的功能是有争议的。然而，本发明人现已发现，可溶性vOX2显示出抗炎特性，并因此可以在体内和体外用于抑制炎性应答。本发明方法中使用的可溶性vOX2蛋白可以是多价的。也就是说，它们可包含两个或更多vOX2部分。多价vOX2可能比一价vOX2更有效地与靶细胞表面上的受体交联。vOX2部分可共价地或非共价地相互结合，尽管出于稳定性并且可能地还有活性方面的原因而优选共价结合。两个vOX2部分可以共表达为融合蛋白。为了产生融合蛋白，构建了在一个连续开放读码框中包含每个部分的编码序列的核酸表达载体，从而这两个部分可以翻译为同一条多肽链的一部分。通常，在两个结构之间包括柔性的肽接头，以允许这两个组分自由地相互作用而没有空间位阻。技术人员完全能够设计出适当的接头。常规地，这样的接头长度在12至20个M酸之间，并且小的和亲水的氨基酸g(例如甘氨酸和丝氨酸)的比例很高，以提供所需的柔性，而不破坏该分子的水溶性。或者，可以改造vOX2部分以提高其相互间的亲和力。这可以通过多种方式实现。例如，可以引入半胱氨酸以使这两个部分相互间形成二硫键。又或者，可以通过将每个vOX2部分与异源组分连接来促进两个vOX2部分之间的相互作用，其中所述两个异源组分能够相互结合。当该异源组分为多肽时，其可以与所述vOX2部分表达为融合蛋白。优选的异源组分是包含抗体Fc序列、优选为一个或多个抗体Fc结构域(例如IgG、IgM的CH2、CH3和/或CH4结构域(适当时)等)的多肽。优选地，还包括通常位于CH1和CH2结构域之间的铰链序列。铰链区含有半胱氨酸残基，其在完整天然抗体的重链之间形成二硫键。因此，如果本文所述的vOX2-Fc分子中存在铰链区，则将形成类似的键以稳定链之间的相互作用。人IgGl是优选的融合配偶体。技术人员清楚可用于增强或稳定vOX2部分之间相互作用的替代性异源组分。它们包括亮氨酸拉链多肽，其通过疏7K相互作用二聚化。尽管优选重组方法，但是vOX2部分也可以通过化学手段共价连接。适于使多肽分子彼此缀合或交联的双功能和多功能化学接头分子对技术人员来说是众所周知的。无论是多价或一价，本文所述可溶性vOX2蛋白中每个vOX2部分优选地包含vOX2蛋白的胞外结构域(即78位至309位氨基酸的序列，根据需要包括或不包括信号肽)或者其足以表现出抗炎效应的片段。抗炎效应指使用实施例中所述的任一测定进行评估时U937细胞的IL-8或MCP-1产生、嗜中性粒细胞的氧化爆发、角叉藻聚糖模型中的炎症或^f吏用DBA小鼠的胶原诱导关节炎模型中疾病发生或严重性中一种或多种的统计学显著性降低。优选地，所述vOX2部分包含上文显示ECD序列中的至少50个^J^酸，并可包含上文显示ECD序列中的至少100、150或200个氨基酸。然而，技术人员会理解，可以对该M酸序列进行某些改变而基本上保留该可溶性蛋白的抗炎活性。因此，所述vOX2蛋白或部分可包含至少50、100、150或200个氛基酸的序列，该序列与上述序列在相关重叠上具有至少80%的同一性，优选地与该序列具有至少850/。的序列同一性，更优选至少卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，只要其表现出所需的抗炎活性。特别地，vOX2序列中的保守性替换(与参考序列比较)尤其可以较好耐受，而不显著影响功能。保守性替换可以定义为氨基酸类别之内的替换和/或在BLOSUM62矩阵中为正分值的替换。根据一种分类，氨基酸类别为酸性的、碱性的、不带电极性的和非极性的，其中酸性氨基酸为Asp和Glu;碱性氨基酸为Arg、Lys和His;不带电的极性氨基酸为Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr;非极性氨基酸为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp和Cys。根据另一种分类，氨基酸类别为小的亲水性的、酸/酰胺/亲水性的、碱性的、小的疏水性的以及芳族的，其中小的亲水性氨基酸为Ser、Thr、Pro、Ala和Gly;酸/酰胺/亲水性氨基酸为Asn、Asp、Glu和Gln;碱性氨基酸为His、Arg和Lys;小的疏水性氨基酸为Met、Ile、Leu和Val;芳族氨基酸为Phe、Tyr和Trp。在BLOSUM62矩阵中为正评分的替换如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>与参考序列的氨基酸序列同一性百分比(％)定义为在进行序列比对并在必要时引入缺口以实现最高序列同一性百分比之后，候选序列中与参考序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，任何保守性替换都不认为构成序列同一性。可以通过WU-BLAST-2(Altschul等,MethodsinEnzymology，266:460-480(1996))确定同一性百分比的数值。WU-BLAST-2使用若干检索参数，其中大多数设置为默认值。将可调整的参数设置为以下值重叠跨度=1,重叠分数(overlapfraction)=0.125，词阈值(wordthreshold)(T)=11。用WU-BLAST-2确定的匹配的相同残基数除以参考序列的残基总数(忽略通过WU-BLAST-2在参考序列中引入的使比对评分最大化的缺口)，再乘以100,从而确定Q/。氨基酸序列同一性值。氨基酸相似性百分比(％)以与同一性相同的方式进行定义，只是计算BLOSUM62矩阵中为正评分的残基。因此，不相同但具有相似特性(例如由保守性替换得到的)的残基也计算在内。类似地，与参考核酸的核酸序列同一性百分比(％)定义为候选序列中与参考核酸序列中核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。本文使用的同一性值可以由WU-BLAST-2中设置为默认参数的BLASTN模块产生，其中重叠跨度和重叠分数分别设置为l和0.125。在本说明书中所述的可溶性vOX2蛋白优选表达自真核细胞，如酵母细胞、昆虫细胞(例如Sf9细胞)以及哺乳动物细胞(例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞)。优选地，所述蛋白正确折叠并因此能与CD200受体(CD200R)结合。适当的测定描述于Foster-Cuevas等(2004)及其引用的参考文献。优选地，vOX2蛋白制备物中至少20%的vOX2部分能够与CD200受体结合；更优选地，vOX2蛋白制备物中至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的vOX2部分能够与CD200受体结合。使用CD200受体的亲和纯化技术可用于在可溶性vOX2蛋白制备物中实现理想的结合活性水平。可溶性vOX2蛋白的治疗用途本发明人已显示，可溶性vOX2具有抗炎特性，尤其是能够下调免疫系统先天部分(如嗜中性粒细胞和巨噬细胞)介导的反应。该蛋白可特异性地降低经干扰素y处理的巨噬细胞样细胞系U937中的MCP-1和IL-8产生，还能抑制嗜中性粒细胞的氧化爆发。它也能降低鼠模型中由角叉藻聚糖诱导的炎症，重要的是，其显著影响DBA小鼠中由^^、诱导的关节炎的发生和严重性。这一结果特别令人惊讶。因此，可溶性vOX2可用于治疗炎症、炎性疾病或其它疾病，在这些疾病中涉及先天免疫系统的不恰当或不希望的免疫应答是该疾病症状和/或疾病发病的原因。这样的疾病包括自身免疫病、变态反应和移植排斥。因此，例如，可溶性vOX2可用于治疗类风湿性关节炎、4艮屑病、炎性肠病、多发性硬化、哞喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接触性和变应性皮肤病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心脏病)和炎性神经综合征。可将可溶性vOX2蛋白以药物组合物直接施用于受试者。或者，可以对受试者施用编码可溶性vOX2蛋白的核酸，从而由受试者自身的细胞表达并分泌可溶性vOX2蛋白。所述核酸通常是一种或多种表达载体的一部分，可以作为^t酸施用或在递送载体如病毒载体(例如腺病毒、慢病毒或逆转录病毒)中施用。或者，可以对受试者施用经改造以分泌可溶性vOX2蛋白的细胞。优选地，所述细胞与受试者是同源的或组织相容的。例如，细胞可取自受试者，经一种或多种适当的载体转染后，再施用于该受试者。作为补充或替代，所述分泌细胞可^V胶嚢，例如在生物惰性聚合物中，以防止移植细胞与宿主免疫系统之间发生相互作用。技术人员将能够设计用于治疗用途(以及用于本说明书中所述的其它用途)的适当的核酸表达载体。所述载体将一般含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、增强子序列、标记基因和其它序列，这取决于待施用的可溶性vOX2蛋白的具体形式(见上文)。该载体可旨在整合进宿主细胞基因组，或可作为附加体独立于宿主基因组而存在和复制。通过本发明方法进行处理的优选受试者是哺乳动物。优选的受试者是灵长类(包括人)、啮齿类(包括小鼠和大鼠)，以及其它常见的实验动物、家畜和农业动物，包括但不仅限于兔、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊等。本文所述的复合体、多肽、核酸和细胞可以配制成药物组合物。除了上述物质之一之外，这些组合物可包含可药用赋形剂、载体、緩冲剂、稳定剂或其它本领域技术人员所熟知的材料。这些材料应该是无毒的，并且不应干扰所述活性成分的效力。所述载体或其它材料的确切性质可取决于给药途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌内和腹膜内途径。用于口服给药的药物组合物可以为片剂、胶嚢剂、粉剂或液体的形式。片剂可包括固体载体如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体栽体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水、葡萄糖或其它糖溶液或者二元醇诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。就静脉内、皮肤或皮下注射或者患病位点注射而言，活性成分将为可用于肠胃外的水溶液形式，其不含热原，并具有适当的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够熟练地制备适当的溶液，使用例如等渗载体(如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液)。需要时，可以包括防腐剂、稳定剂、緩冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。无论待施用于个体的活性剂(例如本发明的细胞、多肽、核酸分子、其他药用剂)的性质如何，都优选以足以显示对个体的益处的"预防有效量"或"治疗有效量，，(在有可能出现的情况下，尽管是预防也可以认为是治疗)施用。实际的给药量以及给药的速率和时程将取决于受治个体的性质和严重性。治疗的处方(例如剂量的确定等)在全科医师和其它医生的责任范围内，通常考虑待治疗的疾病、个体患者的状况、递送位点、给药方法以及开业医师已知的其它因素。上述技术和方案的实例可见于Remington'sPharmaceuticalSciences,20thEdition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。或者，通过使用耙向系统如抗体或细胞特异性配体，可以使用靶向治疗将活性剂更为特异地递送至某些细胞类型。可能由于多种原因而需要靶向治疗，例如，所用试剂具有不可接受的毒性，或者否则将需要过高的剂量，或者否则将不能进入乾细胞。组合物可以单独施用，或者同时或连续地与其它治疗组合施用，取决于待治疗的状况。材料和方法克隆vOX2-Fc融合蛋白将KSHVvOX2蛋白作为融合蛋白的氨基端结构域与人IgGiFc区的C端片段一起框内表达。基于我们自己的研究(数据未显示)和先前公开的分析(Chung等，2002,Neipel等，1997,Russo等，1996),选择两个可能的甲硫氨酸残基(残基1或残基78)中的第二个作为起始密码子。通过PCR扩增ORFK14,并TA克隆进pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。所述基因扩增自BC-1KSHV感染的原发性渗出性淋巴瘤细胞系(Cesarman等，1995),使用以下PCR引物有义，5'—GCTCTAGATCTCTAGCCTCTTCATTTCATTAC-3'反义5'"*TATGCGGCCGCGGCCGCGGSAAGGTCATGGGC—3'。这些扩增引物包括限制性位点(？V^I和X6fll),使得可以将该基因亚克隆进表达载体。对K14插入片段的两条链进行测序，证实PCR没有引入错误，并将该基因亚克隆进pDR2AEFla表达载体(参阅(Spiller等，2003))而产生pvOX2-Fc。亚克隆包括使用AT6flI和iVWI将K14插入片段从pCR2.1-TOPO上消化下来，并连接到经I和I消化的pDR2AEFla中。在K14插入位点对pvOX2-Fc质粒进行测序，以确保连接已产生了病毒与IgGi基因的框内融合。得到的vOX2-Fc融合蛋白的氨基酸序列示于图7。细胞和细胞培养在37。C、5%C02T,在补充了10%热灭活胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素-链霉素(1%)、非必需氨基酸(O.lmM)的RPMI1640培养基(BioWhittaker)中培养人成单核细胞系U937。为了使U937细胞分化为巨噬细胞样表型，将其在重组干扰素(ifn)-y(5ng/ml;R&DSystems)存在下培养48小时。获得知情同意书后，从健康的成人志愿者收集肝素化的静脉血。使用SysmexSE,9500血液分析仪(SysmexCorp.,Japan)进行白细胞计数和分类计数。在一些测定中，通过葡聚糖沉降和红细胞低渗裂解、随后通过Ficoll(Sigma)进行差异密度梯度离心来从全血中分离多形核细胞。为了得到产生vOX2-Fc蛋白的细胞系，将pvOX2-Fc转染进CHO细胞。在含有潮霉素B(500ng/ml)的培养基中获得稳定细胞系，并分别使用抗人IgG-FITC(Sigma)或抗人IgG-HRP抗体通过免疫荧光和Westen印迹筛选出产生重组蛋白的稳定细胞系。将vOX2-Fc蛋白质产生最多的细胞系命名为CHO-15"69。蛋白产生和纯化收集CHO-15，，69细胞上清液，并使用AKTA蛋白纯化系统(Amersham)在A蛋白柱(HiTrap,Amersham)上对vOX2國Fc进4亍亲和纯化。为了去除截短的vOX:Fc和Fc蛋白片段，接着通过在Superdex200大小排阻柱(Amersham)上进行凝胶过滤来"精制"该蛋白。通过以下方法评估蛋白纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳并利用考马斯亮蓝R250(Bio-RadLaboratories)或SyproRuby(Analgene)染色来分析凝胶，4吏用抗人IgG-HRP和抗牛Ig-HRP(Sigma)进行western印迹检测。切下所有的蛋白条带并通过质谱(MS)或基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质i普进行鉴定。在一些实验中，利用同样的方案纯化人IgG纯化用作阴性对照。氧化爆发测定利用基于流式细胞术的商品化Bursttest测定(OPREGENPharma;BDBiosciences,Oxford,UK)，在全血外周多形核单核细胞中测量吞噬过程的氧化爆发组分。该测定允许定量测定白细胞的活性，而无需预先纯化细胞。Bursttest测定依赖于作为微粒刺激物的未标记的经调理大肠杆菌(五."/Z)以及作为氧化活性荧光底物的二氢罗丹明(DHR)123。简言之，将肝素化的全血与重组vOX2-Fc(10[ig/ml)或纯化的人IgG(10吗/ml)—起孵育(卯分钟，37。C，5%C02)，再与经调理的大肠杆菌细胞(6个细胞/白细胞)一起孵育(7分钟，37°C,5%C02)。无刺激物的样品作为阴性(背景)对照。然后加入DHR123并孵育细胞(10分钟，37。C，5%C02)。加入裂解緩冲液终止反应，该緩冲液部分固定白细胞并裂解红细胞。最后，为了排除细菌或血小板的聚集假象，在临进行流式细胞术分析之前将细胞DNA染色。利用流式细胞仪(FACSCalibur，BDBiosciences)对细胞进行分析，获得5000个粒细胞事件以得到产生反应性氧基团的细胞百分比和数目，以及以平均荧光强度衡量的其酶活性程度。吞谨测定利用基于流式细胞术的商品化Phagotest试剂盒(OPREGENPharma;BDBiosciences),在全血外周多形核单核细胞中测量吞噬作用的吞入方面。与Bursttest类似，该测定系统允许定量测定白细胞的吞入活性，而无需预先纯化。简言之，将肝素化的全血与重组vOX2-Fc(10吗/ml)或纯化的人IgG(10ng/ml)—起孵育(90分钟，37°C，5%C02)，再与经调理的FITC标记大肠杆菌细胞(6个细胞/白细胞)一起孵育(IO分钟，37。C，5%C02)。通过4X:孵育并加入淬灭溶液来终止摄取。该溶液使细菌表面结合的FITC荧光淬灭而内化颗粒的荧光不变，从而允许利用流式细胞术分辨附着的和内化的细菌。洗涤步骤后，通过低渗裂解去除红细胞。最后，如Bursttest测定中所述，将细胞DNA染色。利用流式细胞术(FACSCalibur,BDBiosciences)对细胞进4亍分析，并获得5000个粒细胞事件。MCP-1和IL-8蛋白的测量在存在或不存在重组vOX2-Fc蛋白(10jig/ml)时，不处理或用rIFN誦y(5ng/ml)处理U937细胞(1x106/ml),并孵育48小时(37。C，5%C02)。然后，收集该培养液，并通过Luminex测定法定量细胞因子和趋化因子的浓度。体内研究测试急性炎症的鼠模型以评估重组vOX2-Fc蛋白的体内抗炎效应。在该模型中，如前述通过将海藻提取物角叉藻聚糖施用于每只动物的一个后爪中来诱发BALB/c小鼠(JacksonLaboratories)足垫的急性炎症(Leung等，2001)。在每个实验中，四组BALB/c小鼠在施用角叉藻聚糖之前30分钟接受腹膜内(IP)注射重组vOX2-Fc(80ng/小鼠)、纯化的人IgG(80pg/小鼠)、地塞米松(500吗/小鼠)或^酸緩沖盐水(PBS)。通过测量足垫厚度来确定炎症程度，计算为接种角叉藻聚糖的后足垫与同一动物未接种的后足垫之间的厚度差异。在施用角叉藻聚糖后6、12和24小时后进行这些测量。进行了三次独立的单盲实验。统计分析通过无参数MannWhitney检验来测定Bursttest、Phagotest和细胞因子测定中各处理组之间的差异。如果P￡0.05,则认为这些差异显著。对于体内研究，通过GLM重复测量进行数据分析，之后使用Tukey作为四个治疗组之间的多重比较检验(SPSS)。为了分析每个时间点(6、12、24小时)各组之间的差异，进行了MannWhitney检验。如果P^0.05，则认为差异显著。结果重组vOX-2:Fc蛋白的克隆、合成和纯化将全长KSHVORFK14基因克隆进pDR2AEFla真核表达载体中，其中vOX2蛋白作为与人IgGiFcC端结构域的融合蛋白产生。将vOX2表达为与该Ig^结构域的融合蛋白的优势包括(i)提供了用于蛋白纯化的亲和标签，和(ii)可将重组蛋白的半衰期提高多达10倍(Harris等，2002)。然后，在细胞系CHO-15"69中产生重组vOX-2:Fc蛋白(图1A),并利用A蛋白亲和以及大小排阻层析从培养液中进行纯化(图1B)。选择大小排阻层析是因为仅通过A蛋白亲和层析会纯化出重组vOX2-Fc的多个条带(图1B)。通过MS或MALDI-TOFMS将这些条带的身份确定为vOX2-Fc二聚体、单体和截短形式，以及Fc自身(数据未显示)。在大小排阻层析后，获得了重组vOX2-Fc的单条带(图1B)。通过vOX-2:Fc蛋白在体外抑制髓样细胞的炎性应答为了确定vOX-2:Fc蛋白是否调节髓样细胞的炎性应答，评估与该重组蛋白接触的巨噬细胞样U937细胞的细胞因子产生镨。不处理细胞，或者在存在或不存在vOX-2:Fc蛋白时用rIFN-y处理U937细胞，并测定炎性细胞因子的产生。vOX2-Fc处理显著降低了MCP-1(约30%)(图2A)和IL-8(约50%)(图2B)的产生。这种效果是特异性的，因为其它炎性细胞因子包括嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、MIP-la、MIPip、RANTES、IL-ip、IL-6和TNFa的产生未受影响(数据未显示)。对vOX-2:Fc调节髓样细胞活性的进一步研究表明，该蛋白显著下调(至少25%)原代人嗜中性粒细胞的氧化爆发活性(图3A)。这种抑制对于吞噬作用的这一方面是特异性的，因为这些细胞的吞入活性未受影响(图3B)。通过重组vOX-2:Fc体内抑制急性炎性应答因为重组vOX2-Fc蛋白在体外具有抗炎活性，所以测定了其在这方面的体内潜能。因此，为了检查vOX2-Fc对于实验性急性炎症发生的影响，用重组vOX2-Fc蛋白(80吗)处理BALB/c小鼠，其在通过角叉藻聚糖接种足塾诱发急性炎症前30分钟经腹膜内施用。在6、12和24小时后测定足垫的炎症程度(参阅"方法")。用纯化的人IgG(80吗)、地塞米松(500吗)或PBS代替vOX2-Fc注射三组对照组小鼠中的每一组(图4)。总体而言，根据GLM重复测量分析以及之后的Tukey检验，如同测量足垫厚度所确定的，重组vOX2-Fc处理显著抑制了急性炎性应答，PBS与vOX2-Fc，P〈0.0001;IgG与vOX2-Fc，PO.005;地塞米松与vOX2-Fc，PO.OOl。与预计一样，PBS和IgG处理组的炎性应答t间没有显著差异。为了分4斤每个时间点(6、12和24小时)vOX2-Fc组之间的承制性影响，进行了无参数MannWhitney检验(表l)。这些分析表明，在研究持续时间中(24小时)与PBS处理组相比，以及在至少12小时中与人IgG处理相比，重组vOX2-Fc蛋白显著抑制实验性诱发的急性炎症。对足垫的组织病理学分析支持了这些分析。因此，该数据显示与未处理小鼠相比，急性炎症严重性和炎性细胞募集至炎症位点的统计学显著性降低。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表1.对小鼠足垫角叉藻聚糖处理所诱发炎症的抑制进行统计分析。利用MannWhitney无参数分析对vOX2-Fc处理组的测量与对照组测量进行比较。实验方法参见图4的图例。抑制DBA小鼠中胶原诱导的关节炎在盲研究中检查vOX2-Fc对DBA小鼠中胶原诱导的关节炎的影响。使用另外两种Fc融合蛋白作为对照。它们是补体调节蛋白KCP的Fc融合物，以及缺乏补体调节活性的KCP蛋白三赖氨酸突变体(KCPmut)的Fc融合物。在第0天，用II型胶原和弗氏完全佐剂免疫小鼠，并在第21天用盐水中的II型胶原进行攻击。预计疾病第一种体征在第27天发生。预计至第35天发生广泛的疾病。各组小鼠(每组10只)在第-1和第0天接受PBS中100pg的相应Fc融合蛋白。每组在第3天以及之后每隔两天直至第27天(包括第27天)接受PBS中的50吗蛋白。另一个对照组的小鼠只接受PBS。至第37天时的结果示于图5。数据表示为相关时间点上每组的平均分。至第42天时的结果(除了KSP:Fc对照以外)显示于图6。该数据表明，vOX2-Fc显著抑制该模型中关节炎的发生和严重性。讨论KSHV是最近描述的人类致癌病毒(Chang等，1994)。它是卡波西肉瘤(KS)的致病因素，该病是影响AIDS患者和老年地中海人的复杂肿瘤，并且是非洲最常见的肿瘤。KS的发病机制相当复杂，并且最近的证据指出KSHV诱导受感染的上皮细胞转录再编程至淋巴表型，从而促进淋巴管发生，并因此促进肿瘤发生(Hong等，2004,Wang等，2004)。负责这种转录再组织的病毒基因尚未最后确定，但是可能包括G蛋白偶联受体(Bais等，2003)。尽管如此，近20。/。的KSHV基因组包括具有免疫调节活性的基因。它们包括被确定为抑制MHCI表面表达(Coscoy&Ganem，2000)、调节T细胞免疫突触(Coscoy&Ganem，2001)、抑制补体活化(Spiller等，2003)、中断干扰素信号级联(Zhu等,2002)、趋化因子信号(Boshoff等，1997)以及B细胞受体信号(Choi等,2000)的基因。推定的免疫调节KSHV基因之一(ORFK14)的vOX2的产物的功能是有争议的，归结为巨噬细胞活化(Chung等，2002)和抑制(Foster-C譜as等，2004)活性。为了评估vOX2在本研究中的功能，将其表达为具有人Ig仏可结晶片段(Fc)结构域C端的N端融合蛋白。我们通过测量其在原代细胞或细胞系中对吞噬细胞吞入、氧化爆发和促炎细胞因子释放的影响来评估vOX2-Fc的体外抗炎特性，并发现其降低嗜中性粒细胞中的氧化爆发活性并下调促炎趋化因子IL-8和MCP-1的产生。重要的是，还在模型中评估了vOX2-Fc的影响，在该模型中通过施用海藻提取物角叉藻聚糖诱导小鼠足垫的急性炎症。施用重组vOX2-Fc显著抑制该炎症效应，提供了该重组蛋白抑制急性炎性应答(特别是中性粒细胞的流入量)的确定证据。我们的发现表明，重组vOX2-Fc蛋白将负免疫调节信号传递给吞噬细胞，从而抑制先天免疫应答。vOX2-Fc融合蛋白也能抑制鼠科模型中胶原诱导的关节炎的发生。vOX2-Fc蛋白抑制人外周血嗜中性粒细胞受到细菌细胞刺激后ROI的产生。ROI稳态对正常的细胞功能是关键性的，因为低水平的ROI对许多细胞信号转导事件至关重要。在生理条件下，正常细胞代谢中产生的ROI水平与内源抗氧化剂水平之间存在平衡，所述内源抗氧化剂用于防止组织受到氧化损伤(McCord，1993)。vOX2-Fc抑制嗜中性粒细胞中的氧化爆发依赖于将vOX2-Fc与细胞预孵育至少2小时。这种对细胞与其它免疫调节剂预孵育的依赖性在之前已有报道(Chen等，2004，Lehn等，1989)。还应该注意，IgG复合物是ROI产生的已知刺激剂(Satriano等，1999)，其进一步支持了我们的IgG对照研究中vOX2-Fc的抑制活性不是由于该分子的Fc组分。已经将氧化胁迫与炎性反应相联系，甚至ROI水平的瞬时提高也是血管生物学的重要中介体，影响细胞生长、凋亡、迁移、炎症和分泌(综述于(Fattman等，2003，Touyz&Schiffrin，2004))。而且，ROI的过量产生与许多疾病的发病机制相关，如心血管疾病、神经疾病、肾衰竭和肺疾病(综述于(Bowler&Crapo,2002，Delanty&Dichter，1998，Fukai等，2002))。ROI也可以代表基因活化的第二信使系统(综述于(Droge,2002))，其可能对组织损伤期间趋化因子如MCP-1和IL-8的产生具有重要性(DeForge等，1993，Satriano等，1993,Vlah叩oulos等，1999)。事实上，释放趋化因子是vOX2-Fc负调控的另一种髓系功能。我们发现经IFN-Y处理而发生分化的单核细胞U937细胞产生MCP-1和IL-8(二者均具有促炎作用)的能力被显著抑制(图2)(Akahoshi等，1994,Baggiolini,2001,Endo等,1994，Frangogiaimis等,2002，Hatano等，1999,Poddar等，2001,Withanage等，2004,Yla-Herttuala等，1991)。因为促炎趋化因子和毒性氧代谢物增加了心血管、关节炎、肿瘤以及神经退行性疾病的发病，所以vOX2-Fc有助于开发针对这些疾病的新疗法。尽管本发明已结合上文的实施方案进行了描述，然而当给出该公开内容后，许多等价的改良和改变对于本领域的技术人员是显而易见的。因此，所公开的本发明实施方案应认为是示例性而非限制性的。可以对所述实施方案进行各种改变而不背离本发明的精神和范围。本文所引用的所有参考文献均明确地通过参考方式并入本文。参考文献Akahoshi,T,,Enclo,H.fKondo,H.,KashiwazaJci,S.,Kasahara,T.,Mukaida,Harad$,A,&Matsushiraa,K,(1994).Essentialinvolvementof丄nterleukin—8inneutrophilrecruitmentinrabbitsw丄thacuteexperimentalarthritisinducedbylipopolysaccharideandinter工eukin一l.Irymp力oA:ineCy亡oti/ie13,113-6,Baggiolini,(2001),Chemokinesinpathologyandmed丄cine,JIntexTi船c250,91-104，Bais,C,rVanGeelen,A.,ErolesfP.,Mutlu,A.,Chiozzini,C.,Dias,S.,Silverstein,R，I,,Rafii,S,&Mesri,S，A,(20Q3),Kaposi'ssarcoruaassociatedherpesvirusGprotein-coupledreceptori咖ortalizeshumariendothelialcellsbyactivation。ftheVEGFreceptor-2/KDR.C5/3c:ejrCe"3,131-仏Boshoff,C,,Endo,Y.fCollins,P.D,,Takeuchi,Reeves,J.D,,Schweickart,V,L.,S丄ani,M.A，,Sasaki,T.,Williams,r,J"Gray,E5,Moore,P.S"Chang,&Weiss,R.A,(199",AngiogenicandHIV-inhibitoryfunctionsofKSHV-encodedchemokines[seecomments].Science278,290-4.Bowler,R,P,&Crapo,J,D,(2002>.Oxidativestressinairways''istherearoleforextracellularsuperoxidedisiuutaseAmJ"i^esplrCritCsreMed166,S38-43.Cesarman,E,fMoore,S.,Rao,P,HwInghirami,G*,Knowles,D,M.&Chang,(1995)*Invitroestablishmentandcharacterizationoftwoacquiredimmunodeficiencysyndrome—relatedlymphomacelllines(BC-landBC-2)containingKaposi'ssarcoina—associatedherpesvirus—like(KSHV)DNAsequences.Blood86,2708-14,Chang,Y*.fCesamanfE,,Pessin,MfS,,Lee,5\,Culpepper,J.,KnowlesrD.M,&Moore,P.S.《，4).Identificationofherpesvirus-likeDNAsequencesinAIDS-associatedKaposi'ssarcoma.Science266,1B65-9,Chen,J.W,rLin,F,Y,,Chen,H,,Wu,T,C.,Chen,Y,&."Lin,s，J,(2004).CarvedilolInhibitsTumorNecrosisFactor-{alpha}-InducedEndothelialTranscr丄pticmFactorActivation,AdhesionMoleculeExpression,andAdhesivenesstoH咖anMononuclearCeils.Artez"ioscJez"rTjJromdVaseChoi,J,K.,Lee,B,S,,Shim,S*Li,M.&Jung,J.(2000),IdentificationofthenovelK15gecieattherightmostendoftheKaposi'ssarcoma-associatedherpesvirusgenome，JV"ijro274,436—46.Chung,H,,Means,R.E,,Choi,J,Lee,B,S，&Jung，J.U，(2002),Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirus0X2glycoproteinactivatesmyeloid-lineagecellstoinduceinflarrunatorycytokineproduction,JViro_Z76,4688-98.CoscoyfI*'&Ganem,D.(2000),Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirusencodestwoproteinsthatblockcellsurfacedisp丄ayofMHCclass工chainsbyenhancingtheirendocytosis.ProcMatlAcsdSc丄USA",8051-6,Coscoy,L.&Ganem,D.(2001〉.AviralproteinthatselectivelydownregulatesICAM-1andB7-2andmodulatesTcellcost丄mulation.JOli/]Invest107,1599—606，DeForge,!>."E.,Prestori,A.Takeuc^i,E,,Kemiey,J.,Boxer,A.&Remick,D.G,(1993).Regulationofintsrleukin8geneexpressionbyoxidantstress.<J5ioJC力柳268,25568-Delanty,&Dichter,M.A.(1998}.Oxidativeinjuryinthenervoussystem,ActaWeuroJScsjid98,145-53,DrogefW.(2002〉.Freeradicalsinthephysiologicalcontrolofcei!Lfunction,PhysiolSev82,47-95,Endo,H,,Akahoshi,T.,Nishimura,A.,Tonegawa,M.,Takag丄sh丄rK.,Kashiwazak丄,S.,Matsushima,K.&Kondo,H.(1994),Sxperi肺ntalaxttixitisinducedbycontinuousinfusionofIIj-8intorabbitJcneejoints.CUinSx_pI/nmurrca96,31-5,Fattman,C，L.,Schaefer,Ij,M.&Oury,T,仏(2003).Extracellularsuperoxidedis脆taseinbiologyand鹏dici:ne.FreeSsdicSioJ胸d35,236-56.Foster-CuevasrM.rWright,G.J.,Pufclavec,M.Brown,M.&Barclay,A.N，(2004)Humanherpesvirus8K14proteinmimicsCD200indown-regulatingmacrophageactivationthroughCD2O0receptor,JVirol78,7667-76.Frangogiannis,Smith,C,W.&Entman,M.L,(2002),Theinflammatoryresponseinmyocardialinfarction,Cajrc/iovascRes53,31-47.FuJcai,T.,Pols,R.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聚化结构域。55.根据权利要求54的组合物，其中所述异源组分是亮氨酸拉链基序。56.根据权利要求50至55中任一项的组合物，其用于医学治疗方法。57.根据权利要求50至55中任一项的组合物，其用于预防或治疗炎性疾病。58.预防或治疗炎性疾病的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的权利要求50至55中任一项所述的第一和第二核酸。59.药物组合物，其包含与可药用载体组合的权利要求50至55中任一项的组合物。60.根据权利要求59的组合物或方法，其中所述炎性疾病为自身免疫病、变态反应或移植排斥。61.根据权利要求60的组合物或方法，其中所述炎性疾病为类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、多发性硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接触性或变应性皮肤病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心脏病)或炎性神经综合征。62.试剂盒，其包含权利要求50至55中任一项所述的第一和第二核酸。63.根据权利要求62的试剂盒，其中每种核酸均与可药用载体组合。64.根据权利要求62或权利要求63的试剂盒，其中所述第一和第二核酸位于各自的第一和第二表达载体上。65.宿主细胞，其包含权利要求38至42中任一项所述的核酸，或者包含权利要求50至55中任一项所述的第一和第二核酸。66.根据权利要求65的细胞，其用于医学治疗方法。67.根据权利要求65的细胞，其用于预防或治疗炎性疾病。68.预防或治疗炎性疾病的方法，包括对有此需要的患者施用有效量的根据权利要求65的细胞。69.药物组合物，其包含与可药用载体组合的根据权利要求65的细胞。70.根据权利要求67或权利要求68的细胞或方法，其中所述炎性疾病为自身免疫病、变态反应或移植排斥。71.根据权利要求72的细胞或方法，其中所述炎性疾病为类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、多发性硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接触性和变应性皮肤病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心脏病)或炎性神经综合征。72.可溶性抗炎剂，其包含至少两个vOX2部分的复合体。73.根据权利要求72的可溶性抗炎剂，其中包含融合蛋白，所述融合蛋白包含任选地通过接头分开的至少两个vOX2部分。74.根据权利要求72的可溶性抗炎剂，其包含与各自的第一和第二异源组分相连的第一和第二vOX2部分，其中所述第一和第二异源组分彼此相连。75.根据权利要求74的可溶性抗炎剂，其中所述异源组分是与其各自vOX2部分的融合蛋白。76.根据权利要求74或权利要求75的可溶性抗炎剂，其中所述异源组分为抗体Fc区。77.根据权利要求74或权利要求75的可溶性抗炎剂，其中所述异源组分为转录因子的寡聚化结构域。78.根据权利要求77的可溶性抗炎剂，其中所述异源组分为亮氨酸拉链基序。79.编码权利要求73或75至78中任一项所述融合蛋白的核酸。80.包含根据权利要求79的核酸的表达载体。81.宿主细胞，其包含根据权利要求79的核酸或根据权利要求80的表达载体。全文摘要本发明提供由卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码的可溶性vOX2蛋白衍生物，及其用于治疗炎性疾病如自身免疫病、变态反应和移植排斥的用途。文档编号A61K39/245GK101184505SQ200680018907公开日2008年5月21日申请日期2006年4月3日优先权日2005年4月1日发明者大卫·J·布莱克布恩,赛义德·阿卜杜勒拉欣·拉扎伊申请人:格拉斯哥大学大学行政评议会