一种含有egcg的微乳注射剂的制作方法

专利名称：一种含有egcg的微乳注射剂的制作方法
技术领域：
本发明属于药物新技术领域，涉及一种用于治疗癌症、肿瘤疾病的药物制剂及其制备方 法，具体地说是一种含有EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)的微乳注射剂及其制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，每年全球肿瘤死亡总数达700万人。 WHO最近宣称，到2020年全世界肿瘤发病率将是现在的2倍。目前全世界每年有1000万新 增癌症患者。随着我国人口老龄化以及现代化进程加剧，我国肿瘤发病率逐年增高，每年新 增肿瘤病人超过200万人，肿瘤已成为我国居民的第一大死因。其中肺癌的发病率居所有癌 症之首。
目前癌症的治疗仍然以化、放疗、手术治疗为主。近年来，抗肿瘤新药的研发取得极大 的进展，近十年来，美国FDA批准的新药中，抗肿瘤药一直是主要的品种之一，抗肿瘤药作 用的靶点涉及更多、更深。出现很多针对新靶点的药物，如新型酶的抑制剂、新生血管抑制 剂、基因治疗等。
绿茶提取物经过进一步的分离提纯，使EGCG (表没食子儿茶素没食子酸酯)的纯度可 以达到95%左右，甚至可以到99%。
(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主 要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，因为具有特殊的立体化学结构，EGCG 具有非常强的抗氧化活性，其抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，是维生素E的25倍， 能够保护细胞和DNA免受损害，在抗癌和心血管疾病方面担当了重要的角色。此外，它也 用作肿瘤多药耐药性的逆转剂，能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性。EGCG 的机构式如下 '
名称 (2R，3R)-2-(3，4,5-Trihydroxyphenyl)-3，4-dihydro-l(2H)-benzopyraii-3,5,7-trio1
3-(3，4,5-trihydroxybenzoate);
CAS号 989-51-5分子式 C22H18Ou 分子量 458.38
一、 EGCG作用机理研究
(1)靶向攻击，强力分解复合化合物茶多酚含有EGCG、 ECG、 EGC、 EC等，能自动识 别癌细胞。其独有的EGCG成份作用癌细胞组织可抑制癌细胞生长所需的酵素(Nox)及尿激酶 的活性。并对癌细胞进行化学分解，不伤害正常健康细胞；(2)抑制合成EGCG能阻止增 殖，与健康细胞的肿瘤受体结合，阻止致癌性苯并芘类诱导体及亚硝基化合物的形成，抑制 致癌基因与DNA的共价结合，阻止癌细胞增殖；(3)诱导凋亡EGCG通过抑制合成及化学
分解作用，破坏癌细胞生存环境，切断癌细胞的增殖途径，杀死癌细胞，即诱导癌细胞凋亡；
(4)增强免疫，对抗辐射EGCG能清除人体内的自由基。延缓衰老，增强机体非特异性免
疫能力。能明显消除放、化疗的白细胞减少症，具有很强的升白作用。 (5)兴奋中枢神 经EGCG能兴奋中枢神经，消除疲劳，恢复精神。并有神奇镇痛作用，其与黄酮可共同减轻 或消除放、化疗后出现的恶心、呕吐、食欲不振、腹泻等不良反应。
二、 EGCG的生物学活性和药理作用
黄垸醇类易被氧化为相应的0-醌类，二者可作为氢受体和氢供体。在黄烷醇的结构中， 5位和7位二羟基团和1位氧能使6位和8位碳原子产生强烈的亲核性，C-0或C-C骨架的形 成可使黄烷醇发生氧化聚合。EGCG对金属离子、生物碱和生物大分子，如脂类、碳氢化合物、 蛋白质和核酸有高度的亲和力。这是EGCG多种作用的结构基础。
EGCG有高于VITC、 E的强烈抗氧化、清除自由基的作用，主要通过以下四个机制
因EGCG具有"CATECHOL"结构，从而是很强的金属离子合剂，能结合并降低在Fenton 和Haber weiss反应中产生反应氧自由基所必须的游离铁和铁离子；
EGCG是超氧阴离子自由基和羟自由基很强的捕获剂这两种自由基引起DNA和其它细胞内 分子的损伤及脂质过氧化反应；
反应氧化自由基能操作DNA，改变基因表达，在肿瘤发生中起重要作用。黄烷醇类能与 过氧自由基发生反应，从而终止脂质过氧化链反应；
增强谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酯还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶的活性。
EGCG能诱导肿瘤细胞凋亡。谢冰芬等用流式细胞术发现EGCG可使鼻咽癌CNE2细胞停滞 于Gl期，并诱导其凋亡。另有学者发现EGCG诱导人肺癌细胞PC-9停滞于G2-M期，诱导molt4B 人淋巴细胞性白血病细胞的凋亡。EGCG中的咖啡因对不同的肿瘤细胞凋亡有双向性的作用。 EGCG也能诱导细胞凋亡。
肿瘤的形成是多因素、多阶段、多基因突变的过程。已知有许多化学致癌物及物理因素 能诱发和促进肿瘤的形成。人们发现EGCG对多种肿瘤形成的各个阶段都有预防和抑制作用。在大量动物模型中，EGCG不仅可抑制各种致癌物的致癌的发生率，还可降低已形成肿瘤的大 小、数目及其侵袭和转移。
另外，EGCG还有阻止亚硝基化反应、抗突变、放射防护、抑菌、提高免疫力、抗老化、 降压、降脂、抗菌素血栓和体外杀精等作用。刘示潮等证实经营提取物对DNA拓朴异构酶II、 DNA引物酶、多聚酶a复合体有抑制作用，与其抗肿瘤作用有密切关系。
三、 EGCG防癌作用的分子机制
EGCG防癌作用目前的研究进展有增强抗氧化酶(谷胱肽过氧化物酶、过氧化氢酶和醌 还原酶)和II相酶(如光胱甘肽-S-转移酶)的活性；抑制放射线或TPA诱导的上皮鸟氨酸脱羧
酶(ODC)和环氧化酶；抑制蛋白激酶C和细胞增殖；抗炎活性和加强细胞间和缝隙连接等；抑
制上皮生长因子(EGF)与其受体的相互作用，抑制肿瘤细胞的核苷转运，阻断外源性核苷对于 代谢药的抵消作用，增强阿糖胞苷、氨甲喋呤对肿瘤细胞的杀伤作用，另外，最近还有报道 EGCG还能强烈抑制端粒酶的活性，引起肿瘤细胞端粒的縮短、染色体的改变和对与细胞寿命 相关的B半乳糖苷酶表达的抑制。
四、 EGCG抑制——氧化氮合成酶(N0S)的诱导
亚硝酸盐能引起亚硝基化，是腌制食品中的致癌物。哺乳动物也能产生内源性的亚硝酸 盐。N0在体内由L—精氨酸在NAPDH和氧原子参与下经N0S催化合成。分子克隆及序列分析 示N0S至少存在3种异构体I和III异构体由Ca2+钙调素激活，产生生理条件下的低水平 的N0。它有广泛的生物学效应。II异构体即IN0S(诱导性N0合成酶)， 一旦产生就能长期激 活，持续产生高浓度的NO。后者在体外使脱氧核苷酸和碱基发生脱氧基，在体内是致突变的。 胞内高浓度的NO导致基因毒性的机制是N0与氧原子反应形成N02，再聚合为N204，并在 水中自发歧化为硝酸盐与亚硝酸盐。硝酸盐在体内也能还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐与食物中 氨基酸或酰胺反应生成致癌物N亚硝酸盐复合物，直接对DNA碱基亚硝基化而脱氨基、DNA 链的断裂和过氧化亚硝酸盐和/或羟自由基的形成而氧化DNA。
EGCG是目前第一个同时抑制INOS基因的表达和酶活性的复合物。EGCG以浓度依赖关系 特异地抑制INOSmRNA的表达。EGCG对激活NFkB的信号传导通路的主要作用机制为
抑制LPS等与其受体的相互作用(sealingeffeet);
清除ROLs;
抑制蛋白激酶。而且，EGCG还可阻断信号诱导lkB的磷酸化；阻断N亚硝酸盐复合物、 过氧化亚硝酸或羟自由基的形成。另外，N0D的结构在氨基端相似于细胞色素P450氧化酶， 在羧基端相似于细胞色素P450的各功能，所以它能抑制NOS的酶活性。
五、 EGCG的封闭作用EGCG抑制肿瘤的促进剂TPA激活PKC是通过以下三方面抑制TPA与受体的作用；EGCG 与磷脂双分子层相互作用；EGCG阻碍一三磷酸腺苷和TPA结合到PKC的能力。
绿茶提取物、EGCG抑制肿瘤促进剂TELEOCIDIN对PKC的激活。EGCG抑制依赖雌激素的 乳腺癌MCF-7细胞中雌激素与其受体的作用。KOMORI等把绿茶提取物、EGCG阻止肿瘤促进剂、 激素、生长因子与受体的相互作用，称为Sealingeffect。
六、 EGCG药理作用和药用价值
兴奋作用EGCG兴奋提神作用是人们所熟知的，主要是咖啡碱具有兴奋中枢神经系统的 功效。因此喝茶可以帮助人们消除疲劳，振奋精神，增进思维，提高工作效率。
利尿作用EGCG中的咖啡碱和茶碱都具有利尿作用。利用红茶糖水的利尿解毒作用治疗 黄胆性肝炎就是一例。
强心解痉作用由于EGCG中的咖啡碱具有强心解痉、松弛平滑的功效，因此在解除支气 管痉挛、促进血液循环，治疗心肌梗塞中可作为一种良好的辅助药物。
增强毛细血管的作用茶多酚中的EGCG，具有增强微血管壁韧性的作用。在有些国家， 己作为临床治疗药物使用。 '
活血化瘀抑制动脉硬化这主要是茶多酚中的EGCG.和维生素C具有这种功效，因此，EGCG 防治动脉硬化的效果更好。
抗菌、抑菌作用试验表明，EGCG的水提取液对于伤寒、痢疾、副痢疾、金黄色葡萄球 菌、伤寒沙门氏杆菌、霍乱杆菌和肠膜状明串球菌等均有抑制作用。
抗辐射作用EGCG中具有防辐射的有效成份主要是脂多糖、维生素C和某些氨基酸，因 此EGCG的水提取物片剂(速溶茶片)可以说是一种防辐射的良好复方。
抑制癌细胞的作用IO类黄酮物质有不同程度的体外抗癌作用，药效作用较强的有三种 牡荆碱、桑色素和D-儿茶素。EGCG的药理作用很值得进一步深入研究。
七、 EGCG对肿瘤启动剂诱导的和细胞转化的抑制
近来，人们发现丝/苏氨酸家族的丝原激活蛋白激酶(MAPKs)是蛋白激酶级联反应的中间 体，是细胞内重要的激酶系统。MAPK包括胞外信号调节蛋白激酶(ERKs)和C一JunN —未端激 酶。ERKs主要由生长因子激活，部分也被细胞应激信号和激活。部分也被细胞应激信号激活。 JNKs即应激激活蛋白激酶(SAPK)。正常情况下，核内无F0S，仅有少量JUN。 FOS和JUN均属 即早基因。在GFs(生长因子)刺激后15分钟即呈现F0SmRNA增高。30分钟达到高峰，迅速合 成F0S。 JUN是由331个氨基酸组成，可由PKC催化其SER63、 SER73磷酸化而激活。活化的 JUN和新生成的FOS聚合为杂二聚体(即AP-1--。 FOS和JUN均含有"LZ"(亮氨酸拉链)保守 序列，可结合于TRE，促进许多基因的转录。EGCG或茶黄素对ERKL或ERK2无抑制作用，而是在SER73位点抑制C-JUN蛋白的磷酸化。 EGCG还抑制JNK的活性。因此，EGCG抑制了肿瘤促进剂诱导的AP-1活性的升髙。有学者用 儿茶素3种同系物对TPA诱导鼠成纤维细胞的转化的抑制很弱。因此，EGCG、茶黄素，而不 是咖啡因，抑制了TPA-或EGF-诱导的细胞转化。
八、 EGCG的药代动力学
1997年，CHENL.S.等首次报道了 EGCG、 EGC和EC在啮齿动物中的吸收、分布、代谢、 排泄过程。尽管EGCG、 EGC、 EC化学结构相似，但药代动力学却不尽相同。它们在血浆、组 织中的水平采用HPLC测定。静脉注射DGT(去咖啡因的绿茶)25MG/KG后，EGCG、 EGC和EC的 血浆浓度符合二室模型。它们的B相半衰(T1/2B)分别是212、 45和41MIN，清除率(CL)分别 是2. 0、 7. 0和13. 9ML細/KG，表现分布容积(VD)分别为1. 5、 2. 1和3. 6DL/KG。 EGC和EC 和K12和K21(中央室与周围室间的分布速率常数)相似，但EGCG的K12比K21高3倍，提示 EGCG更易分布于周围室。EGCG的T1/2B较长，CL较小，提示EGCG比EGC和EC在体内能停 留在更长时间。当用EGCG静注时，T1/2B为135MIN,清除率为72 5ML/MIN/KG， VD为 22. 5DL/KG，提示在DGT中有其他物质影响EGCG的浓度和排泄。DGT灌胃给药(200ML/KG)时， EGCG、 EGC和EC的生物利用度分别为13.7%、 31.2%、 0.1%。静脉注射DGT(25MG/KG)后，EGCG 在小肠组织中浓度最高，其半衰期(Tl/2)为175MIN。 EGC和EC在肾中浓度最高，T1/2分别 为29MIN和28MIN。 EGCG经加入饮水中给药比灌胃给药吸收更好。去咖啡因的绿茶提取物中 的EGCG的吸收速率常数(KD)比纯EGCG高3. 6倍。基于每单位EGCG产生的AUC和CMAX， DGT 似乎比纯EGCG更有效。值得一提的是YANG发现把1. 5G、 3. 0G、 4. 5G去咖啡因的绿茶溶于 500ML水后给人饮用，随剂量由1. 5G升到3. 0G时，EGCG的血浆C區X也增加2. 7 — 3. 4倍， 但当剂量增至4. 5G时CMAX却不能明显增加。这被称为饱和现象。
九、 EGCG的八大功能
(1) 耙向攻击作用绿金子中的EGCG、黄酮等抗癌成分，能自动识别、黏附、包裹癌 细胞，直接进入其心脏，杀伤癌细胞。
(2) 拦截转移作用绿金子中的有效组分黄酮，可消除细胞对血管内壁的黏附作用， 拦截癌细胞扩散。
(3) 阻断分裂作用癌细胞通过不断的有丝分裂得以迅速增殖。绿金子中黄酮化合物 能诱导癌细胞拓朴异构酶n依赖型DNA断裂，直接阻断有丝分裂，有效阻止癌细胞增殖。
(4) 抑制合成作用EGCG通过阻断癌细胞有丝分裂，影响癌细胞DNA、 RNA及蛋白质的 合成，使癌细胞无法繁殖，失去活性，从而抑制肿瘤生长。
(5) 诱导凋亡作用绿金子内含的TP-EGCG(诱导癌细胞凋亡反应因子)，能攻击癌细胞的细胞核(心脏)，诱导癌细胞凋亡反应。
(6) 清除毒质作用EGCG能显著激活吞噬细胞，将坏死癌细胞及致癌物质吞噬清除， 排出体外。
(7) 防止感染作用EGCG能够促进白细胞增生，防止病菌感染，强化放、化疗作用， 减轻放、化疗的毒副反应，降低肿瘤病人的感染率。
(8) 增强免疫作用EGCG能够显著激活具有抗癌作用的特异性T细胞，促使T细胞浸 润肿瘤块；诱导免疫细胞产生数十种调节肿瘤免疫的细胞因子(如白细胞介素、肿瘤坏死因子、 干扰素等)，充分调动人体自身免疫功能，杀伤并清除癌细胞。
微乳液首先由schulman等发现并命名。微乳是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂按 适当比例混和，自发形成的各向同性、透明、热力学稳定的分散体系。微乳由于除了具有乳 剂的一般特性之外，还具有粒径小、透明、稳定等特殊优点，在药物制剂及临床方面的应用 也日益广泛。
微乳是由水相，油相，表面活性剂与助表面活性剂在适当比例自发形成的一种透明或半 透明的，低粘度的，各向同性且热力学稳定的油水混合系统。由表面活性剂与助表面活性剂 共同起稳定作用。助表面活性剂通常为短链醇、氛或其他较弱的两性化合物。微乳液液滴可 以是分散在水中的油溶胀粒子(0 / W微乳液)也可以是分散在油中的水溶胀粒子(W/0)微乳液) 或是一种无序的随机结构。
微乳作为药物载体具有极大的应用潜力。主要具有以下几个优点(l)呈具各向同性的透 明液体、热力学稳定，且可以过滤，易于制备和保存；(2)可同时增溶不同脂溶性的药物；(3) 粘度低，注射时不会引起疼痛；(4)药物分散性好，利于吸收、可提高药物的生物利用度；(5) 对易于水解的药物制成油包水型微乳可起到保护作用；(6)可延长水溶性药物的释药时间。 微乳注射剂除具有一般注射剂的特点外，还有一定的缓释作用。水溶性药物制成w/0型微乳 注射液，油溶性药物可制成0/w型微乳注射剂。注射后，药物需经过微乳内部向介质再分配 的过程，延长药物的释放，提高了药物生物利用度。微乳注射液的刺激性小，可减轻注射时 的疼痛。微乳是一种很理想的药物释放体系。它具有吸收迅速、完全，能增强疗效，减少毒 副作用等优点。

发明内容
本发明目的在于提供一种稳定性好、质量高、疗效显著、不良反应小的含有EGCG的微 乳注射剂及其制备方法，应用该方法制得的一种含有EGCG的微乳注射剂同时具有靶向性。 本发明的一种含有EGCG的微乳注射剂由下述组分组成EGCG 0.1% 大豆油 5%
助乳化剂 0.2%
维生素E 0.8%
卵磷脂 1.2%
甘油 2.5%
注射用水加至 100ml
本发明的一种含有EGCG的微乳注射剂是通过以下技术方案实现的
(1) 将卵磷脂、甘油分散于100ml水中成水相；
(2) EGCG、大豆油、助乳化剂及维生素E组成油相B;
(3) 两相分别预热至7(TC;
(4) 将油相缓慢加入水相，高速搅拌后制得初乳；
(5) 将初乳过高压乳匀机，先调解二步阀150 180kg/cm 过3 — 5次，再调节一级阀至 总压力为520 600 kg/cm2,过10 — 15次，至粒经符合要求；
(6) 将匀化后的乳剂过G4垂熔漏斗，灌装、冲氮、熔封，灭菌。
本发明得到的一种含有EGCG的微乳注射剂具有方法简单、稳定性好、质量高、具有缓 控释特点。
实施例l:规格100瓶
(1) 将卵磷脂、甘油分散于100ml水中成水相；
(2) EGCG、大豆油、助乳化剂及维生素E组成油相B;
(3) 两相分别预热至7(TC;
(4) 将油相缓慢加入水相，高速搅拌后制得初乳；
(5) 将初乳过高压乳匀机，先调解二步阀150 180kg/cm 过3 — 5次，再调节一级阀至 总压力为520 600 kg/cm2,过10—15次，至粒经符合要求；
(6) 将匀化后的乳剂过G4垂熔漏斗，灌装、冲氮、熔封，灭菌。 实施例2:规格1000瓶
(1) 将卵磷脂、甘油分散于1000ml水中成水相；
(2) EGCG、大豆油、助乳化剂及维生素E组成油相B;(3) 两相分别预热至70'C;
(4) 将油相缓慢加入水相，高速搅拌后制得初乳；
(5) 将初乳过高压乳匀机，先调解二步阀150 180kg/ci^,过3 — 5次，再调节一级阀至 总压力为520 600 kg/cm夂过10—15次，至粒经符合要求；
(6) 将匀化后的乳剂过G4垂熔漏斗，灌装、冲氮、熔封，灭菌。
权利要求
1. 一种含有EGCG的微乳注射剂；EGCG为其特征在于由EGCG(0.001～10％)和其它赋形剂组成的注射剂。
2. 根据权利要求l，EGCG大豆油助乳化剂维生素E卵磷脂甘油注射用水加至
3. 根据权利要求l，EGCG大豆油助乳化剂维生素E卵磷脂甘油注射用水加至
4. 根据权利要求l，EGCG大豆油 助乳化剂 维生素E 卵磷脂<!>H EGCG (0.001-10%)和其它赋形剂组成的注射剂。 一种含有EGCG的微乳注射剂由下述组分组成: 0.001~腦 0.1~10% 0.01~5% 0.01~5% 0.01~10% 0.1 20% 100ml一种含有EGCG的微乳注射剂由下述组分组成: 0.01% 5% 0.2% 0.8% 1.2% 2.5% 100ml一种含有EGCG的微乳注射剂由下述组分组成: 0.1% 5% 0.2% 0.8% 1.2%甘油 2.5%注射用水加至 100ml
5.根据权利要求l， 一种含有EGCG的微乳注射剂由下述组分组成:EGCG 1%大豆油 8%助乳化剂 0.5%维生素E 0.8%卵磷脂 1.5%甘油 5%注射用水加至 100ml
6.根据权利要求l， 一种含有EGCG的微乳注射剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 将卵磷脂、甘油分散于100ml水中成水相；(2) EGCG、大豆油、助乳化剂及维生素E组成油相B;(3) 两相分别预热至7(TC;(4) 将油相缓慢加入水相，高速搅拌后制得初乳；(5) 将初乳过高压乳匀机，先调解二步阀150 180kg/cn^,过3 — 5次，再调节一级阀至 总压力为520 600 kg/cm2,过10—15次，至粒经符合要求；(6) 将匀化后的乳剂过G4垂熔漏斗，灌装、冲氮、熔封，灭菌。
全文摘要
本发明公开了一种含有EGCG的微乳注射剂；EGCG见右结构式，其特征在于EGCG是由绿茶提取的有效成分制成，同时公开了该制剂的制备方法。应用该方法制得的一种含有EGCG的微乳注射剂制备方法简单、稳定性好、靶向性、质量高、具有缓控释特点。
文档编号A61K9/107GK101422455SQ20071017915
公开日2009年5月6日 申请日期2007年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者王翰斌 申请人:北京琥珀光华医药科技开发有限公司