专利名称：用于癌症的先天性免疫方法的缀合物的制作方法
用子癌症的先天性免疫方法的缀合物
本发明涉及新型多功能化合物，其用于治疗有此需要的病人的疾
病0
免疫系统能够特异或非特异地应答抗原(包括自体抗原和外源抗 原)。然而，在某些情况下免疫系统不能识别并应答诸如病原体这些 结构，例如外源性病原细胞、肿瘤细胞或者感染原。在另外一些情况 下，免疫应答未能充分局限于某组织或器官，并因而可能在该病人中 引起严重的不良副作用。
因此，本发明的一个目的是提供新型化合物，其能够在病人体内 诱导并靶向针对特定的预定医学靶标的免疫应答。此外，本发明的目 的是提供能够将生物活性结构靶向至肿瘤细胞的新型多功能化合物。
发明概述
该目的是由根据本发明的化合物实现的，所述化合物包含可搮作 地连接至少一个效应体的至少一个结合体。该效应体是能在宿主体内 诱导、控制、介导或以其他方式参与免疫应答的任何物质。具体来说， 该效应体诱导免疫应答，尤其是先天性免疫系统的免疫应答。
术语"效应体"是指在宿主体内诱导、调节、控制或以其他方式 参与先天性或获得性免疫系统的任意分子结构。具体来说，该效应体
因此，本发明的效应体可以是宿主体内免疫细胞的化学引诱物和/或先 天性或获得性免疫系统的免疫刺激剂。因为其也能激活或增强免疫系 统，所以它们还表现出佐剂的特性。尤其是，本发明的效应体参与介 导细胞介导的细胞毒性作用。该效应体的一项重要功能是参与抗体诱
导的细胞的细胞毒性作用(ADCC)。
本发明的化合物所引起或调节的免疫应答是由宿主免疫系统通过任意元件或化合物表现出来的任何类型的反应。免疫系统的元件包括 参与获得性或先天性免疫系统的化合物和细胞。典型的免疫系统化合
物是细胞因子，例如白细胞介素、TNF或干扰素或抗体。典型的免疫 细胞是白细胞，例如淋巴细胞，如T细胞和C细胞、巨噬细胞或嗜中 性粒细胞或树突细胞。
选择PRR (病原体识别受体)的激活剂作为效应体具有优势。本
发明的一个特定实施方案中，所述新型多功能化合物包含至少两个效 应体，其中一个效应体是免疫刺激剂而另一个效应体是抗体的Fc结构域。
效应体可以包含病原体相关的分子模式(PAMPS)，后者由PRR 识别并激活PRR使其于先天性免疫系统中表现出其至少一项生物学功 能。
PRR是先天性免疫系统中的受体。先天性免疫系统是一种宿主在 暴露于抗原后立即或数小时内所采用的，对抗原非特异的防御机制。 与适应性免疫不同，先天性免疫不识别每一个可能的抗原。相反，它 经设计以识别存在于很多不同病原体中的 一 些高度保守的结构。所识 别的结构是病原体相关的分子模式和例如包括来自革兰氏阴性细胞细 胞壁的LPS、肽聚糖、来自革兰氏阳性细胞细胞壁的脂磷壁酸、甘露 糖(微生物糖脂和糖蛋白中常见，人的糖脂和糖蛋白中少见)、岩藻 糖、N-乙酰葡萄糖胺、细菌MA、细菌蛋白质中发现的N-甲酰甲疏氨 酸、来自病毒的双链RM以及来自真菌细胞壁的葡聚糖。
多数机体防御细胞都具有用于这些常见病原体相关的分子模式的 模式识别受体。因此，针对侵入的病原体会立即发生应答。血液中行 使调理素功能和启动补体途径的 一 系列可溶性模式识别受体也能够识 别病原体相关的分子模式。据信先天性免疫系统识别总计大约103种 分子模式。
如下文所定义，本发明的PRR包括表面PRR或可溶性PRR。细胞 表面PRR又可再分为功能不同的两类细胞内吞模式识别受体和信号 转导模式识别受体。细胞内吞模式识别受体见于免疫细胞表面，并促进病原体对吞噬细胞的附着及其随后的吞入和消除。
此外本发明靶向的PRR包括甘露糖受体(MR)、.曱酰肽受体(FPR)、 toll样受体(TLR ) 、 CD14以及核苷酸结合寡聚结构域蛋白(NOD )等。 配体对这些受体的结合也促进胞内调节分子(免疫调节信号)的合成 和分泌，例如对启动先天性和适应性免疫至关重要的细胞因子。
细胞内吞PRR包括甘露糖受体(MR)，其结合糖蛋白和糖脂的末 端甘露糖和岩藻糖基团(人的糖蛋白和糖脂一般具有末端N-乙酰葡萄 糖胺和唾液酸基团)，然而清道夫受体代表另外一类细胞内吞PRR， 其结合细菌细胞壁成分，例如LPS、肽聚糖和磷壁酸。也存在用于其 他类型微生物的某些成分的清道夫受体。
MR见于例如树突细胞的表面，并且是属于C-型凝集素超家族的内 吞型和嗜菌型受体。该受体参与先天性和适应性免疫应答，并且具有 许多功能。MR特别负责在克疫应答早期对病原体的内吞捕获。MR结合 多种病原体(例如细菌、真菌、寄生虫以及病毒)上的糖部分，因此
将其视为模式识别受体(PRR)。另外，MR结合内源分子，并最初将 其描述为在肺泡巨噬细胞内的一种结合溶酶体糖苷酶的膜相关成分。 自其鉴定起，已经描述了很多其他的内源配体，包括激素、酶、细胞 膜、胞外基质组分以及正常的和肿瘤粘液素。MR优先表达在骨髓系免 疫细胞上，尤其是树突细胞(DC)亚群和组织巨噬细胞。除免疫细胞 外，特化的内皮细胞也呈MR阳性。
TLR在先天性免疫和适应性免疫的诱导中起主要作用。不同类型 细胞会出现不同组合的TLR，它们可能成对存在。例如TLR-1/TLR-2 对唯一地结合细菌脂肽和寄生虫的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白、 TLR-2/TL6对结合革兰氏阳性细胞细胞壁的脂磷壁酸和真菌的酵母聚 糖；TLR-2作用于结合肽聚糖片断(糖肽)或TLR-4/TLR-4对结合革 兰氏阴性细胞细胞壁的脂多糖。通过配体结合激活TLR， TLR向细胞核 内传递信号，诱导编码称为细胞因子的胞内调节分子(例如TNF-ct或 白细胞介素)合成的基因的表达。这些细胞因子随后结合其他防御细 胞上的细胞因子受体。CD14见于单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞，并提高TLR-4 对LPS和肽聚糖的应答能力。这些分子与CD14和TLR-4相互作用导 致例如IL-1、 IL-6、 IL-8、 TNF-ot和PAF的促炎症细胞因子的合成和 分泌增加。然后这些细胞因子结合靶细胞上的细胞因子受体并启动炎 症反应，激活补体途径和凝血途径。
nod(核普酸结合寡聚结构域)蛋白，包括N0D1和N0D2，是使得胞 内识别肽聚糖成分的胞内蛋白质。N0D1识别包含胞壁酰二肽NAG-nam- y -d-谷氨酰-内消旋二氨基庚二酸的肽聚糖，这是普通革兰氏阴 性细菌和仅少量革兰氏阳性细菌的肽聚糖单体的部分。N0D2识别包含 几乎存在于所有细菌中的胞壁酰二肽NAG - MM-L-丙氨酰-异谷氨酰 胺的肽聚糖。
当巨嗟细胞吞噬整个细菌或细菌生长过程中释放的肽聚糖片段 时，肽聚糖被分解为胞壁酰二肽。胞壁酰二肽与N0D1或N0D2的结合 导致编码促炎症细胞因子的基因的激活，其方式与细胞表面toll样受 体类似。
甲酰肽受体
本发明的一个特别优选实施方案中，所述结合体可操作地连接至 激活甲酰肽受体(FPR)的效应体。此类受体也属于信号转导PRR种类。 FPR是主要在嗜中性粒细胞及巨噬细胞系或吞噬细胞系的一些细胞中 表达的g蛋白偶联受体。这些受体最为熟知的配体是包含n-甲酰甲硫 氨酸残基的肽或蛋白片断，此残基是原核生物来源蛋白质的一个标志。 这样这些肽段做为细菌感染部位的有效的免疫学归巢信号(homing signal),参与嗜中性粒细胞应答和激活的多个阶段的信号转导，包 括趋化作用、刺激免疫信号转导分子的产生和释放(例如白细胞介素、 细胞因子等)、以及脱粒作用 一种包括能够介导外源物质或病原体 消除的化学物质(例如过氧化氢和其他活性氧基团物质)和酶物质(例 如弹性蛋白酶和其他消化酶)的产生和释放的胞内过程。
在人中已鉴定出三种相关的FPR家族成员同名的甲酰肽受体(FPR)、以及另外两个受体FPRL1和FPRL2。 FPRL1和FPRL2因序 列同源与FPR相关，但似乎功能不同。有提议认为脂氧素A4和血清淀 粉样蛋白A (SAA)是FPRLlR的天然配体(Takanoetal.， J Exp. Med. 185:1693-1704 (1997))。 FPR的天然配体是甲酰-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLF)。
甲酰肽受体(FPR)介导的细胞应答包括细胞极化和迁移、由呼吸 爆发氧化酶生成超氧化物氧自由基、脱粒作用和多种不同降解酶的释 放、以及吞噬作用。根据本发明，所迷效应体与FPR相互作用并与其 诱导至少一项上述细胞应答。
除细胞表面模式识别受体以外，本发明的多功能化合物包含至少 一个与分泌的模式识别受体在功能上相互作用的结合体。这些可溶性 PRR结合病原体并使它们能被补体途径和吞噬细胞识别。例如，甘露 聚糖结合凝集素由肝脏合成并释放至血流中，在那里它结合细菌、酵 母、某些病毒和某些寄生虫上的糖类。这随后激活凝激素补体途径并 导致一种促进微生物与吞噬细胞附着的分子C3b的产生。
定义
本发明所用术语模式识别受体(PRR)指由免疫系统的细胞表达的 一类蛋白质。PRR由病原体相关分子模式(PAMPs)激活。病原体模式 识别受体(PRR)通常例如存在于病原体表面的或在病原体或线粒体降 解过程中演化的识别常见结构和分子基序，并有助于先天性免疫系统 的诱导。例如，像FPR和TLR —样，甘露糖受体被视为一种这样的PRR。 "病原体相关分子模式，，(PAMP)是一向存在于病原体或在病原 体或线粒体降解过程中演化的小分子序列。它们由PRR识别，例如TLR 或FPR或MR。脂多糖(LPS)可视为典型的PAMP。其他PAMP包括来自 革兰氏阳性细菌的脂磷壁酸、肽聚糖和通常与病毒关联的核酸变体， 例如双链RNA ( dsRM )(更多实例见下文)。
术语"病原体"优选指能够对宿主造成危害或期望在宿主体内消 除的任何生物、细胞或结构。病原体的实例是细菌、病毒、真菌、寄生虫、肿瘤细胞。就本发明来说，也将因美容或其他原因而期望消除
的结构^L为病原体。
本发明所用术语"结合体，，优选指与二级分子结构互相作用/结合 的任何分子结构。术语"二级分子结构"指能够定量或定性地从靶标 中区分宿主结构的任何结构，例如过表达的肿瘤标志物也存在于宿主 细胞中，但量更低。 一级分子结构和二级分子结构之间的相互作用包 括任何类型的化学或物理相互作用，包括共价键和非共价键，例如氢 键、范德华力或疏水相互作用。优选实例于表l中列出。
选择性结合癌细胞或肿瘤细胞意指与胂瘤细胞或其表面的标志物 形成复合物的频率统计上高于与典型非癌细胞形成复合体的频率，通 过典型结合测定法例如免疫染色、ELISA、凝胶阻滞分析、Biacore或 类似方法测定。
所述二级分子结构优选为标志物。"标志物"是对独特的生理或 病理功能或病原体来说足够特异，因而使其能够从其他宿主结构中被 辨识和/或与区分开的任何结构。标志物的特异性源于其在所述结构或 细胞单位内或上或邻近的选择性表达或增强表达。因此，术语特异性 包含定性和/或定量方面。
多数优选标志物是对独特的细胞单位特异的，例如肿瘤细胞表面 抗原、肿瘤的间质成分、胞内抗原或胞内抗原。术语"细胞单位"指 包括细胞、细胞类型、细胞聚集或组织及其部分的任何细胞结构。
本发明的结合体是天然或合成来源的，是修饰的或未修饰的。本 发明的结合体包括小分子、生物聚合物或寡聚物，例如蛋白质、肽、 微生物蛋白质和模拟物、肽模拟物、修饰的或未修饰的氨基酸或多核 苷酸和寡核苷酸，包括RNAi、以及上述物质的片段、衍生物、类似物、 嵌合体或多聚体。
结合体的其他实例包括通过合成产生的小分子。术语"小分子" 优选指分子量优选为500 Da以下的生物活性分子。小分子为除肽、蛋 白质、DNA或RNA以外的分子。
二级分子结构功能可为医学靶标。术语"医学靶标"指具备适合成为药物或药物候选物的工作点或出发点的(实际的或至少假定的) 潜能的任何分子或细胞结构，以诊断、预防、减轻或治疗宿主(优选 为人类患者)的疾病。靶标分子的实例是受体、酶和离子通道。本领
域公知许多具有已证实药理学相关性的这类乾标分子。实例列于表2 中。
术语"效应体，，优选指诱导、控制获得性/适应性或先天性免疫系 统的免疫应答或以其他方式作为的其中一部分的任何分子结构。本发 明的效应体包括小分子、糖类或多糖、生物聚合物或寡聚物、例如蛋 白质、肽、微生物蛋白质和模拟物、肽模拟物、修饰的或未修饰的氨 基酸或多核苷酸和寡核苷酸及其片段、衍生物、类似物、嵌合体和聚 合体。效应体分子能够结合受体，尽管并不必须结合于天然配体的结 合部位。效应体单独使用时能够调节信号转导，即可作为替代配体或 在天然配体存在的情况下改变信号转导。
术语效应体也包括提高或增强宿主免疫的化合物及其混合物。常 把这种化合物定义为佐剂。具体来说，佐剂增强宿主体内针对抗原的 抗体的产生。
本发明的一个优选实施方案中，所述效应体包括不同于宿主(优 选为哺乳动物)自身抗原的任何分子结构。因此，本发明的效应体可 以是非哺乳动物结构，例如在健康哺乳动物中不存在的衍生自细菌和 病毒或合成来源的蛋白质/肽、核苷和糖及其片段、衍生物或修饰物。 可能的效应体包括所有革兰氏阴性和阳性细菌共有的脂多糖和磷壁 酸、细菌而非哺乳动物DNA特有的非甲基化CpG基序、RM病毒的特 征结构双链RNA以及酵母细胞壁中的保守元件甘露聚糖。其他实例是 甲酰肽。效应体的一个重要功能是免疫细胞激活。
效应体是PRR的优选激活剂，即它们诱导或以其他方式增强该受 体的信号转导活性。
效应体尤其包括对先天性免疫系统具有刺激、调节或激活作用的 合成小分子，例:ft口口米峻全淋4匕合物(比较Smith et al Pharmacother. 2003 Jul;4(7): 1105-19)。本发明的效应体可以是天然衍生的但优选合成产生的。重组技术视为一种合成生产方式。
本发明所用术语"先天性免疫系统"优选指生物的非适应性免疫。 先天性免疫的元件通常能区分外源抗原(病原体)和自身抗原。因此， 先天性免疫应答不对某一特殊抗原做出适应，而是在重复暴露于其之 后仍保持不变。与此相反，适应性(或获得性)免疫系统改进其对之 前遇到的抗原的效力。先天性免疫的元件是例如吞噬细胞(嗜中性粒 细胞、单核细胞和巨噬细胞)、释放炎症介质的细胞(嗜碱性粒细胞、
肥大细胞和嗜酸性粒细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、树突细胞(DC ) 和例如补体蛋白、急性期蛋白和细胞因子的分子。
先天性免疫系统的最重要的化合物是溶菌酶和化学引诱物(如细 胞因子或组胺)这样的化合物或补体蛋白。与先天性免疫系统最相关 的细胞包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞(包括中性粒细胞)、淋巴细胞 和NK细胞。这些细胞有效摧毁和除去病原体以及患病组织或细胞。
术语"连接体"优选指可操作地连接至少一个效应体和一个结合 体的任何结构。如本文所用，"可操作地连接"意指在pH、离子强度
和渗透势的生理条件下，效应体和结合体的多数实体彼此结合而且这 两个实体都能表现出其预期的功能。
如果连接体与效应体和结合体共价结合，其最小长度为一个共价 键，例如一个肽键。其他连接体包括多种化学连接和交联剂，后者包 括例如同源多功能或异源多功能交联剂、寡功能或异功能交联剂。连 接和交联可由本领域熟知的多种化合物的任何一种来实现，包括例如 活化的聚乙二醇、醛类、异氰酸酯、马来酰亚胺等。
术语"激活"当与细胞或受体(及其定量检测或定性评价)联合 使用时，优选指任何直接或间接免疫应答，包括例如渗透、脱粒、滚 动、趋化、吞噬、内吞、多种代谢或降解酶(如弹性蛋白酶)的表达 增加或活性提高、氧爆发、过氧化氢及其他高反应性的氧物质的产生 或释放、胞内钙流、细胞极化以及肌醇代谢和信号转导的变化。激活 的其他决定要素包括白三烯、补体、趋化因子、细胞因子、化学引诱 物因子、白细胞介素或干扰素的表达和产量增加。本领域技术人员公知用于检测这些活性的方法(参考例如
William E. Paul, Fundamental Immunology, Lippincott Williams and WUking Publishers. 1999; John E. Coligen et al. ， Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.， 1999.)
术语"模拟位(minetope)"和"肽模拟物"在本文中可交换使 用。化合物X的"模拟位"指以模拟X构象的其他化学结构取代对X 的功能活性必需的X的化学结构的化合物。肽模拟物的实例包括肽骨 架由一个或多个苯二氮分子取代的肽化合物(参考例如James, G. L. etal. (1993) Science 260: 1937-1942 )和"逆反(retro-inverso )，， 肽(参考属于Sisto的美国专利号4,522, 752 )。术语"模拟位"和 "肽模拟物"也指除天然氨基酸以外，在构象和功能上作为含肽化合 物中某种氨基酸的替代物而对该肽的功能不具有显著不利干扰的部件 (例如FPRL-1激活剂)。
氨基酸模拟物的实例包括D-氨基酸。以一种或多种D-氨基酸替代 的肽可通过公知的肽合成方法制备。其他替代物包括具有带功能基团 的变体侧链的氨基酸类似物，例如b-氰丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、 正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟基苯丙氨酸、5-羟色氨酸、 l-甲基组氨酸或3-甲基组氨酸。
如本文所用的化合物X的"类似物"优选指保留对X的功能活性 必需的X的化学结构，然而也含有不同于X的特定化学结构的化合物。 天然肽的类似物的实例是包含一个或多个非天然氨基酸的肽。术语"类 似物"也用来包括修饰的模拟位和/或肽模拟物、修饰的肽和多肽、以 及肽和多肽的等位基因变异体。因此肽的类似物会产生与原始肽基本 上同源的肽类似物。
术语"基本上同源"当与氨基酸序列联合使用时，优选指在序列 上基本上一致或相似，产生构象同源性并因此产出相似生物活性的序 列。该术语不意指这些序列的常见演化。
"基本上同源"序列一般在序列上至少50%,更优选至少80%相同，至少涵盖涉及所需活性的任何区域。最优选地，除末端以外不超
过5个残基不同。优选地，至少上述区域内的序列差异是以"保守修 饰"的形式。
一般为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同源性，就 最优比较来比对该序列(例如可在第一和第二个氨基酸或核酸序列的 一个或两个引入缺口用于最优比对，为了比较，可忽视非同源序列)。 在一个优选实施方案中，参考序列用以比较而比对的长度为该参考序 列长度的至少30%，优选至少40%，更优选至少50%，甚至更优选至少 60%,甚至更优选至少70°/。、 80%或90°/。(例如，当将第二序列与有例如 IOO个氨基酸残基的第一氨基酸序列比对时，至少比对至少30个，优 选至少40个，更优选至少50个，甚至更优选至少60个，甚至更优选 至少70、 80、 90个氨基酸残基)。
如本文中所用"细胞表面受体"优选指出现在细胞表面上的，与 胞外环境互相作用的分子。这种分子常以最终调节特定启动子转录， 导致特定基因转录的方式向胞内传输或转换环境相关信息。
术语"微生物蛋白质"优选指优选稳定并且耐热、耐pH和耐蛋白 降解的小蛋白。它们一般不超过50个氨基酸。它们具有基于分子内部 二疏键的明确结构。
如本文中所用术语ADCC (抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用) 指抗体通过包被靶细胞使其易受免疫细胞攻击的免疫应答。目前已越 来越多地认识到ADCC介导的细胞毒性作用是利用单克隆抗体的许多 不同治疗中的重要步骤。
术语抗体包括参与外源抗原识别和中和的任何免疫球蛋白或其部 分和片段。抗体识别对其靶标是唯一的特定抗原。抗体的Fc片段在 ADCC中发挥重要作用，因为免疫细胞识别Fc片段。这一点在本发明 的一个实施方案中体现为多功能化合物的效应体包含一个Fc片段。
术语"优选地"意在为本发明提出备选而不是以任何方式限制或 局限本发明。发明详述
如上概述，本发明的多功能化合物包含至少 一个结合体和至少一 个效应体。
本发明的效应体的实例是寡肽和多肽、肽(修饰的、合成的或天
然的)、甲酰化的肽(尤其是fM肽)、来自细菌细胞壁的肽聚糖、原 核细胞、原核细胞溶解产物、或来自含有线粒体衍生的N-甲酰肽的真 核细胞的溶解产物、酰化脂肽、例如二酰化支原体脂肽或三酰化细菌 脂肽和三酰脂肽(Pam3CSSNA)、含有去胞壁酰肽的二氨基庚二酸(y -D-谷氨酰-内消旋-DAP; iE-DAP)、以及胞壁酰二肽(MDP)、来自细菌 的蛋白质、细菌凝集素/黏附素、例如具表面黏附功能的鼠伤寒沙门氏 菌(S. typhimurium)的菌毛亚单位(CsgA )或牙龈吟淋单胞菌
(Porphyromonas gingivalis )的菌毛、细菌的鞭毛蛋白、细菌的N-乙酰化的延长因子、例如大肠杆菌的Tu (EF-Tu)、细菌如肺炎克雷伯 氏菌(K. pneumoniae)的外部膜蛋白(Kp0mpA)、抗体的蛋白、抗体的 Fc部分、抗原的蛋白、中和抗体的抗原、诱导补体级联的抗原、寡核 苷酸、来自细菌的含CpG的DNA、病毒的双链RNA 、寡糖或多糖、含 甘露糖的寡糖或多糖、来自酵母和细菌细胞壁的甘露聚糖和/或甘露糖 残基(岩藻糖)、来自蠕虫的乳-N-岩藻戊糖III
(lacto-N-fucopentaose III， LNFPIII )、修饰的寡糖或多糖、来 自细菌的LPS、病原体上的糖脂样分子、咪唑喹啉类、磷酸胆碱。
根据本发明的效应体的其他实例是来自适应性(获得性)免疫系 统的化合物。这些实例包括抗体及其片段、尤其是抗体和与其同源的 蛋白质或肽的Fc片段、结合Fc-y受体的蛋白质或肽、结合Fc-y受 体的肽模拟物和结合Fc-y受体的小分子、促进适应性免疫应答的抗 原。
在本发明的某优选方面，所述新型化合物包含诱导或支持ADCC 的效应体。优选地，该效应体结合诸如天然杀伤细胞或巨噬细胞这样 的免疫效应体细胞表面的Fc受体(Fc y Rs )，导致靶细胞的吞噬作用 或溶胞作用。优选使用调节FPR及其类似物的活性的效应体。这些配体优选为 甲酰肽受体样-1 (FPRL-1)的激活剂。本发明一个实施方案中，所述 多肽含有1到80个氨基酸残基，更优选3到40个氨基酸残基，更优 选3到20个氨基酸残基，而且还更优选3到13个氨基酸残基。 一般 来说，配体激活剂的EC50值范围为约2 x l(TM到约20 x 10—6M。优 选地，配体激活剂的EC50为2 x 10—5 M或更低。在一个优选实施方案 中，配体激活剂的EC50为3 x 1(T6M。在一个实施方案中，配体激活 剂的EC5 0通过本领域技术人员公知的钾动员测定法来确定。
甲酰甲硫氨酸肽的一个特别优选效应体是甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯 丙氨酸(fMLP) 。 FMLP是一种能够刺激多种白细胞功能的促炎症肽。 其刺激中性粒细胞趋化作用、溶酶体酶释放、氧自由基的产生、Ca+ + 流、中性粒细胞释放白三烯和平滑肌收缩。fMLP对中性粒细胞的刺激 诱导其黏附受体表达的迅速改变。另外，已证实fMLP诱导过氧化物的 产生和胞内Ca"水平的升高。已证实F1MLP诱导肺泡巨噬细胞、中性 粒细胞、树突细胞(DC)和单核细胞在内的许多细胞的趋化作用。事 实上，flMLP的趋化或趋化引诱活性已得到充分认可，因此常在趋化 测定中将f MLP用作阳性对照。
在20世纪50年代，曾发现感染活菌的组织提取物含有中性粒细 胞和巨噬细胞引诱剂(Harris, Physiol. Rev. 34:529-562 (1954))。 后来发现这些因子是革兰氏阳性和阴性细菌的滤过物中都含有的N-甲酰甲石充氨酸肽(Schiffmann et al. ， Pro" Natl. Acad. Sci. USA 72: 1059—1062 (1975); Schiffmann et al. ， J Immunol. 114:1831-18 (1975))。针对细菌病原体的免疫应答导致含有甲酰甲硫氨酸的降解肽 的释放，成为白细胞和巨噬细胞迁移和侵入的高效化学引诱物。这些肽 的受体已被克隆(Murphy et al. ， FEBS Lett. 261:353-357 (1990); Perez et al. ， Biochemistry 31:11595-11599 (1992))并鉴定为跨 膜七次的G蛋白偶联受体(GPCR)。由甲酰化肽拮抗剂对甲酰肽受体 (FPR)的结合介导的细胞应答包括细胞极化和迁移、通过呼吸爆发氧 化酶生成超氧化物氧自由基、脱粒作用以及多种不同降解酶的释放和吞噬作用。
如上概述，FPR受体是在骨髓细胞即吞噬细胞(单核细胞，(如 树突细胞和巨噬细胞)以及粒性白细胞上表达的表面受体。嗜中性粒 细胞作为粒性白细胞中数量最多的亚型在抗感染防御中发挥至关重要 的作用。它们是最早迁移至感染位点将外源物从这些位点清除的细胞 之一。它们在血液中含量丰富，但不存在于正常组织。在趋化募集至 感染位点并通过在納摩尔浓度水平刺激细胞受体的多种信号转导分子 (即化学引诱物、白细胞介素和趋化因子)梯度激活之后，嗜中性粒 细胞发起级联细胞和生理应答，最终导致过氧化物和弹性蛋白酶的释 放、进一步放大免疫应答的其他因子的释放、单核细胞募集和抗体的 吞噬作用。这些事件代表先天性免疫应答的重要生理构成。
因此，本发明的一个目的是提供包含效应体分子的多功能化合物， 该效应体通过经由FPR结合的信号转导，优选通过将甲酰甲硫氨酸肽， 尤其是甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)连接至合适的结合体(见 下文)诱导嗜中性粒细胞直接和/或间接激活。因此，在该实施方案中， 本发明的多功能化合物结合嗜中性粒细胞和单核细胞的细胞表面受 体。
根据本发明的另 一方面，所述多功能化合物包含与甘露糖岩藻糖 受体(MFR)相互作用的效应体。该MFR是一种180-kDa钙离子依赖的 具吞饮受体功能的凝集素。其最先从巨噬细胞分离得到，但已发现其 存在于多种其他类型细胞，包括树突细胞、肝脏内皮细胞、视网膜色 素表皮细胞和肾系膜细胞。该受体由IO个胞外结构域及其后的一个跨 膜区和短的胞内尾巴组成。胞外结构域是氨基末端的富含半胱氨酸的 结构域、个II型纤连蛋白重复结构域和八个串联的糖识别结构域。该 糖识别结构域结合接近的甘露糖、岩藻糖及N-乙酰葡萄糖胺残基，但 对具有多个结合位点的复杂配体具有更高亲和力，例如酵母表面的甘 露聚糖。
在本发明的另一方面，所述新型化合物包含至少两个效应体，其 中一个诱导先天性免疫系统的免疫应答而第二个效应体诱导获得性免疫系统的应答。在本发明一个特别优选的实施方案中，该化合物包含
PRR的配体(例如FPR的配体)和Fc受体的配体。
本发明的另 一个目的是提供一种包含效应体分子的多功能化合 物，该效应体通过经由MR或FPRL2结合的信号转导，优选通过将D -甲硫氨酸或甘露糖分子连接至合适的结合体(见下文)诱导树突细胞 直接和/或间接激活。因此，在该实施方案中，本发明的多功能化合物 结合树突细胞的细胞表面受体。
根据本发明的结合体的实例是合成或天然肽(线性的、环状的或 分支的)、肽模拟物、微生物蛋白质、肽重复、含肽序列的多肽结构、 微生物蛋白质(例如半胱氨酸结等)、免疫球蛋白及其片段(scFvs、 Fab、结构域等)、寡核苷酸(如DNA寡核苷酸(适配体)、RM寡核 苷酸(如适配体))、寡核苷酸类似物(PNA、 DNA/RNA嵌合体等)或 小分子。
结合体应能够通过针对病原细胞上可结合配体的受体的表达、优
先表达或过表达而优选靶向宿主动物中的病原体，例如细菌细胞、真 菌或胂瘤细胞。可接受的结合体包括叶酸、叶酸类似物及其他叶酸受 体结合分子、其他维生素、通过文库筛选鉴定出的肽配体、肺瘤特异 的肽、肿瘤特异的适配体、肿瘤特异的糖类、肿瘤特异的单克隆或多 克隆抗体、抗体的Fab或scFv(即单链可变区)片段、例如针对EphA2 或转移癌细胞特异表达或唯一可接近的其他蛋白质的抗体的Fab片 段、衍生自组合文库的有机小分子、生长因子如EGF、 FGF、胰岛素和 胰岛素样生长因子、以及同源多肽、生长激素抑制素及其类似物、转 铁蛋白、脂蛋白复合物、胆盐、选择素、类固醇激素、含Arg-Gly-Asp 的肽、视黄醇、多种半乳凝素、6-鸦片受体的配体、胆嚢收缩素A受 体的配体、血管紧张素AT1或AT2受体的特异配体、过氧化物酶体增 生物激活的受体y配体、13-内酰胺抗生素、包括抗菌药在内的有机小 分子、以及特异结合肿瘤细胞表面或感染性生物表面优选表达的受体 的其他分子、或任何这种分子的片段。
如果本发明的结合体是蛋白质或肽，其长度优选在很少的几个到超过100个氨基酸残基之间变化。优选地，寡肽的长度是1到75个氨 基酸残基之间，更优选3到25个氨基酸残基之间。结合体可对一种或 多种乾分子、耙细胞或靶组织具结合亲和力，例如细菌、真菌或肿瘤
细胞。本发明的寡肽优先为合成肽。 结合体的实例列于表l中。
优选肽结合体的序列的实例是CGLIIQKNEC、 CNAGESSKNC 、 Dhb-pLDIK、 Dhb-pLDI、 WIFPWIQL、 WDLAWMFRLPVG、 VVISYSMPD、环 (RGDfK)、 RGDfK、 RGDWXE、 GGHGRVLWPDGWFSLVGISP、 YHWYGYTPQNVI、 TACHQHVRMVRP 、 NLLMAAS 、 DUP-1 、 HEWSYLAPYPWF 、 HTFEPGV 、 cyclo(SRESPHP) 、 SRESPHP、 KCCYSL、 LTVXPWY、 CSDSWHYWC、 CSDxxHxWC、 EDYELMDLLAYL、环(CVGNDNSSC) 、 CVGNDNSSC、 TTPRDAY、 VHLGYAT、 CSNRDARRC、 CX腳XR (X) / (R) C、 SWKLPPS、 IAGLATPGWS亂AL、 A證LPP、 VPWMEPAYQRFL、 EPAYQR、 KSLSRHDHIHHH、 TNSLP、 YYGLAEVDAGGS、 MQLPLAT、 MXXP。
可用这些肽结合体靶向的靶结构的实例是纤维蛋白-纤连蛋白复 合物、oc-4-0-l整合素、ex-v-0-5整合素、a-v-p-3整合素、oc -3-P-1整合素、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 、 EGFR、 EGFRvIII、 EphA2 受体、白细胞介素-6受体(gp80， CD126) 、 Tie2、 Her-2 (人ErbB-2)、 人血管内皮细胞生长因子受体3 (VEGFR-3)、 FGF受体、其他细胞表面 肿瘤标志物。
可通过上述肽结合体特异靶向的胂瘤的实例是实体瘤、淋巴瘤、 非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、前列腺癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、 胰腺癌、卵巢癌、滤泡性曱状腺癌、间变性甲状腺癌、乳腺癌症、宫 颈癌、前列腺癌症、新生血管、肝癌、肝细胞癌、膀胱癌、胃癌的腹 膜肿瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤。
更多本发明靶分子的实例在表2中给出。
如上所述，本发明的多功能化合物包含可操作地连接的结合体和 效应体。连接("连接体")可由共价键或功能相当的键构成，例如 链霉亲和素/亲和素或其他复合试剂。连接体也提供结合体分子本身之间和效应体分子本身之间连接，如在树状聚体连接体的情况下。
设计的多功能化合物的不同可能结构例如 活性物结构-结合体+效应体+连接体 -单结合体+单效应体+线性连接体
-两个或更多相同结合体(亲和力)+单效应体+线性连接体 -两个或更多不同结合体(亲和力/选择性/多价)+单效应体元件+ 线性连接体
- 一个或更多相同或不同结合体+两个或更多相同效应体(效价)+ 线性连接体
-一个或更多相同或不同结合体+两个或更多不同效应体(效价/ 选择性)+线性连接体
-一个或更多相同或不同结合体+—个或更多相同或不同效应体+ 分支连接体(触须样结构)
本发明的连接体的实例包含直接偶联、小连接体、通过同源寡功 能连接体统计学偶联、寡-醇、寡-胺、寡-羧酸、硫醇、通过异源寡功 能耦合元件以确定的化学计量、聚合物(亲水和亲脂聚合物)、通过 同源多功能连接体(homooligofuntional linker)的统计偶联 (statistical coupling) 、 HPMA、多聚赖氨酸、羟乙基纤维素、羟 乙基淀粉、氨基葡聚糖、共聚物、分支聚合支架、分支PEG、树状聚 体、尤其是多聚赖氨酸树状聚体、通过异源寡功能耦合元件以确定的 化学计量、多肽、功能化的活化聚合物、PEG、聚氨脂。
采用本领域技术人员公知的反应将所述单元连接于聚合物栽体单 元，例如PEG。例如对本领域技术人员来说，有很多种PEG和HES附 着方法(参考如W0 2004/100997，更多参考见Roberts et al. ， 2002、 US 4, 064,118、 EP 1 398 322、 EP 1 398 327、 EP 1 398 328、 WO 2004/024761 )。经由聚乙二醇化、二硫键或赖氨酸侧链的分子二聚化 于WO 96/40772 、 WO 96/40749 、 冊01/38342 、 WO 01/091780 、 WO 2004/101611 、 WO 2004/100997 、 WO 2004/101600 、 WO 2004/101606 、 Wrighton et al. ， 1997 、 Johnson et al.， 1997中有述。所述方法通过连接体结构将单肽组合以获得预期二聚分子甚 至多聚分子。
实施方案
1.单结合体+单效应体；线性连接体
在本发明的一个实施方案中，本发明的多功能化合物包含通过线 性连接体连接的单个结合元件(结合体)和单个效应体。所述结合元 件是对一种或多种靶分子、靶细胞或靶组织具结合亲和力的寡肽。优 选地，乾分子是在癌细胞表面表达的分子。
所述该寡肽的长度可在很少几个到超过100个氨基酸残基间变 化。优选地，所述寡肽的长度为1到75个氨基酸残基，更优选5到 25个氨基酸残基。该寡肽一般由至少20个天然氨基酸残基组成。备 选地，该寡肽由非天然氨基酸残基或天然氨基酸残基和非天然氨基酸 残基的混合物组成，也可包含未修饰的肽键。非天然氨基酸残基包括 非标准氨基酸，例如b-丙氨酸、肉碱、瓜氨酸、高精氨酸、高瓜氨酸、 高半胱氨酸、高苯丙氨酸、高脯氨酸、羟脯氨酸、别异亮氨酸、异丝 氨酸、鸟氨酸、苯甘氨酸、苯异丝氨酸、别苏氨酸或立体异构体(例 如D-氨基酸代替L-氨基酸)。在一个实施方案中，该寡肽为线性分子 并经由N端或C端附着于所述连接体上。备选地，该肽为环形或形成 分子内二硫键。在另一方面，该寡肽包含在同一个寡肽分子(肽重复) 中互相附着的相同或不同氨基酸序列的多个拷贝。
除肽骨架外，也可选择人造的非天然骨架用以合成肽模拟物，赋 予例如更高的体内稳定性或更好的生物物理特性。这类骨架的实例是 磷酸二脂[Bioorg Med Chem Lett. 1998 Mar 3; 8 (5): 511-4. Solid-phase synthesis of peptidomimetic oligomers with a phosphodiester backbone. Lin P， Ganesan A.]。
在本实施方案的一个具体方面，该寡肽对人EGFR (表皮生长因子 受体)和/或其变体、衍生物或同源物具有结合亲和力。例如，该寡肽 对全长的EGFR或截短的受体EGFR vIII(表皮生长因子受体变体III)或这两者都具有结合亲和力。EGFR在许多病理细胞群体中过表达，例 如结肠癌、头颈部癌、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和胶 质母细胞瘤。
通过在肽序列文库中就那些以充分亲和力更选择性地结合的肽篩 选对EGFR具有结合亲和力的寡肽。备选地，可采用来自所述受体的天 然配体的肽序列，例如人EGF (表皮生长因子)、或例如抗EGFR单克 隆抗体这样的EGFR的新型结合体。
在本实施方案的另一方面，所述寡肽的长度在5到25个氨基酸残 基之间，并包含下组中的一个或多个序列GYTP、 YGYTPQ、 WYGYTPQN、 HWYGYTPQNV、 YHWYGYTPQNVI。在优选方面，该寡肽长度为12个氨基 酸残基，并包含序列YHWYGYTPQNVI。
缩写氨基酸
AAla丙氨酸
CCys半胱氨酸
DAsp天冬氨酸
EGlu谷氨酸
FPhe苯丙氨酸
GGly甘氨酸
HHis组氨酸
Ilie异亮氨酸
KLys赖氨酸
Leu亮氨酸
MMet甲硫氨酸
NAsn天冬酰胺
PPro脯氨酸
QGin谷氨酰胺
RArg精氨酸
SSer丝氨酸
TThr苏氨酸V Val 缬氨酸 W Trp 色氨酸
Y Tyr 酪氨酸
X Xxx 任何氨基酸
2.结合体和效应体之间的连接体
本发明的连接体提供了两个结构域，即结合体和效应体之间的物 理分子连接。
^#鍵；苴凝遂凝脊
在本发明的一个实施方案中，结合体和效应体通过共价键直接连 接。这可以通过在两个结构域(即结合体和效应体分别)中都引入相 互反应的基团来实现.这样的相互反应和选择性基团易于引入结合体 和效应体。这样的相互反应基团的实例是存在于两个元件的游离半胱 氨酸残基，它们在氧化条件下在所述结构域之间形成稳定的二硫键。 这些相互反应基团的另一个实例是一个结构域的羰基和另一个结构域 的氨基，它们通过缩合反应形成水解不稳定的亚胺键，后者可通过亚 胺与氰醇的反应而被还原，从而在化合物之间生成水解稳定的胺键。
V、遂接伴
在本发明的另一个实施方案中，结合体或效应体由小分子量连接 体连接。在一个优选实施方案中，该连接体的分子量低于1000道尔顿。 在更优选的实施方案中，该小分子量结合体的分子量低于100道尔顿。 结合体和效应体可以同时或先后与连接体反应。
遞迎^源,《#|迷^琳#鍵#偶联
在本发明的另一个实施方案中，结合体或效应体通过同源寡功能 连接体统计偶联，例如癸二酸二(N-琥珀酰亚胺基)酯、1， 4-二[3-(2-吡啶二硫)丙酰氨基]丁烷、二[2-(N-琥珀酰亚胺基-氧代羰氧基)乙基] 砜、二[2-(4-叠氮水杨酰胺)乙基]二硫化物、二甲基3，3'-二硫代双 丙亚氨酸二曱酯二盐酸盐或乙二醇二琥珀酸二 ( N-琥珀酰亚胺基)酯。
JT-寧、,-麽、,-戎^、碗寧在一个优选实施方案中，上述小分子量连接体仅带有一种可统计 偶联至结合体和效应体上的反应基团，生成如本发明所述的连接到效 应体上的结合体的混合物。此外这也生成结合体二聚体和效应体二聚 体。可通过本领域技术人员公知的物理化学方法分离这些二聚体。
小分子量连接体可选自寡-醇、寡-胺、寡-羧酸、疏醇、羰基类。 另外，可选择具有更高反应效力和选择性的优势的功能化和活化的同
源寡功能连接体。在优选实施方案中，它们可选自癸二酸二 (N-琥珀 酰亚胺基)酯，1， 4-二[3-(2-吡啶二硫)丙酰氨基]丁烷，二[2-(N-琥珀酰亚胺基-氧代羰氧基)乙基]砜，二[2-(4-叠氮水杨酰胺)乙基] 二硫化物，二甲基3， 3'-二硫代双丙亚氨酸二曱酯二盐酸盐，乙二醇 二琥珀酸二 (N-琥珀酰亚胺基)西旨。
遽i2^f源,^游遂礎沐"确定^^夢^量
在另外一个优选实施方案中，采用异源寡功能连接体连接结合体 和效应体。这些异源寡功能连接体特点在于具有两个或多个不同的反 应化学实体。这样的连接体避免了结合体二聚体和效应体二聚体的形
成，因此提高了连接反应的选择性和产量。
在一个优选实施方案中，异源寡功能连接体选自糖类、羟基羧酸、 氨基酸。具有超过两个反应基团的异源寡功能连^体可用于制备具多 个效应体或多个结合体的分支结构。这种连接体的实例是如天冬氨酸、 谷氨酸或赖氨酸这样的具有携带羧基或氨基的侧链的氨基酸。
此外，选择具有更高反应效力和选择性优势的功能化和活化的异 源寡功能连接体。在优选实施方案中，它们选自3-马来酰亚胺基丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺脂、11-马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺脂。
这些异源寡功能连接体的琥珀酰亚胺基团首先与结合体和/或效 应体的胺部分反应，其中巯基特异的马来酰亚胺部分必须是稳定的。 此反应生成马来酰亚胺功能化的结合体或效应体，所述结合体或效应 体在第二步中与以自由的非氧化巯基功能化的相应的效应体或结合体 反应。
秉合^遽接琳f亲/A;^亲腐炎会參,在另一个优选实施方案中，选择聚合的连接体，其中该连接体的
分子量优选在lkD到lOOkD之间，更优选在5 kD到50kD之间，最优 选在10kD到30kD之间。所述连接体聚合物是任何生理耐受的天然、 改性天然或合成聚合物。
在一个优选实施方案中，内层聚合物(lining polymer)选自多 肽、多糖、聚酯、聚醇、聚醚、聚氨酯、聚丙烯酸酯或多聚核苷酸。 在另一个优选实施方案中，所述聚合物的功能化或活化衍生物用作本 发明的连接体。
^游遽接^婉#遂接
实例是HPMA (N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、多聚赖氨酸、羟乙 基纤维素、羟乙基淀粉、氨基葡聚糖。
在一个更优选实施方案中，连接体聚合物选自N-(2-羟丙基)甲基 丙烯酰胺共聚物、多聚赖氨酸、羟乙基纤维素、氨基葡聚糖和聚环氧 乙烷嵌段共聚物。这些聚合物带有多个以统计方式与结合体和效应体 反应的反应基团，生成以元件之间的物理连接为特征的功能化聚合物。
#炎浙遂接琳
在另一个优选实施方案中，釆用上述聚合物的共聚物(规整的、 无规的、嵌段的或接枝的)作为连接体。所述聚合物的物理和生理特 性如粘度、亲水性、溶解度由这些个别的聚合物的物理结合所提供。 这种共聚物的一个实例是环氧乙烷和环氧丙烷的聚合("普流罗尼 (Pluronic)，，)。
#义W^合矛束
在另一个优选实施方案中，采用上述聚合物的共聚物(规整的、 无规的、嵌段的或接枝的)作为连接体。 为、义卿
线性和分支聚合物和共聚物可用于本发明。分支聚合物以接枝共 聚物或通过由oligovalent starter启动的直接聚合来制备。在一个 优选实施方案中，采用了由上述第二种方法制备的分支聚乙二醇(多 臂PEG)。这些多臂PEG —般以自由羟基部分作为链终止剂来进行制备或随后经修饰以生成功能化的活化多臂PEG。这些修饰的实例是掺 入丙烯酸酯、胺、环氧化物、异氛酸酯、琥珀酰亚胺戊二酸、琥珀酰 亚胺琥珀酸酯。它们可与结合体和效应体的反应基团反应而生成分子。
在一个特别优选实施方案中，采用树状聚体作为连接体。 树状聚体优选基于多聚赖氨酸和偶联于不同效应体和/或结合体 (替代物)，并且经特别设计以使得确定比例的两个或多个替代物根 据合成中激活剂的选择形成所述树状聚体的部分。甘露糖化多聚L-赖 氨酸树状聚体肽缀合物的制备方法在Kantchev et al. Biopolymers (Pept Sci) 84:232-240， 2006中有述。所述树状聚体本身可以用例 如50kD的PEG聚乙二醇化，这样的PEG带有其他效应体或结合体。在 另一个优选实施方案中，PEG衍生的结合体和效应体肽通过固相合成 并偶联到聚合的树状聚体骨架上。如果结合体和效应体肽同时偶联到 聚合的树状聚体骨架的相似化学部分上，那么所述反应生成具有偶联 到骨架上的结合体和效应体元件的统计混合物的反应产物，其量比由 析出物浓度实验条件的选择决定。如果结合体和效应体肽优选依次偶 联到聚合的树状聚体骨架的不同化学部分，那么所述反应生成具有偶 联到骨架的结合体和效应体元件的固定化学计量的反应产物，其量比 由聚合物骨架的组成决定。
在另一个优选实施方案中，所述连接体是聚乙二醇(PEG)。 在另一个优选实施方案中，连接体组合可用于提供结合体元件和 效应体元件间的物理偶联。在一个实例中，可将异源寡功能线形连接 体分子偶联至同源多功能聚合物骨架，为结合体和效应体元件的偶联 提供中间的异源多功能骨架。在另一个实施方案中，具有多个偶联的
接体偶联，以提供具有结合体和效应体元件的空间上隔离的多价展示 的物质，带来更高的结合亲和力和信号强度。
其他实例是通过异源寡功能偶联以确定的化学计量、其他功能 化的多肽、活化聚合物、聚氨酯。3.效应体的实例 先天性免疫系统的效应体
PAMP (病原体相关分子模式)-来自病毒、真菌和细菌(1. LPS, 2.凝集素、3. CpG-DNA、 4. N-甲酰甲硫氨酸肽、5. dsRNA、 6. 甘露聚糖和/或甘露糖残基(岩藻糖)、含甘露糖的多糖、7.磷酸胆碱、 8.糖脂样分子、9.鞭毛蛋白、10.肽聚糖)。
介导人血液单核细胞和人腹腔巨噬细胞的趋化应答的效应体的一 个实例是曱酰-Met - Leu-Phe ( f MLP )，这在0brist et al. (0brist et al. Int. J. Immunopha函cology， 5(4)， 1983， 307-314)中有 述。
Leu-Asp-leu-Leu-Phe-Leu (LDLLFL)肽代表另外一类FPR配体。 LDLLFL是CKS-17的一个片段，后者是一个衍生自已证明抑制免疫应 答的多个不同组分的逆转录病毒跨膜蛋白的保守区的蛋白。LDLLFL是 FPR的拮抗剂，竟争对甲酰—Met - Leu 一 Phe ( fMLP )的结合。 (Oostendorp et al. ， J. Immunol. 149: 1010-1015 (1992); Oostendorp et al.， J Leukocyte Biol. 51: 282-288 (1992); Oostendorp et al.， Eur. J Immunol. 22: 1505-1511 (1995))。
annexin I蛋白是另外一类FPR配体。已在多个系统中发现 annexin I的抗炎活性，尽管这些作用的机制还不很清楚。最近，发 现衍生自annexin I的N端蛋白水解片段的肽是FPR配体。由嗜中性 粒细胞弹性蛋白酶剪切全长annexin I产生的26个氨基酸的N端肽是 FPR激活剂，尽管其作用浓度比fMLP高很多(Kd分别为740 ji m和 0.02pm)。对该激活剂在表达FPR的细胞上的作用的测试表明，尽管 其是激活剂，此肽通过有效诱导受体脱敏而削弱免疫应答。
炎j沐^^必^辦
来自革兰氏阴性(杆状的)细菌的细菌细胞壁的LPS 未修饰LPS
t至少一种来自LPS的未修饰或修饰的单体结合Mindin/ECM和/或TLR4的LPS模拟分子 来自细菌的凝集素 未修饰凝集素
至少与凝集素序列的一部分同源的肽
至少与凝集素序列的 一部分同源的肽模拟物
结合Mindin/ECM的凝集素模拟物
结合Mindin/ECM的肽
结合Mindin/ECM的肽模拟物
结合Mindin/ECM的任何/小分子 含CpG的DNA序列
含CpG重复的未曱基化或低频率甲基化的细菌DNA序列
含CpG重复的未甲基化或低频率甲基化的细菌硫代磷酸DNA
序列
结合TLR9的含CpG重复模拟分子的DNA序列 N-甲酰曱硫氨酸
以N-甲酰甲硫氨酸起始的肽
以N-甲酰曱硫氨酸起始的肽模拟物
含C端D-甲硫氨酸的肽
含C端D-甲硫氨酸的肽模拟物
诱导FPR、 FPRL1或FPRL2的肽
诱导FPR、 FPRL1或FPRL2的肽模拟物
诱导FPR、 FPRL1或FPRL2的任何/小分子
含N-曱酰甲硫氨酸的分子 病毒的dsRNA
病毒的未修饰dsRNA
病毒的硫代磷酸dsRNA
结合TLR3的病毒模拟分子的dsRNA 含甘露聚糖/甘露糖的寡聚物或多聚物
来自酵母和细菌细胞壁的未修饰甘露聚糖和/或甘露糖残基(岩藻糖)
来自酵母和细菌细胞壁的甘露聚糖和/或甘露糖残基(岩藻 糖)的至少一个未修饰或修饰单体
结合甘露聚糖结合凝集素(MBL )的来自酵母和细菌细胞壁模 拟分子的甘露聚糖和/或甘露糖残基(岩藻糖) 来自细菌和真菌的含未修饰甘露糖的多糖 来自细菌和真菌的含甘露糖的多糖的至少一个未修饰或修饰 单体
结合MMR (巨噬细胞甘露糖受体)的来自细菌和真菌模拟分
子的含甘露糖的多糖 来自细菌细胞壁的磷酸胆碱
来自细菌细胞壁的未修饰磷酸胆碱
结合CPR (C-反应蛋白)的效应体 病原体上的糖脂样分子
结合TLRl和/或TLR2/6二聚体的来自细菌细胞壁的未修饰磷
酸胆碱
来自细菌动力蛋白和毒力因子的 未修饰鞭毛蛋白
与鞭毛蛋白序列至少一部分同源的肽
与鞭毛蛋白序列至少 一部分同源的肽模拟物
结合Mindin/ECM的鞭毛蛋白模拟物
结合TLR5的肽
结合TLR5的肽模拟物
结合TLR5的任何/小分子 来自细菌，尤其是革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖
来自细菌，尤其是革兰氏阳性菌细胞壁的未修饰肽聚糖 来自细菌，尤其是革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖的至少一个未 修饰或修饰单体
来自细菌，尤其是革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖的肽聚糖结合TLR和NOD尤其是NOD蛋白(N0D2和N0D2 )的来自细 菌，尤其是革兰氏阳性菌细胞壁模拟分子的肽聚糖 来自鼠伤寒沙门氏菌Toll样受体(TLR) 2/CD14的细巻曲菌毛 (CsgA)的主要菌毛亚单位
蠕虫的糖、乳-N-岩藻戊糖III(LNFPIII)，通过其对鼠树突细胞 的作用行使先天性Th2启动子的功能，其活性需要ot1-3-连接的 岩藻糖。新糖缀合的乳-N-岩藻戊糖III (12-25个分子)-葡聚糖
(L酵III-Dex)通过TLR4激活树突细胞(DC )。 合成化合物大肠杆菌类三酰脂肽(Pam3CSSNA)、大肠杆菌类脂质A
(LA-15-PP)、含有脱胞壁酰肽的二氨基庚二酸(y-D-谷氨酰-内 消旋-DAP、 iE-DAP)、和结合TLR2、 TLR4、核苷酸结合寡聚结构 域蛋白(NOD ) 1和N0D2的胞壁酰二肽(MDP )。 酵母的酵母多糖激活TLR2/ TLR6异源二聚体，然而酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(C. albicans)的 甘露聚糖似乎可由TLR4检测。已证明存在于白色念珠菌细胞表面 的磷脂甘露聚糖由TLR2识别，而TLR4主要与新生隐球菌(C. neofor歸ns )主要荚膜多糖——葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖相互作 用。已经发现MyD88参与来自卡氏肺孢子虫(P. carinii)的线 性(l —> 3)-P-D-葡聚糖和P-葡聚糖的TLR信号转导。 含量最丰富的细菌蛋白延伸因子Tu(EF-Tu)在大肠杆菌中N端乙 酰化，包含前18个氨基酸组成的N端乙酰化肽elfl8作为防御应 答诱导物具充分活性。
结合TLR2的来自肺炎克雷伯氏杆菌的外部膜蛋白A (KpOmpA) 起表面黏附功能的菌毛(来自牙龈卟啉单胞菌)。尽管TLR2和TLR4 介导对菌毛应答的细胞激活，其他PRR，即CD14和CDllb/CD18 参与菌毛的识别。 咪唑喹啉类
结合TLR6和TLR2的支原体脂肽
酰化脂肽，例如二酰化支原体脂肽、所谓的巨噬细胞激活脂肽2KDa(MALP-2)或三酰化细菌脂肽
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)分泌的酚可溶调 控蛋白；表皮葡萄球菌释放一类刺激巨噬细胞的名为酚可溶调控 蛋白(PSM)的肽。3种肽(PSM oc、 PSM P和PSM y )的结构已 有描述。我们报告第四种肽(PSM 5 ),是具有 fMSIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKK结构的23聚体。 其他实例包括补体级联的蛋白
4.特别优选实施方案 特别优选实施方案列于表3中 表3
序号结合体(b)连接体(1)效应体(e)备注
1肽线性PEGN-甲酖甲硫氨酸肽——
2肽分支PEGN-甲酰甲硫氨酸肽不同混合能产生多种b:e组合
3微生物蛋白质线性PEGN-甲酰曱硫氨酸肽b:e,或多个b或e
4微生物蛋白质分支PEGN-甲酰曱硫氨酸肽不同混合能产生多种b:e组合
5肽模拟物线性PEGN-甲酰甲硫氨酸肽b: e 1: 1，或多个b或e
6肽模拟物分支PEGN-甲酰甲疏氨酸肽不同混合能产生多种b:e组合
7硫代磷酸RNA或 腿线性PEGN-甲酰甲硫氨酸肽b: e 1: 1,或多个b或e
8^充代磷酸MA或 DNA分支PBGN-曱酰甲硫氨酸肽不同混合能产生多种b:e组合
9序号1-8中的b序号1-8中的1肽模拟物e是N-甲酰甲疏氨酸舦上的碱基
10序号l-8中的b序号1-8中的L小分子咪唑喹啉类或磷酸胆碱等
11序号1-8中的b序号1-8中的1甘露糖、岩寐糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、多聚 鸟苷酸(polyG)末端甘露糖、甘露聚糖或含甘露 糖残基的多糖等
12序号1-8中的b亲水(线性)聚 合物序号1-12中的EPEG或PEG衍生物、HPMA、多聚赖 氨酸、羟乙基纤维素、羟乙基淀粉、 氨基葡聚糖等
13序号1-8中的B亲水分支聚合 物序号1-12中的E分支PBG或树状聚体
14序号1-8中的B聚合物序号1-12中的E聚合醇、聚醚、聚氨酯、聚丙烯酸 酯或多聚核苷酸
15序号1-8中的b同源寡功能连 接体序号1-12中的E
16序号1-8中的b异源寡功能连 接体1-12中的E
17序号1-8中的b序号1-8中的1舦或肽模拟物FL2豫导FPRL2 Migeotte, I et al. JExpMed 2006
18序号l-8中的b序号1-8中的1含C端D-甲疏氨酸 的舦或肽模拟物Bae Y-S et al. Mol Pharmacol 64:841 847, 2003
30实施例 I.生产
1. 结合体的生产
寡肽和蛋白质的体外生产方法为本领域技术人员公知。提供上述
寡肽的原创方法由Meffifield在1963年发表/"i .及VerW/7e/《/. 爿迈.C力e迈.S(7C.《i", 2/^1 Gi^J入'及".Zsrse" ef s/, /. J瓜O e迈.
"，MJ(7"^/J/./, ^"o"/ e// " ， /. J迈.Soc.
合成肽(非天然氨基酸等)、环形肽、肽模拟物 所述方法已得到众多改进和扩展，赋予该方法高度的适应性。所 述改进包括掺入非天然氨基酸[Ishida， H. ， & Inoue， Y. (1999) Peptides that contain unnatural amino acids: Toward artificial proteins. Reviews on Heteroatom Chemistry, 19， 79—142 、 O'Donnell， M. J. ， Lugar， C. W. ， Pottorf， R. S. ， Zhou, C. ， Scott， W. L. ， & Cwi， C丄 (1997) Solid-phase synthesis of unnatural amino acids using unactived alkyl halides. Tetrahedron Lett., 38， 7163-7166、 Scott, W. L. ， Zhou, C. ， Fang, Z. ， &(TDonnell， M.J.(1997) The solid phase synthesis of alpha,alpha-disubstituted unnatural amino acids and peptides (di-UPS). Tetrahedron Lett,, 38， 3695-3698.]和环形肽的生产 [Zhang, L，S.， & Tam， J. P. (1997) Synthesis and application of unprotected cyclic peptides as building blocks for peptide dendrimers. J. Amer. Chem. Soc.， 119， 2363-2370. 、 Koppitz， M.， Huenges， M. ， Gratias, R. ， Kessler, H. ， Goodman, S丄，& Jonczyk, A.(1997) Synthesis of unnatural lipophilicN-(9H-fluoren-9-yl-methoxy)carbonyl-subst ituted alpha-amino acids and their incorporation into cyclic RGD-peptides: A structure activity study. Helv. Chim. Acta, 80， 1280-1300.、 Gobbo， M. ， Biondi， L., Cavaggion， F., Filira， F.， Piek， T.， Mantel, P. ， & Rocchi， R. (1997) Synthesis and biological activities of head-to-tail cyclic bradykinin analogues of varying ring size. Int. J. Peptide Prot. Res.， 50, 336—341、 Eichler， J. ， & Houghten， R， A. (1997) Synthesis of cyclic disulfide peptides: Comparison of oxidation methods. Protein Peptide Lett. ， 4， 157-164、 Blackburn, C. ， & Kates, S. A. (1997) Solid-phase synthesis of cyclic homodetic peptides. Methods Enzymol.， 289， 175-198、 Tam， J. P. ， & U， Y. A. (1998) AMomimetic strategy in the synthesis and fragmentation of cyclic protein. Protein Sci., 7， 1583—1592,]。
将非天然氨基酸掺入肽序列中赋予该肽额外的功能适应性(例如 结合特性)的同时，也提供了引入反应性和选择性化学功能的额外方 法。
通过将两个或更多具C端硫脂和N端半胱氨酸的更小的肽天然化 学连接可有效合成更大的蛋白质[PNAS I December 19， 2000 I vol. 97 I no. 26 | 14074-14078; Chemical synthesis and spontaneous folding of a multidomain protein: Anticoagulant microprotein S ilman M. Hackeng，Jos 6 A. Fern6ndez， Philip E. Dawson, Stephen B. H. Kent, John H. Griffin]。
除固相合成d通用方法外，本领域技术人员公知釆用生物系统生 产寡肽和低分子量蛋白质[Protein Expr Purif. 2006 Apr 25;Extracellular production of human cystatin S and cystatin SA by Bacillus subtilis. Akiba S， Hayashi Y， Hakamada Y， Endo K， Ara K， Kawai S， Saitoh E. 120aa]。农重复
可釆用上述方法生产和纯化肽重复。 疯^橫蛋^^ f"f應扇^潜爭J
可通过固相合成方法有效生产微生物蛋白质[Olga Avrutina， Hans-Ulrich Schmoldt， Harald Kolmar， Ulf Diederichsen， Fmoc-Assisted Synthesis of a 29-Residue Cystine-Knot Trypsin Inhibitor Containing a Guaninyl Amino Acid at the Pl-Position， European Journal of Organic Chemistry, 2004， 23， 4931-4935], 另外一些生产微生物蛋白质(如半胱氨酸结蛋白)的方法也已公知 [Schmoldt HU， Wentzel A， Becker S， Kolmar H. A fusion protein system for the recombinant production of short disulfide bond rich cystine knot peptides using barnase as a purification handle. Protein Expr Purif. 2005 Jan; 39 (1): 82-9.]。
^^球蛋冷f^瘦^蛋冷^^、 "F"、潜种询'爭, 人或动物免疫球蛋白可在哺乳动物细胞系中 [Curr 0pin Biotechnol. 1995 Oct;6 (5): 553-60. Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells. Trill JJ, Shatzman AR， Ganguly S. ]yij原核生物中[Curr Opin Biotechnol. 2004 Aug; 15 (4): 364-73. Prokaryotic expression of antibodies and aff ibodies. Fernandez LA.]生产。
Jt核茅^ ( ( DNA寡核苷酸(适配体)、RNA寡核苷酸(适配体)、 寡核普酸类似物(PNA、 DNA/RNA嵌合体等)
DNA寡核苷酸和修饰衍生物(例如硫代磷酸DNA/RNA )可通过固相 方法以极好的产量和纯度体外合成最多30到80个核苷酸的任意序列。 专业人员/^知此方法[Caruthers MH， Beaton G， Wu JV， Wiesler W. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides andanalogs. Methods Enzymol.
1992; 211: 3-20. 、 Caruthers MH， Beaton G， C画ins L， Graff D， Ma YX， Marshall WS， Sasmor H， Norris P， Yau EK. Synthesis and biochemical studies of dithioate DM. 、 Ciba Found Symp. 1991; 158: 158-66; discussion 166-8. 、 Caruthers MH， Beaucage SL， Becker C， Efcavitch JW， Fisher EF， Galluppi G， Goldman R, deHaseth P， Matteucci M， McBride L， et al. Deoxyoligonucleotide synthesis via the phosphoramidite method. Gene Amplif Anal. 1983; 3: l-26丄
除掺入天然碱基(C、 T、 A、 G、 U)外，可将人造碱基掺入寡核苷 酸，促进可选择长度的寡核苷酸5'端氨基连接体、可选择长度的3' 端氨基连接体或巯基的偶联。
2， 连接体的生产
结合体和效应体可共价连接。适合共价连接多个功能基团的反应 条件是本领域技术人员已知的[Henson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996]。它们通常需要在将元件与其他 元件(结构域)直接反应之前激活该元件(结构域)。此种反应方案 的实例是通过碳二亚胺激活一个参与物的羧基部分，并将反应中间产 物与带氨基的第二个元件接触[Hoare DG， Koshland DE， J. Am. Chem. Soc. 88， 2057; Chu， BCF， Kramer FR， 0rgel LE， Nuc.Ac.Res. 14， 5591-5603]。
通过同源寡聚多功能连接体、聚醇、聚-胺、聚-羧酸、巯醇的统 计偶联
二醇、三醇、二胺、二羧酸这样的小分子底物可用作结合体和效 应体偶联的反应骨架。这些小分子量骨架的实例是例如甘油、己二胺、琥珀酸。通常在反应基团激活之后，它们可与结合体和效应体反应以 生成反应产物的统计混合物。
实验条件见[Henson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996]。除此之夕卜，还有许多 促进元件偶联的活化的双功能连接 基团，它们的实例是二硫二 (琥珀酰亚胺丙酸酯)、辛二酸二琥珀 酰亚胺酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯[Henson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996]。
遞过^源慕^游遂凝#以确定^^夢^#
异源寡功能连接体可用作用于形成结合体和效应体的化学计量确 定的组合的反应骨架。这类骨架特点在于各自可偶联于结合体和效应 体的两个直系同源的功能基团。
这类双功能骨架的例子是ct氨基酸(NH2， C00H)、羧基酸(0H， C00H)。专业人员已知选择性和单独偶联这些功能基团的方法(Henson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996 )。 此夕卜还 已知许多活化的异源双功能连接体。它们的实例是N-琥珀酰亚胺基 -3- (2-吡啶二硫)丙酸酯及其衍生物、琥珀酰亚胺氧羰基-a -曱基-oc -(2-吡啶二硫)甲苯、琥珀酰亚胺基4- (p-马来酰亚胺基苯基)丁酸盐， 它们使一个元件的胺基团与另一个元件的巯基反应(Henson GT.， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996)。
炎合^遂凝琳r^^希泉瞎炎合參J 通过同源多功能连接体统计偶联 ■A
多聚赖氨酸
羟乙基纤维素、羟乙基淀粉
氨基葡聚糖
共聚物
高分子量聚合物骨架可用于以统计方式偶联结合元件和效应元件。通过聚合物骨架激活和骨架与结合和反应的反应。分支聚合 物骨架
分支PEG
J^,'L、效At
們^v水r^
通过异源寡功能耦合以确定的化学计量 多肽
功能化的活化聚合物
PEG
聚氨酯
最优选实施方案中，连接体为聚乙二醇 连接体组合和共聚物
3.效应体的生产
农弄i;^^泼^斧
刺激先天性免疫系统的寡肽
寡肽和多肽
肽
未修饰肽
fM肽
上述方法可应用于生产肽。可通过使用非天然氨基酸作为肽合成 中的单体掺入对肽的修饰。
在另外一种方法中，合成后修饰所合成的肽。这优选在脱保护和 合成产物从固相释放之前完成，以促进修饰后反应产物的分离。采用
该合成方法，例如N-甲基甲酰化肽可通过首先合成掺入N端甲硫氨 酸残基的肽序列生成。随后该残基与2，4，5-三氯苯基甲酸脂反应而生 成甲酰化的产物[PNAS .99(14); Jul 9， 2002， Scott Baskervi 1 le and David P. Bartel， A ribozyme that ligates RNA to protein]。 然 后该产物可通过例如反相高效液相色谱法这样的本领域技术人员公知的标准方法进行纯化。
细菌细胞壁的肽聚糖 跑0丄
例如酰化脂肽，如二酰化支原体脂肽或三酰化细菌脂肽和三酰脂
肽(Pam3CSSNA)、含有脱胞壁酰肽的二氨基庚二酸(y-D-谷氨酰-内消旋 -DAP、 iE-DAP)、以及胞壁酰二肽(MDP)
具表面勦附功能的来自细菌的凝集素/黏附素，如来自鼠伤寒沙门 氏菌的菌毛亚单位(CsgA)或菌毛(来自牙龈卟啉单胞菌) 来自细菌的鞭毛蛋白
来自细菌的N-乙酰化延长因子，如来自大肠杆菌的Tu (EF-Tu)
来自细菌如肺炎克雷伯氏杆菌的外部膜蛋白(KpO即A)
细菌蛋白质可通过本领域技术人员公知的生物技术生产和蛋白质 纯化方法的标准方法以高产量和高纯度生产[Sambook， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition - Cold Spring Harbor Laboratory Press (Januar 2001)]。赋予免疫刺激效应的修饰蛋白 质如N-甲酰化的细菌或异源蛋白质可如[Protein Expr Purif. 2003 Dec; 32 (2):317-22. Expression of N-formylated proteins in Escherichia coli. Spector S， Flyrm JM， Tidor B， Baker TA， Sauer RT〗所述生产。
来自抗体的蛋白质
抗体的Fc部分
来自抗原的蛋白质
来自中和抗体的抗原
诱导补体级联的抗原
来自自身免疫反应的抗原
已知通过在原核和真核宿主中异源表达生产这种蛋白质的众多方法。
来自细菌的含CpG的DNA 可釆用上述固相合成的方法。
病毒^ ^細 寡糖或多糖
含甘露糖的寡糖或多糖
来自酵母和细菌细胞壁的甘露聚糖和/或甘露糖残基(岩藻糖) 蠕虫的乳-N-岩藻戊糖III (L匿III)
修饰的寡糖或多糖 来自细菌的LPS 病原体上的糖脂样分子
刺激先天性免疫系统的小分子
咪唑奮啉类
磷酸胆碱
4.表3所列实施方案的生产
优选实施方案的生产如下所述。下面每一个项目指表3中的相应 项目。如下所列的结合体和效应体部分仅作为实例给出而并不意在限 制本发明的范围。结合体的其他实例于表l中给出。效应体的其他实 例已在上文给出("3.效应体的实例")。本领域技术人员知道如何 将结合体部分和效应体部分与其他结合体和效应体部分交换。尤其是 本领域技术人员知道如何调整肽固相合成的条件以适应其他序列的肽 的合成，以及如果多个不同肽序列需偶联至特定反应物或固体支持物 时如何调整化学偶联步骤。肽结合体线性聚乙二醇N-甲酰甲硫氨酸
通过固相合成的方法合成在C端携带单个唯一的赖氨酸残基的序 列为YHWYGYTPQNVIK的肽结合体。通过固相合成的方法合成在该肽C 端携带单个唯一的Cys残基的含N-甲酰甲硫氨酸的肽序列为 form-MMYALFC的效应体。多功能的活化马来酰亚胺-PEG-N-琥珀酰亚 胺酯(MAL-PEG-NHS) (NEKTAR产品目录，货号？E4M0H02 )作为连接 体分子提供。
通过在[Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法，结合体肽可首先与连接 体的NHS-部分反应而生成反应产物(YHWYGYTPQNVIK)-PEG-MAL。在这 些条件下，连接体的MAL-部分在缺乏巯基官能团的情况下基本是稳定 的。与赖氨酸残基的s-氨基偶联竟争，发生对该肽的氨基末端的偶联。 反应完成后，多余的离析物通过色镨法去除(Hermanson GT.， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996,228-245 )， 接着 纯化的反应产物YHWYGYTPQNVIK-PEG-MAL与效应体肽form-MMYALFC 反应而生成目标反应产物YHWYGYTPQNVIK-PEG- (form-MMYALFC)。
肽分支的聚乙二醇N-甲酰曱硫氨酸
通过固相合成的方法合成在C端携带单个唯一的赖氨酸残基的序 列为YHWYGYTPQNVIK的肽结合体。通过固相合成的方法合成在该肽C 端携带单个唯一的Lys残基的携带肽序列为form-MMYALFK的N-甲酰 曱硫氨酸的效应体肽。作为一种连接体分子，4-臂PEG-琥珀酰亚胺 戊二酸(货号P4SG-20， SunBio 57 Claremont Avenue, Orinda， CA94563, USA)作为活化的连接体提供。通过在[Hermanson GT.， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述 的标准生化方法，肽结合体和肽效应体同时与活化连接体反应。该反 应生成通用组成为(YHWYGYTPQNVIK) X-PEG-(form-MMYALFK)y的产物， 其中x+y 4。化学计量因子x和y由实验者通过适当地选择结合体肽 和效应体肽的起始浓度来决定。与对结合体肽赖氨酸残基的s -氨基偶联竟争，发生对该肽的氨基末端的偶联。
微生物蛋白质线性PEG: N-甲酰甲硫氨酸
通过[He-Shu Lu et al， Crystal Structure of Human Epidermal Growth Factor and Its Dimerization, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276， No. 37， Issue of September 14， pp. 34913 34917， 2001]中引用的方法，合成在C端携带一个赖氨酸残基的EGF 微生物蛋白质结合体。通过固相合成的方法，合成携带半胱氨酸残基 的、通用序列为form-MMYALFC的微生物蛋白质结合体。多功能的活化 马来酰亚胺-PEG-N-琥珀酰亚胺酯(MAL-PEG-NHS ) ( NEKTAR产品目录， 货号2E4M0H02 )作为连接体分子提供。通过在[Hermanson GT.， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述 的标准生化方法，结合体肽首先与连接体的NHS-部分反应而生成反应 产物EGF-PEG-MAL。在这些条件下，所述连接体的MAL-部分在缺少巯 基官能团的情况下基本是稳定的。与对肽赖氨酸残基的e-氨基偶联竟 争，发生对该肽的氨基末端的偶联。反应完成后，多余的离析物通过 色傳法去除(Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996, 228-245 )，接着纯化的反应产物EGF-PEG-MAL与效应体 肽form-MMYALFC反应而生成目标反应产物EGF-PEG- (form-MMYALFC)。
微生物蛋白质分支PEG: N-甲酰甲硫氨酸
通过[He-Shu Lu et al， Crystal Structure of Human Epidermal Growth Factor and Its Dimerization, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, No. 37， Issue of September 14， pp. 34913 34917， 2001]中引用的方法，合成在C端携带一个赖氨酸残基的EGF 微生物蛋白质结合体。通过固相合成的方法，合成携带赖氨酸残基的、 通用序列为form-醒YALFK的微生物蛋白质结合体。作为一种连接体分 子，4-臂PEG-琥珀酰亚胺戊二酸(货号P4SG-20， SunBio 57 Claremont Avenue, Orinda， CA94563, USA)作为活化连接体提供。 肽结合体和肽效应体同时与活化连接体通过在[Hermanson GT.， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法反应。该反应生成通用组合物为
(EGF)X-PEG-(form-匪YALFK)y的产物，其中x+y<=4。化学计量因子x 和y由实验者通过适当地选择结合体肽和效应体肽的起始浓度来决 定。与对肽赖氨酸残基的s-氨基偶联竟争，发生对该肽的氨基末端的 偶联。
肽模拟物结合体线性PEG: N-甲酰曱硫氨酸
通过[Nat Chem Biol. 2006 Jul; 2 (7): 381-9. Epub 2006 Jun 11， Combinatorial chemistry identifies high-affinity peptidomimetics against alpha (4)beta (1) integrin for in vivo tumor imaging. Peng L， Liu R， Marik J, Wang X， Takada Y， Lam KS.]中给出的方法合成针对ot (4) P (l)整合素的、携带氨基连接体的 肽模拟物高亲和力结合体。通过固相合成的方法合成在该肽C端携带 单个唯一的Cys残基的、携带序列为form-MMYALFC的肽的N-甲酰甲 硫氨酸的效应体肽。多功能的活化马来酰亚胺-PEG-N-琥珀酰亚胺酯 (MAL-PEG-NHS ) (NEKTAR产品目录，货号2E4M0H02 )作为连接体分 子提供。通过在[Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法，结合体肽首 先与连接体的NHS-部分反应而生成反应产物结合体-PEG-MAL。在这些 条件下，连接体的MAL-部分在缺乏巯基官能团的情况下基本上是稳定 的。与对赖氨酸残基的e-氨基偶联竟争，发生对该肽的氨基末端的偶 联。反应完成后，多余的离析物通过色语法去除(Hermanson GT.， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996, 228-245 )，接着 纯化的反应产物结合体-PEG-MAL与效应体肽form-MMYALFC反应而生 成目标反应产物合体-PEG- (f orm-MMYALFC)。
肽模拟物结合体分支PEG: N-甲酰甲硫氛酸
通过[Nat Chem Biol. 2006 Jul; 2 (7): 381-9. Epub 2006 Jun 11， Combinatorial chemistry identifies high-affinity peptidomimetics against alpha (4)beta (1) integrin for in vivo tumor imaging. Peng L， Liu R， Marik J， Wang X， Takada Y， LamKS.]中给出的方法合成针对ot (4) P (l)整合素的、携带氨基连接体的 肽模拟物高亲和力结合体。通过固相合成的方法合成在该肽C端携带 单个唯一的Lys残基的、携带序列为form-MMYALFC的肽的N-曱酰曱 硫氨酸的效应体肽。作为一种连接体分子，4-臂PEG-琥珀酰亚胺戊 二酸(货号P4SG-20， SunBio 57 Claremont Ave鹏，Orinda， CA94563 USA)作为活化连接体提供。肽结合体和肽效应体同时与活化连接体通 过在[Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法反应。该反应生成通用组合物为 (结合体)x-PEG-(form-MMYALFK)y的产物，其中x+y<=4。化学计量因 子x和y由实验者通过适当地选择结合体肽和效应体肽的起始浓度来 决定。与对赖氨酸残基的e-氨基偶联竟争，发生对该肽的氨基末端的 偶联。
DNA结合体线性PEG: N-甲酰甲硫氨酸
通过固相合成的方法合成在3'端携带单个唯一巯基的、通用序列 为Nx-间隔体-SH的DNA适体。通过固相合成的方法合成在该肽碳携带 带单个唯一的LyS残基的、肽序列为form-MMYALFK的N-甲酰甲硫氨 酸肽。多功能的活化马来酰亚胺-PEG-N-琥珀酰亚胺酯(MAL-PEG-NHS) (NEKTAR产品目录，货号2E4M0H02)作为连接体分子提供。通过在 [Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法，效应体的C端赖氨酸首先与连 接体的NHS-部分反应而生成反应产物form-MMYALFK-PEG-MAL。在这些 条件下，连接体的MAL-部分在缺乏巯基官能团的情况下基本上是稳定 的。反应完成后，多余的离析物通过本领域技术人员公知的色镨法去 除，接着纯化的反应产物form-MMYALFK-PEG-MAL与DM适体NNNNN-间隔体-SH反应而生成目标反应产物form-躍YALFK-PEG-间隔体 -NNNNN。
DNA:分支PEG: N-曱酰甲硫氨酸
通过固相合成的方法合成在3'端携带单个唯一巯基的、通用序列 为Nx-间隔体-SH的DNA适体。通过固相合成的方法合成在该肽C端携带单个唯一的Lys残基的、携带序列为form-匪YALFC的肽的N-甲酰 甲硫氨酸的效应体肽。作为一种连接体分子，4-臂PEG-琥珀酰亚胺 戊二酸(货号 P4SG-20， SunBio 57 Claremont Avenue, Orinda， CA94563， USA)作为活化连接体提供。肽结合体和肽效应体同时与活 化连接体通过在[Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法反应。该反应 生成通用组合物为(form-MMYALFK)y-PEG-(间隔体-N丄的产物，其中 z+y<-4。化学计量因子x和y由实验者通过适当地选择结合体肽和效 应体肽的起始浓度来决定。
肽线性PEG: N-甲酰甲硫氨酸肽模拟物
通过固相合成的方法合成在C端携带单个唯一的赖氨酸残基的、 序列为YHWYGYTPQNVIK的肽结合体。通过固相合成的方法合成在其C 端携带单个唯一的半胱氨酸残基的、携带序列为form-M-XnC的肽模拟 物的N-曱酰甲硫氨酸。多功能的活化马来酰亚胺-聚乙二醇-N-琥珀酰 亚胺酯(MAL-PEG-NHS) (NEKTAR产品目录，货号2E领0H02 )作为连 接体分子提供。通过在[Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法，结合体肽首 先与连接体的 NHS-部分反应而生成反应产物 (YHWYGYTPQNVIK)-PEG-MAL。在这些条件下连接体的MAL-部分在缺乏 巯基官能团的情况下基本上是稳定的。与对赖氨酸残基的s-氨基偶联 竟争，发生对该肽的氨基末端的偶联。反应完成后，多余的离析物通 过色镨法去除(Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996, 228-245 )， 接着纯化的反应产物 (YHWYGYTPQNVIK) -PEG-MAL与肽模拟物效应体form-M-XnC反应而生成 目标反应产物(YHWYGYTPQNVIK) -PEG- (form-M-XnC)。
肽线性PEG:小分子通过上述方法和本领域技术人员公知的方 法将小分子偶联于线性PEG。
多价效应体树状聚体
如Kantchev et al. (Biopolymers. 2006; 84 (2): 232-40)中所详述，纯的、单分散的第三代甘露糖化多聚L-赖氨酸树状聚体-舦缀 合物可采用直接、仪器辅助的Fmoc/t-Bu固相肽合成来制备，以提供 多价效应体树状聚体。
统计偶联至高分子量聚合物骨架的结合体和效应体 采用 [Ulbrich K. et al.; Polymeric drugs based on conjugates of synthetic an natural macromolecules， J. of Controlled Release, 64， 2000， 63-79]中给出的实验步骤，通过共 聚化N-(2-羟丙基)曱基丙烯酰胺和通用组合物为MA-(Xn)-oNP的甲 基丙稀酸(metacryloyl)-肽-4 -硝基苯脂制备聚合物前体。通过固 相合成的方法合成在C端携带单个唯一的赖氨酸残基的、序列为 YHWYGYTPQNVIK的肽结合体。通过固相合成的方法合成在该肽C端携 带单个唯一的Lys残基的、携带序列为form-MMYALFK的肽的N-甲酰 甲石克氨酸的效应体肽。通过[Ulbrich K. et al.; Polymeric drugs based on conjugates of synthetic an natural macromolecules, J. of Controlled Release, 64， 2000， 63-79]中给出的方法，随后该 聚合物前体依次与结合体肽和效应体肽发生反应，此反应为与该聚合 物oNP部分发生的胺解反应。该反应的产物是结合体和效应体功能统 计学分布的稳定的高分子量聚合物药物，其中聚合物的平均结合体和 效应体置换级别由在制备聚合物前体结合体和效应体基团的胺解偶联 实验中选择的反应物浓度所决定。
元件的共聚作用(丙烯酸甲酯(meth-acrylate)) a)釆用[Ulbrich K. et al.; Polymeric drugs based on conjugates of synthetic an natural macromolecules, J. of Controlled Release, 64， 2000， 63-79]中给出的实验步骤，通过共 聚化N-(2-羟丙基)曱基丙烯酰胺和通用组成物为MA-(YHWYGYTPQNVI) 的metacryloyl-结合体肽-4 -硝基苯脂以及通用组合物为 form-MMYALF-MA的metacryloyl-效应体肽-4 -硝基苯脂来制备聚合 物前体。该反应的产物是结合体和效应体功能统计学分布的稳定的高 分子量聚合物药物，其中聚合物的平均结合体和效应体置换级别由在聚合物制备实验中选择的反应物浓度所决定。
b) 采用 [Jackson DC, Free radical polymerisation of synthetic peptides into polymeric immunogens， Vaccine, 15(15)， 1697-1705， 1997]中给出的实验步骤，合成在N端携带一个丙烯酰基残 基的、序列为Acryloyl-YHWYGYTPQNVI的肽结合体。采用[Jackson DC， Free radical polymerisation of synthetic peptides into polymeric immunogens, Vaccine, 15(15)， 1697-1705， 1997]中给出 的实验步骤，合成在N端携带一个丙烯酰基残基的、序列为 Acryloyl-YHWYGYTPQNVI的肽效应体。通过[Jackson DC, Free radical polymerisation of synthetic peptides into polymeric immunogens Vaccine, 15(15)， 1697-1705， 1997]中给出的实验步骤，将肽结合体 和效应体肽共聚化以生成活性聚合物。
肽结合体多聚赖氨酸甘露糖残基
a) 采用[Kantchev EAB et al. ， Direct Fmoc/tert-Bu solid phase synthesis of Octomannosyl Poylylsine dendrimer-peptide conjugates, Biopolymers. 2006; 84 (2): 232-40]中给出的方法,以 YHWYGYTPQNVI部分作为结合体肽，多聚赖氨酸作为连接元件以及甘露 糖残基作为效应体元件，合成通用组合物为YHWYGYTPQNVI-(多聚赖氨 酸-树状聚体)-(甘露糖基)8的活性物质。
b) 采用[Kantchev EAB et al. ， Direct Fmoc/tert-Bu solid phase synthesis of Octomannosyl Poylylsine dendrimer-peptide conjugates, Biopolymers. 2006; 84 (2): 232-40]中给出的方法，以 YHWYGYTPQNVI部分作为结合体肽，多聚赖氨酸作为连接元件以及 form-MMYALF作为效应体肽，合成通用组合物为YHWYGYTPQNVI-(多聚 赖氨酸-树状聚体)-(f orm-MMYALF) 8的活性物质。
c) 采用[Kantchev EAB et al., Direct Fmoc/tert-Bu solid phase synthesis of Octomannosyl Poylylsine dendrimer-peptide conjugates, Biopolymers. 2006; 84 (2): 232-40]中给出的方法，以 YHWYGYTPQNVI部分作为结合体肽，多聚赖氨酸作为连接元件以及form-MMYALF作为效应体元件，合成通用组合物为YHWYGYTPQNVI-(多 聚赖氨酸-树状聚体)-(f orm-醒YALF) 8的活性物质。
d)采用[Kantchev EAB et al. ， Direct Fmoc/tert-Bu solid phase synthesis of Octomannosyl Poylylsine dendrimer-peptide conjugates, Biopolymers. 2006; 84 (2): 232-40]中给出的方法,以 YHWYGYTPQNVI部分作为结合体肽，多聚赖氨酸作为连接元件以及 WKYMVm作为效应体元件，合成通用组合物为WKYMVm-(多聚赖氨酸-树 状聚体)-(YHWYGYTPQNVI) 8的活性物质。
肽结合体线性PEG: N-甲酰甲硫氨酸
通过固相合成的方法合成在C端携带单个唯一的赖氨酸残基的、 序列为YHWYGYTPQNVIK的肽结合体。通过固相合成的方法合成在该肽 C端带单个唯一的赖氨酸残基的、携带序列为form-MMYALFK的肽的N-甲酰甲硫氨酸的效应体肽。双功能的活化N-琥珀酰亚胺酯-PEG-N-琥 珀酰亚胺酯(NHS-PEG-NHS ) ( NEKTAR产品目录，货号4K4K0L02 )作 为连接体分子提供。结合体肽和效应体肽同时与连接体分子通过在 [Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996] 中详述的标准生化方法反应。反应完成后，所产生的 (YHWYGYTPQNVIK-PEG- (form-MMYALFK) 、 YHWYGYTPQNVIK-PEG- (YHWYGYTPQNVIK) 、 form-MMYALFK-PEG-(form-MMYALFK) 、 YHWYGYTPQNVIK-PEG 、 form-MMYALFK-PEG)分子产物物质的混合物以及多余的离析物通过 本领域技术人员公知的标准色镨法分离，以分离目标产物 YHWYGYTPQNVIK-PEG- (form-MMYALFK)。
肽线性PEG: 肽模拟物类FPRL2结合体
通过固相合成的方法合成在C端携带单个唯一的赖氨酸残基的、 序列为YHWYGYTPQNVIK的肽结合体。通过固相合成的方法合成在其C 端携带单个唯一的Cys残基的、序列为(Xn)C的肽模拟物FPRL2结合体 (见参考文献Migeotte I. et al. ， Identification and characterization of an endogenous chemotactic ligand specificfor FPRL2 The Journal of Experimental Medicine Vol. 201， No. 1， January 3， 2005 83 - 93 )。多功能的活化马来酰亚胺-PEG-N-琥 賴酰亚胺酯(MAL-PEG-NHS) (NEKTAR产品目录，货号2E4M0H02 )作 为连接体分子提供。通过在[Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245〗中详述的标准生化方法， 结合体肽首先与连接体的NHS-部分反应而生成反应产物 (YHWYGYTPQNVIK)-PEG-MAL。在这些条件下连接体的MAL-部分在缺乏 巯基官能团的情况下基本上是稳定的。与对赖氨酸残基的e -氨基偶联 竟争，发生对该肽的氨基末端的偶联。反应完成后，多余的离析物通 过色i普法去除(Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996,228-245 )， 接着纯化的反应产物 (YHWYGYTPQNVIK)-PEG-MAL与肽模拟物FPRL2结合体反应而生成目标 反应产物(YHWYGYTPQNVIK) -PEG- ((Xn) C )。 肽线性PEG:具C端D-Meth的肽
通过固相合成的方法合成在C端携带单个唯一的赖氨酸残基的、 序列为YHWYGYTPQNVIK的肽结合体。通过固相合成的方法合成在该肽 模拟物效应体C端携带一个D-甲硫氨酸(m)残基并且在N端携带单 独唯一的Cys残基的、序列为CWKYMVm的效应体肽[见参考文献Yang D， Chen Q， Gertz B， He R， Phulsuksombati M， Ye RD， Oppenheim JJ.， Human dendritic cells express functional formyl peptide receptor-like-2 (FPRL2) throughout maturation, J Leukoc Biol. 2002 Sep; 72 (3) : 598-607]。多功能的活化马来酰亚胺-PEG-N-琥珀酰 亚胺酯(MAL-PEG-NHS) (NEKTAR产品目录，货号2E4M0H02 )作为连 接体分子提供。通过在[Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996， 228-245]中详述的标准生化方法，结合体肽首 先与连接体的 NHS-部分反应而生成反应产物 (YHWYGYTPQNVIK)-PEG-MAL。在这些条件下连接体的MAL-部分在缺乏 巯基官能团的情况下基本上是稳定的。与对赖氨酸残基的s-氨基偶联 竟争，发生对该肽的氨基末端的偶联。反应完成后，多余的离析物通过色i普法去除(He簡nsonGT.， Bioconjugate techniques, Academic Press1996,228-245 )， 接着纯化的反应产物
(YHWYGYTPQNVIK)-PEG-MAL与序列为CWKYMVm的效应体肽反应而生成
目标反应产物(Y鼎YGYTPQNVIK) -PEG- (CWKYMVm)。 固相合成的树状聚体
通过固相合成的方法合成在结合体肽的C端连接了聚乙二醇间隔 体(Novabiochem，货号01-63-0150 Fmoc-NH-(PEG) 27-COOH )、序 列为YHWYGYTPQNVIK-PEG-COOH的结合体肽。将该肽以未脱保护状态从 固相支持物上剪切下来。通过固相合成的方法合成效应体肽的C端连 接了聚乙二醇间隔体(Novabiochem, 货号 01-63-0150 Fmoc-NH-(PEG) 27-COOH)、序列为form-MMYALF-PEG-C00H的N-甲酰 甲硫氨酰效应体肽。将该肽以未脱保护状态从固相支持物上剪切下来。
通过[Kantchev EAB et al. ， Direct Fmoc/tert-Bu solid phase synthesis of 0ctomannosyl Poylylsine dendrimer-peptide conjugates, Biopolymers. 2006; 84 (2): 232-40]中给出的方法合成 多聚赖氨酸树状聚体。保护的结合体肽(YHWYGYTPQNVIK-PEG-COOH)和 保护的效应体肽(form-匪YALF-PEG-COOH)同时与多聚赖氨酸树状聚体 反应而生成目 的反应产物 (form-MMYALF-PEG)x-COOHPolylys ine-(YHWYGYTPQNVIK-PEG-COOH)y ，其中通用化学计量系数x和y由所选择的实验条件和结合体和效应 体浓度决定。
线性肽缀合物
在另 一种方法中，通过本领域技术人员公知的方法合成肽缀合物。 该化合物包含一个或多个结合体肽、连接体肽以及一个或多个效应体 肽，所有这些都由肽键连接。在一个优选实施方案中，效应体肽是 f orm-画YALF ，连接体肽是多聚赖氨酸K(n)，结合体肽是 YHWYGYTPQNVI。优选合成序列为form-MMYALF-(K) n-YHWYGYTPQNVI的 线性肽缀合物，其中n在范围0-50以内，优选在范围0-10以内。在 n = 0的情况下，结合体和效应体两部分由单个肽键连接。在另一个优选实施方案中，效应体肽是甲酰-Met-Leu-Phe(fMLP),连接体肽是 多聚赖氨酸K(n)，结合体肽是AWYPLPP，其中n在范围0-50以内，优 选在范围0-10以内。 分支肽缀合物
在另一种方法中，通过本领域技术人员公知的方法合成肽缀合物， 其包含由肽键和酰胺键连接的一个或多个结合体肽、连接体肽以及一 个或多个效应体肽的。选择form-MMYALF为效应体肽，多聚赖氨酸K (n) 为连接体肽，YHWYGYTPQNVI为结合体肽，合成序列为 form-MMYALF-(K)n-y鼎YGYTPQNVI的线性肽缀合物，其中n在范围 1-50以内，优选在范围1-10以内。作为第二底物，结合体肽 YHWYGYTPQNVI通过本领域技术人员公知的方法合成。随后结合体肽通 过如 Hermanson et al， 1996 (Hermanson GT. , Bioconjugate techniques, Academic Press 1996)中详述的CDI偶联与线性肽缀合 物反应，在连接体区域赖氨酸残基的e氨基官能团和结合体肽的羧基 末端间产生酰胺键，生成通用组合物为 form-MMYALF-(K)n-(YHWYGYTPQNVI)m-YHWYGYTPQNVI的分支肽缀合 物，其中n在l到50范围内，优选在1到10范围内，m在l到n范 围内。分枝数m由实验者通过选择反应条件尤其是改变底物浓度来决 定。
通过化学偶联固相合成的分支肽
根据Tam et al， 1988 (Tam， J, P. ， PNAS USA 85， 5409-5413， 1988)通过固相合成来合成携带偶联至三层赖氨酸核心的8个序列为 NH2-MQLPLAT-C00H的结合肽的多肽树状聚体。通过固相合成的方法合 成序列为form-MLP-C00H的效应体肽。随后效应体肽通过如Hermanson et al， 1996 (Hermanson GT. ， Bioconjugate techniques, Academic Press 1996)中详述的CDI偶联与分支肽树状聚体反应，在结合体肽树 状聚体的oc氨基和效应体肽的羧基末端间产生一个酰胺键，生成通用 组合物为(fMLP) m-(MQLPLATGGG) 8-00 4-(K) 2-K-betaA的分支肽缀合 物。分枝数m由实验者通过选择反应条件来决定，导致效应体肽对结合体肽树状聚体的次化学计量偶联。 固相合成的分支肽
采用Sheridan et al. (Sheridan JM， Hayes GM， Austen BM.， Pept Sci. 1999 Dec; 5 (12): 555-62)中所述方法，通过固相合成直接制备 分支肽。在肽合成中以Dde保护的赖氨酸残基作为分支点，合成含效 应体fMLP-C00H和两个结合体NH2-MQLPLAT-COOH 、化学式为 fMLPK- (NH2-MQLPLAT) -GGGK- (NH2-MQLPLAT) -I-COOH的分支缀合物。
试剂Tl(tfa)3 (Sigma: Aldrich， UK) 、 Fmoc-氨基酸(PE Appl ied Biosystems，UKandAlexisCorporation,UK) 、 PyBOP (Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, UK) 、 ？K合肼(Sigma: Aldrich)， 1% TNBS:DMF以及乙酸酐(Fluka Chemicals, UK)。所有溶剂(以及 DIEA)均购自Sigma: Aldrich.
釆用固相Fmoc: tBu方法，在设定好的Mi 11 igen 9050仪器上， 在DMF中预溶胀的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(0. 19 mmol: g) (PE Applied Biosystems)连续流动下，进行45分钟的Fmoc-氨基酸PyBOP: DIEA 偶联和9分钟的Fmoc脱保护反应(在含20V底梵的DMF中，v: v )。 Fmoc 脱保护在365nm处监测。当需要时，用TNBS来判断偶联或乙酰化是否 完全。采用2%肼DMF (v:v)以每分钟3 ml通过直径1 cm的反应柱 在连续流动下完成Lys (Dde)的选择性脱保护。Dde的去除在365nm 处监测，并以TNBS证实，然后用DMF洗涤肽树脂。最终的从树脂上剪 切和TFA-不稳定保护基团的去除采用95% TFA:2. 5% TIS: 2. 5% H20 (v:v)的混合物室温反应2小时。通过过滤去除剪切的树脂，用4ml 纯TFA洗涤两次，总的滤过物蒸发至2ml。加入冰二乙醚(40ml )使 肽沉淀，将混合物以lOOOrpm离心5分钟。倒出该醚溶液，再进行4 次乙醚抽提。分析高效液相色镨在Nucleosil 5 C8 300 (150-4.6 mm) 柱上以溶剂A 0. 1% aq. TFA和B 0. 1% TFA:乙腈(v: v)的梯度，每 分钟lml运行并采用215nm UV监测。制备HPLC在Vydac C4柱(Hichrom Ltd, UK)上使用相同的溶剂运行，并采用225nm UV监测。反应完成 的程度通过HPLC area估算。线性肽form-M-L-P-K(Ddee)-G-G-G-K(Dde)-I-PALPEG-PS的制 备Fmoc-氨基酸:Py-BOP: DIEA以4: 4: 8的w. r. t ,1肽-树脂比例 依次偶联至树脂。第一个Ile二偶联至树脂。该保护的肽-树脂用作铰 链-环肽的两个合成路线的起始材料。
向 线 性 效 应 体 环 肽 f ormy 1-M-L-P-K (Ddee) -G-G-G-K (Dde) -I-PALPEG-PS添加结合体肽如 所述制备并于DMF中溶胀，如上所述在连续流动下进行Lys ( Dde )的 选择性脱保护。接着氨基酸(Fmoc-氨基酸PyBOP:DIEA为8:8:16 w. r. t匪ol肽-树脂)在连续流动下依次偶联。用DMF、 DCM和MeOH 将树脂洗涤3遍，再于高度真空下干燥5小时。最终的剪切和粗肽的 分离采用如上的TFA混合物和二乙醚抽提实现。
II.测定法
1. 甘露糖受体激活的评估
测定甘露糖、甘露聚糖、含甘露糖的分子、岩藻聚糖、多聚乌苷 酸(polyG)化学修饰和未修饰的低密度脂蛋白(LDL)或任何其他潜 在效应体分子的激活潜力可采用多种方法。它们中的一些聚焦于MBL (甘露糖结合凝集素)、MR (甘露糖受体)或清道夫受体(SR ) SR-A和 SR-B的可能结合。
它们中的一些使用完整免疫细胞但不知道哪种机制对这些细胞的 激活是重要的。例如，由PAMP刺激的单核细胞和MDM (单核细胞来源 的巨噬细胞)的胞内细胞因子的生成是一种合适的方法[Mytar B; Inflamm Res. 2004 Mar; 53 (3): 100-6. Epub 2004 Feb 16]。
结合和内化测定可通过使用甘露糖标记的分子实现[Lew D B ;J Clin Invest. 1994 Nov; 94 (5): 1855-63]。
2. FPR受体的激活
国际公开的WO0031261 Al中描述了 一种适合筛选可能诱导 FPRL-l受体信号传导的多肽或非肽类化合物的方法。其中所描述的分析法可对加强由FPRL-1受体和激活剂相互作用产生的诱导反应的受试化合物评分。
WO0031261中描述的方法可用于鉴定可能修饰FPR尤其是FPRL-1响应的效应体。
3.免疫调节物质的活性监测
为评估可能的效应体的活性，可监测先天性免疫系统的不同类型细胞的激活。
为测定可能的效应体(例如N-甲酰甲硫氨酸肽、C-D-甲硫氨酰肽、未修饰或修饰的肽)的活性，可采用多种方法，它们中的一些使用已知受体FPR (甲酰肽受体)、FPLR1 (曱酰肽样受体)和/或FPLR2， 一些使用完整免疫细胞但不知道哪种机制对这些细胞的激活是重要的。
例如，趋化现象和Ca (2 + )动员是测定树突细胞激活的多个体外分析法中的重要读取参数[Yang， D. et al. ; J Leukoc Biol. 2002Sep;72 (3): 598-607， Migeotte， I. et al; J Exp Med. 2005 Jan;201(l):83-93]。此外，cAMP浓度测定、p-氨基己糖苷酶分泌或结合的分析法适用于测定树突细胞的激活[Migeotte， I. et al; J ExpMed. 2005 Jan; 201 (1): 83—93; Haribabu B et al.; J Biol Chem.1999; 274: 37087 - 37092]。后面的方法经特异结合表达FPR的细胞的荧光交联结合体而改进[Mills， JT S et al.; J Biol Chem 1998 Apr;273 (17): 10428 - 10435]。该方法中使用了表达FPR的人重组细胞(CHO)。
也有不同细胞系可供测定免疫调节物质的活性。细胞系例如表达人N-甲酰肽受体FPR或其两个同源物(FPRL1， FPRL2)的HL-60[Rabiet， M J; Eur J Immunol. 2005 Aug; 35 (8): 2486-95]或可通过这些受体触发胞内信号传导的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞系(FPRFPRL1) [Haribabu Betal.; J Biol Chem. 1999; 274:37087 - 37092]。此外，测定免疫调节物质的活性的体内实验也有描述，如小鼠的气嚢实验[Chen， Q ;J Immunology. 2004; 173: 2652 - 2659]。III.含甲酰曱硫氨酸肽为效应体，结合于肝癌细胞的两个肽为结合体的化合物
肽序列AWYPLPP特异识别并结合肝癌细胞(Wei-Dong Jia et al，Cancer Lett. 2006， Jun 24)。因此该肽序列用作结合体。序列为fMLP的曱酰甲硫氨酸肽用作效应体。
以类似上述的方法(I. 4.;"固相合成的分支肽")合成含肽序列AWYPLPP作为结合体的分支肽化合物。该合成反应生成化学式为fMLPK-(NH2-AWYPLPP)-GGGK-(NH2-AWYPLPP)-I-COOH 、 含效应体fMLP-COOH和两个结合体NH2-AWYPLPP-COOH的分支缀合物，这两者中，
靶结构相互作用。' ' '" - '
通过在断奶的种系13雄性豚鼠(NIH) ip (腹膜内)传代增殖肝细胞瘤细胞。通过所述的酶消化法制备单细胞悬液。种系13雄性豚鼠腹膜内注射约2xi(T个肝细胞瘤细胞的悬液以产生实体瘤(第1天)。动物分成4组(每组6只动物)，在第5天给予腹膜内注射磷酸盐緩冲盐溶液(PBS)(组 1; 对照)；每只动物 1 mg肽NH2-AWYPLPP-C00H (组2;仅结合体)；每只动物1 mg肽fMLP-C00H(组 3; 仅效应体)；每只动物 1 mg 化合物fMLPK-(NH2-AWYPLPP)-GGGK-(NH2-AWYPLPP)-I-C00H (组4)。在第15天处死动物,切下肺瘤并称重。另外，评估肿瘤的巨噬细胞浸润。于是，肿瘤于磷酸盐緩沖的福尔马林中固定并包埋于蜡块中。切成5ym的切片，进行非特异酯酶活性染色。用图像分析仪对酯酶阳性细胞定量(Optomax， Inc.)。
典型作用示于
图1和图2中。来自组4 (在第5天注射化合物)的豚鼠的肿瘤中的酯酶阳性细胞数与对照组l(PBS)比较显著增加。来自组2 (仅结合体)动物的肿瘤中的巨噬细胞与组1相当。来自组3(仅效应体)动物的肿瘤中的酯酶阳性细胞也略有增加，但作用没有组4 (化合物)中的显著。组4 (注射化合物)动物的肺瘤平均重量与对照组1 (PBS)比较显著降低。组2 (仅结合体)和组3 (仅效应体)在肿瘤大小方面未表现出或仅表现出边缘效应。
本发明具以下优势，尤其是使用合成结构时
-价格低廉并且化学合成简单
-扩大化简单
-因为药物的化学性质(合成化合物)而批准时间更短-运用标准技术生产结合肽，例如噬菌体展示(快速，对正确的组合更灵活)
一化合物合成可采用灵活的结合和效应体官能团及强度(结合体)x-(效应体)y，其中x和y >= 1
-从单价到多价效应体官能团的灵活性
-可以设计多种多价结合体(树状聚体或分支PEG)
-由于体积小以及聚乙二醇化而无免疫原性
-通过篩选和优化(i)低复杂度的小肽以及(ii)设计具单价或多价结合体的骨架而极灵活地调节开关比率(On-/0ff-rate)和结合常数
-每个化合物的效应体数量可通过如下方法确定只有结合至乾细胞后，效应体的浓度才高到足以诱导免疫应答(a:效应体结合受体的强度；b:多价)
-半衰期可通过附着不同大小的PEG、结合于保持(retainer)分子以及由于稳定性而改变
-由于(i)体积小，(i i)如PEG等连接体的影响以及(i i i)结合体和/或效应体部分肽序列的亲水和疏水含量而具有更好的组织穿透性表l:优选结合体实例
结*
CGLIIQKNECCNAGES腦CDhb-pLDIK
Dhb-pLDI
WIFPWIQL
WDLA,RLPVG
WISYSMPD
环(RG卿
RG酬
GGHGRVLWPDGWFSLVGISPYHWYGYTPQNVI
把向的癌细l&ll:
型(选##)
糾示衬
纤维蛋白-纤连蛋白复M
纤维蛋白-纤连蛋白复M
cc-4-P-l齡人T细齡B细素(齡素受体)細姚巴瘤
cc-4十1齡人T细胁B细素(^l:受体)舰稀巴瘤
葡萄糖调节的蛋白78 (G固)葡萄,节的蛋白78 (GRP78)cc-v-P-5齡素
cc卞P-3齡素
ct卞P-3素
CLL细胞
EGFREGFRvIII
把向的肿瘤/癌类型(选糊肿瘤诱导病灶处的 血浆肿瘤诱导病灶处的麟血浆非霍奇金
淋巴瘤(NHL)非霍奇金
淋巴瘤(NHL)
亲和力(kD)
TACHQHVRMVRP
肝酉淺白AM^彌 EphA2受体
受体(gp80、CD126)
NL讓S Tie2DUP-1
肝癌细
(BEL-7402
BEL-7404
S謝C-7721
H印G2)
前列輙异膜抗原阴性细胞(DU-145)
5—50 nM
5—50 nM
0.9 nM
参考文献
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al, 2003Janssen et al,2002
胞
前列腺癌
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Su et al 2005
Tournaire 2004
Zitzmann， 2005HEWSYLAPYPWFHTFEPGV
环,srap)
KCCYSLLTVXPWYCSDSWHYWC
CSDxxHxWC
EDYELMDLLAYL
环(C腦NSSC)TTPRDAYVHLGYATCSN隨RCCXNXDXR(X)/(R)C
SWKLPPS
IAGLATPGWS,L
AWYPLPP
VPWMEPAYQRFL
鄉受体
AitJj^WiDr
细胞人甲:l^^舰癌(虹C M t生的TT
细胞原发的原位生长的鼠MTCs
结肠癌
甲W癌
Her-2 (AErbB-2)
Ait管内皮细胞生长因子受体3
(VEGFR-3)Ajfe管内皮细胞生长因子受体3
(VEGFR-3)
SKBR3孝M^癌细胞
曱她癌
孕IJ^癌、淋巴瘤、麟癌、卵巢癌 癌.
多种人类癌症
多种人类癌症
滤泡性曱W癌、间变曱
癌、孚U^癌症、宫颈癌、前列腺癌症
HCC结肠癌膀鹏
膀鹏
胃癌的多个MW瘤
人PC-3前列腺癌前列腺癌
MCF7细败FR082-2细胞
AJt瘤内皮细胞(TEC)
(HCC)细胞结肠癌细胞(SW480; HT29)膀旨瘤内皮细胞
膀旨瘤内皮细胞
高度絲的AJf细鹏(HCC)细胞
A^t经母细舰细胞WAC2、吝源癌细胞廳-MB-435
HCC
神经母细餘餘癌
30 |jM
Hasmuss叫
2002
Bockma叫2005
Bockmann, 2005
Karasseva etal， 2002
Shadidi et al，
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Xin et al， 2007Xin et al， 2007
0. 6 jjM
Zitzraann et al，2007
Bussolati et
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2(L ,Se卿-Min Leeet al， 2007Seung-Min Leeet al, 2007
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Askoxylakis etal, 2005EPAYQR
KSLSRHDHIHHH
TNSLP YYGLAEVDAGGS
MQLPLAT
證P
A^中经母细麟 细胞WAC2、魏 癌细胞 MDA4ffl-435
靖细舰 (HCC)细胞
结M肿瘤(癌)
细胞 絲卵巢癌细胞 系A2780
神经母细 餘贿 癌
HCC
结肠癌 卵巢癌
0.25 nM
FGF受体 SK0V3细胞 印巢癌(如果是
多价)
FGF受体 SK0V3细胞 卵巢癌
Askoxylakis et
al， 2006; Askoxylakis et al， 2005 Yong~Qiang Jiang et al，
2006 Maruta et al，
2003 Wang et al, 2003
Maruta et al， 2002
Maruta et al， 2002表2:靶分子的实例
标t浙
c咖
同类物
Genbank索 取号
HER2
匪
CD33 CD22
CD52
HLA-DR-
,的
敏4目
原 贼白 17-1A
EGFR-2、 ErbB2、 c-erbB2 (erbB家 銜、Her2~neu
EGFR; EGFR-1 (erbB ，； ErbBl、,
MI 1730
B细胞受体CD22-B亚型 NP-001762.1
狄于
B细胞
浮腺、肺、 、 卵縣
结肠、头/颈、 卵巢、m、癌、 NSCLC、她癌、
贼母细麟
肺瘤细胞、正常
B细胞
白细胞、B和T 淋巴细胞
癌
B细舰 巴瘤、非霍 奇金淋巴 瘤
25-30%的 脱她
癌、淋e^！ 结，癌 急性骨髄
细胞白血
病(肌)
B-cell Leukemics 慢'性淋巴 细胞白血 病(CLL)
淋巴瘤细胞 淋巴瘤
￡ ^^发的药物
Rituxan (Mabthera , Rituximab); Zevalin (Inlll+Y9(Hbritumomab); Bsxxar (1131-Tositumomab) Herceptin (Trastuzumab); Pertuzumab (Omnitarg)
Erbitux (Cetuxi腿b， IgGl); Panit咖omab (IgG2); Matuzumab (IgGl)
Mylotarg (Gemtuzumab)
LymphoCide
MabCampath (Alemtuzumab)
Oncolym (Lym~l)
结肠腺癌 结JU3^癌 Panorex (Edrecolo咖b)
BMPRIB
E16 STEAP1 0772P
MPF
Napi3b
Se咖5b
骨形态胜蛋白受体-IB型 LATl、 SLC7A5 前列腺六 *^絲 CA125、隨6 MSLN、 SMR、巨核细麟强因子、
间皮素Onesothelin) 函-3B、 NPTIIb、 SLC34A2、絲 ife^蛋白5MU4 (^^#1)、成员 2、 II型钠离^f^'l42^^蛋白3b FLJ腦2、 KI編45、 Mm 42015、 SEMA5B、 SEMAG、，号蛋白5b Hlog、 sema结构域、七个血小板 ^S素重复(1型和类1型)、^M 结构域0W) ^tlfe内结构域、 ,号蛋白)5B
NM-001203 NM-003486 则12449 AF36訓
NM-005823
NM-006424
AB0備8PSCA hlg
ETBR MSG783
STEAP2
TrpM4
CRIPTO CD21 CD79b
FcRH2
NCA
MDP IL20Ra 短蛋白
歸 Ep隨 ASLG659
PSCA
GEDA
BAFF-R CD79a
CXCRS
2700050C12Rik, C530008016Rik、 R鹏cDNA 2700050C12、 R聽 cDNA 2700050C12 gene 内皮素B型受体 RNF124、 ^fS^蛋白FU20315 HGNC~8639、 IPCA-1， PCANAP1、 STAMP1、 STEAP2、 STW、前列腺癌 相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、 前列腺六^^1絲2、六跨膜 前列腺蛋白 朋22450、 FLJ20041、 T腦4、 TRPM4B、瞬时受体电位阳离^"iiil
亚家埃M成员4 CR、 CR1、 CRGF、 CRIPTO、 TDGF1、
畸月辅来源生长因子 CR2 (4琳受体2)或C3DR (C3d/EB
病4^t体)或Hs. 73792 CD79ss、 IGb瞎球蛋白关联
P)、 B29 IFGP4、 I腦、SPAP1A (含SH2 结构域的磷脂S^S"白)、SP薦、 SPAP1C
AY275463 NM-017763
AF455138
NM-017636
NP 003203; NM — 003212
M26004 NM-000626
NM~ 030764
M18728 頭7023 AF184971
AF229053
NM-004442 翩2328 AJ297436 AY260763
NP-443177.1
HLA-DOB
B细!^^因子受体、BLyS受体3、 肌3
免疫i^蛋白关联oc, "^t与Igp (CD79B) ^bf目互作用的^面与 NP ~ IgM^f^Al糾，转导MB 001774.1 细lfe^fWt号的B细;ife^^白 伯奇^C^受体1，由CXCL13 趋化因W^的""^t G蛋白m 受体,M巴细lfei^^W^御 NP~ 中fef^用，M HIV-2 4緣以及可 001707.1 肯,AIDS、淋巴瘤、骨ft^l和
白血病的^A 结合肽并将其_1^^04+ T淋巴 细胞的主^|^5^目容|±1# II NP-002111.1 衬師)的P亚雞
B细胞
淋巴瘤、骨 鍵痏和白 血病P2X5
CD72
LY64
謂l
IRTA2
TENB2
^&:细 魁成 素受体
Thy 1. 2
PSMA
LHRH受
体
CEA Ep~CAM GRP78
^"^体P2X商沐门控的离预 道5, "^t由妙卜ATP门控的离子
可肯!M^IW^Wt^C NP-002552.2 生,絲陷可能^JU^发'liit^
;r^t定的病S!A理学
B细l^fm^ CD72、 Lyb"2NP-001773.1 淋巴细lfeii^64 (RP105),富亮 ^t^重狄列(LRR)絲的I型膜 蛋白，调控B细l^t^调亡，其NP-005573.1 功能败与系统'I4^鄉良疳病人
的^'^增;M目关 Fc受fl^白1, "^f含C2型Ig 桥^ITAM结构域的免疫球蛋白Fc
NP—斗斗31了G 1 结构域的做受体，可負,B .
淋巴细^f匕
免疫球蛋白^l^受体置^:联
2, ~"^hr*, b细败育和淋
巴瘤^A的^JL疫受体；由置NP-112571.1 M致的该基因异常发生于某些
B细舰赠瘤中 ^^^M蛋白斜奢,与生长因子的 ;M^长因子/调蛋白f^l和卵 AF179274 條-泡素抑制絲关
CDw90;细錄面受朱25-35kD
匪(促黄储^fc^素)肽 的絲射 CD66e CD326 葡萄粮调节蛋白78
肺癌,非小 细麟癌 (NSCLC) ELA T细胞 淋巴瘤 前列fc皮细 胞、新:4jfe管内前列腺癌 皮细胞
权利要求
1.包含一个或多个效应体部分和一个或多个结合体部分的合成的双功能非抗体化合物，其中所述效应体部分通过连接体可操作地连接至所述结合体部分，所述效应体部分为至少一种病原体模式识别受体(PRR)的配体，而所述结合体部分结合肿瘤细胞的标志物。
2. 权利要求1的化合物，其中所述一个或多个效应体部分是甘露 糖受体或曱酰肽受体(FPR)或甲酰肽受体家族成员的配体。
3. 权利要求1的化合物，其中所述一个或多个效应体部分是或含 有选自下列的一个或多个部分N-甲酰曱硫氨酸肽、N-甲酰-Met-Leu-Phe(fMLF) 、 N-甲酰-MMYALF (歷YALF)、甘露糖、岩藻糖、 N-乙酰半乳糖胺、多聚乌苷酸(polyG) 、 C端D-甲硫氨酸。
4. 权利要求1的化合物，其中所述一个或多个效应体部分是N-甲 酰-Met-Leu-Phe。
5. 以上权利要求中任一项的化合物，包含至少两个结合体部分。
6. 以上权利要求中任一项的化合物，其中所述结合体部分为肽、 微生物蛋白质、核酸、PNA或肽模拟物。
7. 以上权利要求中任一项的化合物，其中所述结合体部分为长度 在3和20个氨基酸之间的肽；和/或所述结合体包含任意以下肽序列 CGLIIQKNEC、 CNAGESSKNC 、 Dhb-pLDIK 、 Dhb-pLDI 、 WIFPWIQL 、 WDLAWMFRLPVG 、 VVISYSMPD 、 环(RGDfK) 、 RGDfK 、 RGDWXE 、 GGHGRVLWPDGWFSLVGISP、 YHWYGYTPQNVI、 GYTP、 YGYTPQ、 WYGYTPQN、 HWYGYTPQNV、 TACHQHVRMVRP、 NLLMAAS、 DUP-1、 HEWSYLAPYPWF、 HTFEPGV、 cyclo(SRESPHP) 、 SRESPHP、 KCCYSL、 LTVXPWY、 CSDSWHYWC、 CSDxxHxWC、EDYELMDLLAYL、环(CVGNDNSSC) 、 CVGNDNSSC、 TTPRDAY、 VHLGYAT、 CSNRDARRC、 CXNXDXR (X) / (R) C、 SWKLPPS、 IAGLATPGWSHWLAL、 AWYPLPP、 VPWMEPAYQRFL、 EPAYQR、 KSLSRHDHIHHH、 TNSLP、 YYGLAEVDAGGS、 MQLPLAT、 MXXP。
8. 以上权利要求中任一项的化合物，其中所述结合体为AWYPLPP 或MQLPLAT或YHWYGYTPQNVIK。
9. 以上权利要求中任一项的化合物，其中所述连接体为共价键、 脂键、酰胺键、肽键或醚键。
10. 以上权利要求中任一项的化合物，其中所述连接体为合成的 或半合成的聚合物，和/或其中所述连接体由寡肽、聚乙二醇或多聚赖 氨酸组成。
11. 包含以上权利要求中任一项的化合物的药物组合物。
12. 以上权利要求中任一项的化合物在制备用于治疗胂瘤的药物 中的用途。
13. 根据权利要求12的用途，用于治疗选自下列的胂瘤实体瘤、 淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、前列腺癌、结肠癌、甲状腺癌、 乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、滤泡性甲状腺癌、间变曱状腺癌、乳腺癌 症、宫颈癌、前列腺癌症、新生血管、肝癌、肝细胞癌、膀胱癌、胃 癌的腹膜肿瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤。
14. 根据权利要求12或13的用途，与一种或多种其他药物组合 用于治疗肿瘤，优选与化学疗法、单克隆抗体、抗体片段或包含抗体 或抗体片段和化学药物的融合分子组合。
全文摘要
本发明涉及合成的双功能非抗体化合物，其包含一个或多个效应体部分和一个或多个结合体部分，其中所述效应体部分通过连接体可操作地与所述结合体部分连接，所述效应体部分是针对至少一种病原体模式识别受体(PRR)的配体而所述结合体部分结合至肿瘤细胞的标志物。
文档编号A61K47/48GK101528263SQ200780024865
公开日2009年9月9日 申请日期2007年7月2日 优先权日2006年6月30日
发明者安德烈·科尔特曼 申请人:安德烈·科尔特曼