专利名称：：含有新木脂素b作为活性组分的皮肤外用组合物及其用于皮肤增白的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种皮肤外用组合物以及该组合物用于皮肤增白的用途，该组合物含有从三白草(5"m^wmsc/z/"e"^ySa///)中提取的新木脂素B(manassantinB)作为活性组分。更具体地，本发明涉及一种含有新木脂素B作为活性组分的皮肤外用组合物以及该组合物用于皮肤增白的用途，所述新木脂素B抑制黑素细胞中的两种黑素体转运蛋白(melanosometransporterprotein)(黑素亲和素(melanophilin)与肌球蛋白5a(myosin5a))之间的结合，以抑制黑色素的迁移，从而表现出优异的皮肤增白的效果。
背景技术：
：对于黑素生成的化学机理和酶促机理的理解已经得到了很好地证实，黑素生成决定了皮肤的颜色。黑素细胞在细胞器黑素体内合成黑色素，然后通过角质形成细胞转移到角质形成细胞树突。实际上，以这种方式转移到角质形成细胞内的黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。在黑素体转移到角质形成细胞树突的过程中，涉及到重要的成分。这些成分被称为"MTC"(黑素体转运复合体(melanosometransportcomplex)),所述MTC由三禾中蛋白质组成(黑素亲和素、Rab27a和肌球蛋白5a)。Rab27a用作转运体(transporter),结合到黑色素的表面上，从而识别并转运黑素体。为了使Rab27a迁移到外周(periphery),它必须与作为胞内细胞骨架的肌球蛋白5a蛋白质会合，而用于识别上述两种蛋白质并将上述两种蛋白质相互结合的作为接合器(adapter)的蛋白质是所述黑素亲和素蛋白质。当上述三种成分相互会合并形成复合体时，可以正常地将黑素体转移到外周，并最终转移到角质形成细胞。如果上述三种成分中的任意一种出现异常，可以观测到黑素体的转移过程出现了问题，而在黑色素的产生过程中则不会出现任何问题，从而使得皮肤的颜色变白。因此，通过调整这些成分来抑制黑素体的转移，可以获得皮肤增白的效果。三白草是一种类似于鱼腥草(7/OM"Wj;m'"COWato)的多年生植物，具有多种药学效果。已知三白草在多种成年人疾病的预防和治疗中具有显著的效果，所述成年人疾病包括便秘、糖尿病、肝病、癌症、高血压、心脏病、妇科疾病和肾病。已知在三白草中发现的活性组分类黄酮物质(包括栎精、栎素、异栎素和芸香苷)都可以起到净化血液的功效，并且比银杏树叶中的类黄酮物质更有效，还可以保护并强化向人体的各个组织均匀地提供清洁的血液的外周动脉(peripheralartery),水溶性的单宁(tannin)具有防止DNA突变的效果，从而表现出抑制癌症的发展的良好性能。在从三白草中分离出的提取物的药理学研究中，为了利用抗氧化效果(上述类黄酮物质的自由基清除效果(韩国专利公开No.96-21001))，韩国专利公开No.96-21001公开了所述提取物在预防衰老(皱纹)的化妆品组合物中的应用。另外，为了利用抑制酪氨酸酶(一种产生黑色素的酶)活性的效果，韩国专利公开No.2002-0035656公开了三白草提取物在皮肤增白的化妆品组合物中的应用，尽管如此，上述专利公开并未对通过精细地分离和提纯而得到的所述提取物的活性成分进行描述。据报导，新木脂素B可以抑制酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(acylCoAcholesterolacyltransferase)的活性(韩国专利申请No.10-2003-0080397)，但是这种物质本身的皮肤增白效果还没有报导。
发明内容本发明的发明人首次发现，当用三白草提取物对作为黑素细胞的mdan-a细胞进行处理时，黑素体的转移被抑制。而且，通过对所述三白草提取物进行分离和提纯，本发明的发明人首次确认实现该功能的活性成分是新木脂素B。此外，本发明的发明人发现通过抑制实现黑素细胞内的黑素体转移的转运蛋白之间的结合，即使黑色素合成是正常的，所述活性成分新木脂素B也具有抑制黑素体转移的效果，从而使其具有皮肤增白的效果。因此，本发明的目的是提供一种用于皮肤增白的皮肤外用组合物，该组合物含有新木脂素B(—种三白草提取物)，从而具有抑制黑素细胞内的黑素体的转移的效果。为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种皮肤外用组合物，该组合物含有新木脂素B作为活性组分。所述新木脂素B的特征在于它是从三白草中分离并提纯得到的。另一方面，本发明提供了皮肤外用组合物用于皮肤增白的用途，该组合物含有新木脂素B作为活性组分。下面，将对本发明进行更详细的描述。黑素细胞的黑素体是产生具有阻止由紫外线导致的细胞损伤的功能的黑色素的胞内细胞器，并且是非常重要的因素，因为该细胞器必须被转移到角质形成细胞，从而使由紫外线导致的细胞损伤最小化。新木脂素B是通过抑制黑素亲和素和肌球蛋白5a之间的结合来抑制黑素体的转移的，所述黑素亲和素和肌球蛋白5a是实现黑素细胞内的黑素体转移的转运蛋白，因此，即使黑色素合成是正常的，所述新木脂素B也可以提供皮肤增白的效果。考虑到所述组合物的效果、安全性和制剂稳定性，以所述组合物的总重量为基准，根据本发明的皮肤外用组合物含有的作为活性组分的新木脂素B的量为0.0001-10重量％，优选为0.001-10重量％。这是因为，如果新木脂素B的含量小于0.001重量％，所述组合物不能达到预期的效果；如果新木脂素B的含量超过10重量％，将难以保证所述组合物的安全性和制剂稳定性。本发明的组合物的剂型优选选自溶液、悬浮液、乳液、膏剂(paste)、凝胶、霜剂、洗液、散剂(powder)、肥皂、含表面活性剂的清洁剂(cleasing)、油齐U、粉饼(powderfoundation)、粉底乳液(emulsionfoundation)、粉底蜡(waxfoundation)禾口喷齐!j。含有新木脂素B的所述皮肤外用组合物可以用于皮肤增白。如上所述，当细胞用从三白草中分离出的新木脂素B进行处理时，可以观察到在作为黑素细胞的mdan-a细胞内的黑素体的转移被抑制时，出现黑素体的聚集，这种结果是由作为黑素体转运蛋白的黑素亲和素和肌球蛋白5a之间的结合被抑制所产生的。因此，新木脂素B干扰了作为黑素体转运蛋白的黑素亲和素和肌球蛋白5a之间的结合，从而能够通过抑制黑素体的转移来提供皮肤增白的效果，而不影响所述黑素体的黑色素合成功能。图1示出的照片用于展示用新木脂素B处理后的黑素细胞(melan-a)的形态的光学显微镜观测结果；图2是表示Mlph(黑素亲和素)和肌球蛋白5a之间结合的抑制程度的示意图；图3是表示本发明的新木脂素B在细胞水平上不抑制酪氨酸酶活性的示意图；图4是表示在黑素细胞与角质形成细胞的共培养过程中，本发明的新木脂素B以随浓度而定的方式抑制黑色素合成的示意图；图5是通过以下方法获得的图表在豚鼠的背部形成人工色素斑点，将样品涂敷在所述斑点上并持续一周，目测涂敷有所述样品的人工色素斑点的颜色是否变得比未经任何处理的人工色素斑点(未处理组)的颜色更浅，并将观测结果表示为数值；图6表示在用所述样品进行为期一周的处理之后，通过用色度计对所述人工色素斑点的颜色进行测量而获得的L值。具体实施例方式下面，将结合以下实施例和测试例对本发明作更详细的描述，但是本发明的范围不仅限于这些实施例。实施例1:三白草提取物的制备将1kg的三白草(整棵植物)加到5L的70%的乙醇(水、含水的有机溶剂(乙醇、甲醇、丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等)或有机溶剂)中，在回流下提取三次。然后，将所述溶液在15'C下放置1天。之后通过滤布对所述溶液进行过滤，并离心分离成为滤液和残渣，在减压下对分离出的滤液进行浓縮。将生成的提取物悬浮于1L的水中，然后用1L的二氯甲烷萃取五次。在减压下对如此获得的全部二氯甲垸层进行浓縮，从而获得50g的三白草提取物。实施例2:新木脂素B的结构分析步骤l:新木脂素B的提纯通过硅胶柱色谱法(装填有300g的硅胶)对10g由实施例1获得的三白草提取物进行提纯。使用己烷和乙酸乙酯作为展开剂，己烷对乙酸乙酯的浓度梯度从5:l增加至l:5，以获得馏分。从这些馏分中获得0.62g的新木脂素B。步骤2:通过NMR分析新木脂素B的结构使用NMR波谱仪对由步骤1获得的产品进行分析。结果，获得如下表l所示的数据，并且所述产品表现出以下性质。因此，确定该产物为新木脂素B，并且具有由以下化学式l表示的结构'化学式l<新木脂素B的物理性质和化学性质>性质浅米色的微晶正离子的快原子轰击质谱(positiveFAB-MS):734.5(M+H20)—〉LC-MS(APCI，正离子)734.5(M+H20)表l新木脂素B的iH-NMR和13C-NMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>测试例1:新木脂素B在细胞水平上抑制黑素体转移的效果的测试步骤l:黑素细胞的培养在10。/。CO2培养器中，使melan-a细胞(永生化小鼠黑素细胞)在含有10%的胎牛血清的RPMI1640培养基中培养至90%汇合(confluency)，同时每隔3天用新鲜的培养基替换原来的培养基。步骤2:新木脂素B抑制黑素细胞中的黑色素转移的测试用0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)对步骤1中培养的melan-a细胞进行分离，并以3><105个细胞/孔的密度将所述细胞铺展在6-孔的平板上。然后，将所述细胞放置24小时。用不同浓度的新木脂素B对所述细胞进行处理，4天之后，用光学显微镜观察上述细胞的形态。观察结果如图1所示。从图1中的看来为黑色的部分可以看出，与未用新木脂素B处理的对照组不同，在用新木脂素B处理过的细胞中，黑素体聚集在细胞核的周围，而不是均匀地分布在整个细胞中。测试例2:新木脂素B抑制黑素亲和素与肌球蛋白5a之间的结合的测试步骤l:重组蛋白质的制备使用适当的系统(大肠杆菌(￡.或杆状病毒(baculovirus)大量生产该测试中需要的蛋白质。在本发明中，设计的蛋白质必须包括已知为蛋白质相互作用所必要的结构域(domain),并含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、组氨酸标签(Histag)或Flag标签(flagtag),以便生成的蛋白质能够很容易地进行提纯和分离。使每一个组氨酸标签-绿色荧光蛋白-黑素亲和素(histidinetagged-GFP-melan叩hilin)重组蛋白质和Flag-肌球蛋白5a(Flag-MyosinVa)重组蛋白(上述重组蛋白质用作诱饵蛋白质(baitprotein))在杆状病毒系统中进行表达，使含有上述蛋白质的细胞进行分裂，然后制备提取物。用PBSTG缓冲溶液将Flag-肌球蛋白5aGT(Flag-MyosinVaGT)制备成为提取物，然后通过Flag-亲合色谱法(flag-affinitychromatography)进行提纯。步骤2:黑素亲和素与肌球蛋白5a之间的结合蛋白质通过反应将步骤1中制备的组氨酸-绿色荧光蛋白-黑素亲和素(his-GFP-mlphCT)蛋白质结合至涂有镍的平板上。将结合伙伴Flag-肌球蛋白5aGT(Flag-MyosinVaGT)结合至上述平板上，然后结合可以识别Flag的M2抗体。使上述平板进行显色反应，通过化学发光对上述蛋白质之间的结合程度进行测定。测定结果示于图2中。从图2中可以看出，新木脂素B抑制了黑素亲和素与肌球蛋白5a之间的结合。测试例3:新木脂素B对酪氨酸酶活性的抑制效果的测试步骤l:黑素细胞的培养以与测试例1中的步骤1相同的方式培养黑素细胞。步骤2:抑制酪氨酸酶活性的测试用冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)对步骤1中培养的细胞进行一次洗涤，然后用0.1M的磷酸盐缓冲剂(含有1。/。的曲拉通X-100(tritonx-100))使其进行分裂。然后，上述细胞在1400转/分(rpm)下离心20分钟，并分离出细胞上清液。将由此制得的40昭的蛋白质与不同浓度的新木脂素B混合，并使其反应1小时。用2mg/ml的L-多巴(L-DOPA)溶液对反应物质进行处理，并在37'C下放置。15分钟之后，检测在490nm处的吸光度，检测结果示于图3中。从图3中可以看出，新木脂素B完全没有抑制酪氨酸酶的活性。测试例4:新木脂素B抑制黑色素合成的测试步骤l:黑素细胞和角质形成细胞的共培养以与测试例1中的步骤1相同的方式培养黑素细胞。在10。/。C02培养器中，将小鼠角质形成细胞(SP-1细胞)在含有8%的胎牛血清的s-MEM培养基中培养至90%汇合，同时每隔3天用新鲜的培养基替换原来的培养基。步骤2:抑制黑色素合成的测试用0.25G/。的胰蛋白酶-EDTA对melan-a细胞和步骤1中培养的SP-1细胞进行分离，并以1:10的比例将上述细胞共同铺展在12-孔的平板上，mdan-a细胞的细胞密度为^104个细胞/孔，而SP-1细胞的细胞密度为&105个细胞/孔。然后，将上述细胞放置24小时。用不同浓度的新木脂素B对上述细胞进行处理，5天之后，用1N的NaOH收集细胞。检测所收集的细胞在405nm处的吸光度，并用劳里测定法(Lowrymethod)检测蛋白质浓度。测试结果示于图4中。从图4中可以看出，在黑素细胞和角质形成细胞的共培养过程中，新木脂素B以由浓度而定的方式抑制黑色素合成，而且当新木脂素B的浓度为0.02ppm时，所述黑色素的合成被抑制了约50%。测试例5:通过动物试验测试新木脂素B的增白效果步骤l:用于动物试验的样品的制备将实施例2中制备的提取物以0.1%的浓度溶解于赋形剂(乙二醇丙二醇水=5:3:2)中，并使曲酸以5%的浓度溶解于赋形剂中。步骤2:使用褐色豚鼠进行新木脂素B的增白效果的动物试验将重约500g的豚鼠的背部的毛发剃掉，并将步骤1中制备的样品以直径为约1cm的圆形涂敷在剃掉了毛发的皮肤上，早晨和傍晚每天两次，涂敷两天。在第3天时，用戊巴比妥(30mg/kg)将所述豚鼠麻醉，然后用250mJ的紫外光照射涂敷有所述样品的圆形部位。从紫外照射的第二天起，用与第一天涂敷的物质相同的物质进行为期一周的涂敷，早晨和傍晚每天两次。然后，目测仅用赋形剂处理过的人工色素斑点和用所述样品处理过的人工色素斑点与没有涂敷任何物质的人工色素斑点(未处理组)在颜色上的差异。在目测结果中，0.5表示只有专家才能够识别的增白效果；l表示任何人都能够识别的增白效果；3表示增白效果表现为光亮度与最初的皮肤颜色一致；2表示增白效果介于1和3之间；4表示增白效果表现为光亮度比最初的皮肤颜色更高。将四只动物作为一组用于该试验，获得的数值求平均值并绘制成图。较高的数值表示所述人工色素斑点通过施用样品而变白，观测结果示于图5中。除进行以上目测之外，用色度计评估所述人工色素斑点的光亮度，结果用数值(L值)表示并求平均值。将平均值绘制成图并示于图6中，其中数值越高表示颜色越明亮。从图6中可以看出，与对照组相比较，所述含有新木脂素B的提取物表现出优异的增白效果。制剂例l:含有新木脂素B的洗液将下表2中的组分l-6相互混合，并在7(TC下进行溶解以获得水相。然后，使组分8-14在7(TC下进行溶解以获得油相。之后将所述水相与组分7一起添加到所述油相中，在均质混合机(TokushuKika，日本)中对上述混合物进行搅拌以获得乳液。然后，通过加入组分15使所述乳液变稠。去除泡沬之后，将获得的物质冷却至室温，从而制得洗液。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>制剂例2:含有新木脂素B的滋养霜制备具有下表3中所示的组分和含量的滋养霜。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>制剂例3:含有新木脂素B的美容涂敷剂(pack)制备具有下表4中所示的组分和含量的美容涂敷剂。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>测试例6:通过人体试验测试新木脂素B的增白效果12名健康的男性作为受试者。将不透明胶带(沿该胶带形成有6个直径为1.5cm的开孔)贴在每个受试者的上臂之上，然后使每个受试者暴露于剂量约为最小红斑剂量的1.5-2倍的UV光(UVB)下以诱导皮肤变黑，并涂敷被测试的物质。2个月之后，用色度仪测量皮肤的光亮度。给每个受试者涂敷作为被测试的物质的由实施例1、制剂例l和对比例获得的组合物，一天两次，在早晨和傍晚进行涂敷。在本发明中，对比例是除不含有新木脂素B之外而与制剂例1相同的组合物。通过测量表示皮肤的光亮度的"L值"来确定被测试的物质的效果(韩国人的未晒黑的皮肤的颜色通常表现出50-70的L值)。L值逐渐增大表示被测试的物质是有效果的，并且被测试的物质之间的比较用AL值表示。在本发明中，AL=最终的L值-施用被测试的物质之前的L值。AL值越高表示增白效果越好。测试结果示于下表5中。表5制剂例1实施例1对比例AL2.252.891.04如表5所示，含有新木脂素B的组合物的AL值分别为2.25和2.89，均高于对比例的1.04。这说明含有新木脂素B的组合物具有优异的增白效果。工业实用性如上所述，本发明的含有从三白草中提取的新木脂素B的皮肤外用组合物通过抑制黑素体的转移能够提供皮肤增白效果。权利要求1、一种皮肤外用组合物，该皮肤外用组合物含有新木脂素B作为活性组分。2、根据权利要求1所述的皮肤外用组合物，其中，所述新木脂素B是从三白草提取物中分离的。3、根据权利要求1所述的皮肤外用组合物，其中，以该组合物的总重量为基准，所述新木脂素B的含量为0.001-10重量％。4、一种皮肤外用组合物用于皮肤增白的用途，该皮肤外用组合物含有新木脂素B作为活性组分。5、根据权利要求4所述的用途，其中，所述新木脂素B是从三白草提取物中分离的。6、根据权利要求4所述的用途，其中，以该组合物的总重量为基准，所述新木脂素B的含量为0.001-10重量％。全文摘要本发明公开了一种皮肤外用组合物以及该组合物用于皮肤增白的用途，该组合物含有从三白草中提取的新木脂素B作为活性组分。更具体地，本发明公开了一种含有新木脂素B作为活性组分的皮肤外用组合物以及该组合物用于皮肤增白的用途，所述新木脂素B抑制黑素体的转移，从而提供了皮肤增白的效果而不影响黑素细胞的黑色素合成功能。文档编号A61K31/343GK101534816SQ200780042533公开日2009年9月16日申请日期2007年11月2日优先权日2006年11月17日发明者安秀美,崔贤贞,廉明勋,张希景,朱璟美,金大建,黄在晟申请人:株式会社太平洋