专利名称：细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物释放系统及制备方法
技术领域：
本发明涉及复合物及制备方法，尤其涉及一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为 载体的抗癌药物释放系统及制备方法。
背景技术：
树枝状聚合物是一种人工合成的新型纳米材料，以其独特的结构和性能在 生物医学领域受到了日益广泛的关注。它在结构上具有高度的几何对称性，精 确的分子结构、易控的纳米尺寸、壳-核及内部空腔结构、大量的末端官能团等 特点，在药物释放、基因传递和医疗诊断等方面具有广阔的应用前景。作为纳 米药物载体，树枝状聚合物具有低载体尺寸，高载药量，具有携带难溶药物和 生物活性物质的潜力，成为药物释放载体中的研究热点。
作为一类优异的药物载体，聚酰胺-胺(PAMAM) —般由丙烯酸甲酯和乙 二胺依次经迈克尔加成反应与酰胺化反应而形成，随着代数的增加，PAMAM树 枝状聚合物分子量和表面基团数以指数级增加，而直径以线性增加。生物相容 性和溶解性能是影响载体应用的因素之一。研究发现，PAMAM表现出浓度及 大小依赖的毒性，其分子代数和浓度越高，细胞毒性越强。G5代PAMAM在10 Umol/L浓度时显示出细胞毒性，而G7代PAMAM在5 u mol/L浓度下即可导 致细胞死亡。随着研究的深入，人们开始关注树枝状高分子的功能化修饰。进 一步的研究表明(IntJPharm， 2003， 252: 263—266)，通过对PAMAM表面阳 离子进行修饰可明显降低其细胞毒性。C. Kojima等人(Bioconjug Chem， 2000， 11(6): 910-91)在PAMAM表面接枝上PEG，增进了纳米药物载体的生物相容 性和溶解性。
模拟生物膜结构的新型生物相容性材料的研究引起了极大的关注。研究表 明，细胞膜外层具有双性电荷结构的磷酸胆碱极性头部可以与水分子形成非常 牢固的水合层，减弱蛋白与其的相互作用，可以有效地改善材料的血液相容性。 近年来，将细胞膜仿生的磷酸胆碱设计用于纳米材料的表面改性和设计，为解 决纳米材料在生物医学应用中所面临的溶解性、稳定性和生物相容性等问题提 供了良好的思路。人们已经实现了金纳米粒子和磁性纳米粒子在生理环境下的 有效分散和稳定，而且，与以聚氧乙烯为亲水段的聚合物胶束相比，以磷酸胆 碱聚合物为亲水段的聚合物胶束显示出更为优异的生物相容性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺 为载体的抗癌药物释放系统及制备方法。
细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物释放系统包括细胞膜仿生修饰 的聚酰胺-胺树枝状聚合物和包封在细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺树枝状聚合物 中的抗癌药物，细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺树枝状聚合物具有亲水性端基和疏 水性空腔。
所述的抗癌药物选自阿霉素、紫衫醇、柔红霉素、丝裂霉素C、刚哚美幸、 布洛芬或环孢菌。
细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物释放系统的制备方法包括如
下步骤
1) 1重量份末端含氨基的0 6代聚酰胺-胺和0. 01 100重量份细胞膜仿 生单体加入到10-10000重量份溶剂中，加热到20 20(TC，反应0. 5 100hr， 以透析袋透析1 100小时，冷冻真空干燥10 100 hr后得到细胞膜仿生修饰 聚酰胺-胺；
2) 将经过仿生修饰的1重量份0 6代聚酰胺-胺溶解于2-500重量份的水 中得到聚酰胺-胺水溶液A;
3) 将1重量份疏水性抗癌药物溶解于2-500重量份的甲醇或乙醇或或异丙 醇四氢呋喃或二氯甲垸中，得到药物溶液B;
4) 将1重量份药物溶液B加入到1-100重量份聚酰胺-胺水溶液A中，以 40 100kHz超声波处理0. 1 100hr后，加热到20 200。C，反应O. 5 100 hr，以透析袋透析1 100小时，冷冻真空干燥10 100 hr后得到包含抗癌药 物的抗癌药物释放系统。
所述的细胞膜仿生单体为CH2=C(CH3)COO-[CH2CH20]n-OH，其中n =6 200，或CH2 =CHCO0—[CH2CH2O]n-OH ，其中n = 6 200，或甲基丙烯酸 磷酸胆碱酯，或丙烯酸磷酸胆碱酯，或甲基丙烯酸葡萄糖酯，或丙烯酸葡萄糖 酯。
所述的抗癌药物选自阿霉素、紫衫醇、柔红霉素、丝裂霉素C、 fi引哚美幸、 布洛芬或环孢菌。
本发明与现技术相比具有的有益效果
1 )经细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺具有良好的生物相容性和稳定性； 2)经细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺具有较高的药效、较高的载药能力、良好 的贮藏稳定性和较低的毒性。
具体实施例方式
本发明公开了一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物释放系统。 利用外层为氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物与细胞膜仿生单体发生迈克尔加成反 应，实现对聚酰胺-胺的表面修饰，获得细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺，该仿生修 饰的聚酰胺-胺具有疏水的空腔，疏水性抗癌药物能与疏水性空腔发生疏水相互 作用，从而实现抗癌药物在细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺中的包埋，并对抗癌药 物释放系统进行生物相容性、药物载药能力和释放行为进行评价。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1:
(1) 磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成
以外层为氨基的第5代聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)与细胞膜仿生 单体2-丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(APC)作为原料，制备磷酸胆碱修饰的聚酰
胺-胺树枝状聚合物，具体制备步骤如下
在100mL三口烧瓶中加入APC (4g, 0.014 mol)的甲醇溶液(20mL)，通 氮气保护，在0 ° C逐滴加入第五代PAMAM (G5，1 g，4.85 Xl(r5mol)的甲醇 溶液(10mL)，滴加完毕后反应体系在O ° C下继续搅拌30min，然后在室温 下反应72h。反应完毕后经透析除去未反应单体，冻干得到粉末状固体产物。 核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构。
(2) 药物包埋
称取20 mg两种树枝状聚合物，溶解于5 mL的三蒸水中，所得浓度为4 mg/mL。利用超声的方法对该溶液超声处理30 s，以促进聚合物的溶解。将20 mg 的盐酸阿霉素ADR-HC1溶解于4 mL三氯甲烷中，并加入ADR-HC1的3倍物质 的量的三乙胺使其去盐酸化，超声处理30s，加速其溶解；将去盐酸化的ADR 氯仿溶液加到聚合物水溶液中，37'C下避光搅拌反应24小时后开放体系避光保 存，使有机溶剂氯仿挥发完全；停止搅拌，以12000 rpm的转速离心20分钟， 未被包覆进聚合物胶束中的疏水药物ADR被离心下来，用移液管小心收集上层 清液，重复离心三次；离心后的上层清液经0.22 Um滤膜过滤，所得溶液即为 负载有阿霉素ADR药物的聚合物纳米药物载体溶液，冻干，得到载药的磷酸胆 碱修饰的聚酰胺-胺树枝状聚合物(G5-PC-ADR)避光保存待用。核磁、紫外的 数据表明所获得的产物具有预期的结构。
(3)载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放
1)树枝状聚合物纳米药物载体载药效率的测定
称取一定量的载药树枝状聚合物溶解于三蒸水中，制备出确定浓度的溶液。
超声处理加速其溶解后，用紫外分光光度计法测定溶液其在480 nm处的吸收值。 最后根据标准曲线计算仿生纳米载药胶束载药量。按照下面的公式进行计算
(载药效率entrapment efficiency) LE =载药体系中药物ADR的质量/载药聚 合物的质量
2)载药树枝状聚合物中ADR的释放和测量，具体步骤如下
称取载药树枝状聚合物配成浓度1 mg/mL的水溶液并超声分散；取4 mL溶 液装入到截留分子量为3500的透析袋中，并将透析袋放入装有40 mL PBS缓冲 溶液的离心管中并密封避光，用水浴恒温摇床在37 ° C下轻微振荡；在设定的 时间间隔内，从透析袋外溶液中取出4mL试样，并补加4 mL新鲜PBS缓冲溶 液，以维持释放体系的溶液体积不变；用紫外检测所取试样中含有的ADR药物 在480 nm处的紫外吸收值，根据ADR在PBS缓冲溶液中的标准曲线计算出此 时间段内ADR的释放量。结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性， 具有较高的载药量，可以延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。 (4)载药树枝状聚合物的细胞评价
将肝癌细胞系HepG2的细胞悬液种植到96孔聚苯乙烯培养板TCPS中，种 植密度为10000细胞/ L，并补加培养液DMEM至180 ul;在37 ° C、 5%C02 培养箱中继续培养24h，然后分别加入20 U 1经过滤灭菌的载药树枝状聚合物 G5-ADR、 G5-PC-ADR和自由ADR的梯度溶液，此时在培养液中含有ADR的 浓度依次为20、 10、 5、 1、 0.1以及0.01 "g/mL，继续在培养箱中培养不同时 间之后，测试对细胞活性并观察细胞的形貌。每个试样取三个孔的数据，采用 平均数士标准差表示，P<0.05为有显著性差异。
细胞学评价结果磷酸胆碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物 的毒性，提高生物相容性。
实施例2
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成除了反应原料采用第3代聚酰胺-胺树枝状聚合物外，其他实验步骤同实施例1。核磁和红外证实所获得的产物具 有预期的结构。
(2) 药物包埋同实施例1。核磁、紫外的数据表明所获得的产物具有 预期的结构。
(3) 载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放同实施例1。
结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性，具有较高的载药量，可以
延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。
(4)载药树枝状聚合物的细胞评价同实施例1。细胞学评价结果磷酸胆 碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物的毒性，提高生物相容性。 实施例3
(1) 磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成除了反应原料采用丙烯酸聚氧乙 烯酯(://2:^//<^<9—[C//2C/f20]n_0//，其中聚合度11 = 20夕卜，其他实验步骤同实 施例1。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构。
(2) 药物包埋同实施例1。核磁、紫外的数据表明所获得的产物具有 预期的结构。
(3) 载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放同实施例1。 结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性，具有较高的载药量，可以 延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。
(4) 载药树枝状聚合物的细胞评价同实施例1。细胞学评价结果磷酸胆 碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物的毒性，提高生物相容性。
实施例4
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成除了反应原料采用丙烯酸葡萄糖 酯外，其他实验步骤同实施例1。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构。
(2) 药物包埋同实施例1。核磁、紫外的数据表明所获得的产物具有 预期的结构。
(3) 载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放同实施例1。 结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性，具有较高的载药量，可以 延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。
(4) 载药树枝状聚合物的细胞评价同实施例1。细胞学评价结果磷酸胆 碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物的毒性，提高生物相容性。
实施例5
(1) 磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成除了反应原料采用第3代聚酰胺 -胺树枝状聚合物外，其他同实施例3。核磁和红外证实所获得的产物具有预期 的结构。
(2) 药物包埋同实施例1。核磁、紫外的数据表明所获得的产物具有 预期的结构。
(3) 载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放同实施例1。 结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性，具有较高的载药量，可以
延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。
(4)载药树枝状聚合物的细胞评价:同实施例1。细胞学评价结果磷酸胆 碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物的毒性，提高生物相容性。 实施例6
(1) 磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成同实施例l。核磁和红外证实所 获得的产物具有预期的结构。
(2) 药物包埋除了药物采用柔红霉素外，其他同实施例1。核磁、紫外 的数据表明所获得的产物具有预期的结构。
(3) 载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放同实施例1。 结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性，具有较高的载药量，可以 延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。
(4) 载药树枝状聚合物的细胞评价同实施例1。细胞学评价结果磷酸胆 碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物的毒性，提高生物相容性。
实施例7
(1) 磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成同实施例3。核磁和红外证实所 获得的产物具有预期的结构。
(2) 药物包埋同实施例6。核磁、紫外的数据表明所获得的产物具有 预期的结构。
(3) 载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放同实施例1。 结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性，具有较高的载药量，可以 延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。
(4) 载药树枝状聚合物的细胞评价同实施例1。细胞学评价结果磷酸胆 碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物的毒性，提高生物相容性。
实施例8
(1) 磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成同实施例4。核磁和红外证实所 获得的产物具有预期的结构。
(2) 药物包埋同实施例6。核磁、紫外的数据表明所获得的产物具有 预期的结构。
(3) 载药树枝状聚合物载体载药效率的释放和药物的释放同实施例1。 结果表明所制备的纳米药物载体具有良好的水溶性，具有较高的载药量，可以 延长药物释放时间，实现抗癌药物的缓释。
(4) 载药树枝状聚合物的细胞评价同实施例1。细胞学评价结果磷酸胆 碱修饰后的载药树枝状聚合物可以有效地降低药物的毒性，提高生物相容性。
权利要求
1.一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物释放系统，其特征在于包括细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺树枝状聚合物和包封在细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺树枝状聚合物中的抗癌药物，细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺树枝状聚合物具有亲水性端基和疏水性空腔。
2. 根据权利要求1所述的一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物 释放系统，其特征在于所述的抗癌药物选自阿霉素、紫衫醇、柔红霉素、丝裂 霉素C、吲哚美幸、布洛芬或环孢菌。
3. —种根据权利要求1所述的细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物释放系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤1) 1重量份末端含氨基的0 6代聚酰胺-胺和0. 01 100重量份细胞膜仿 生单体加入到10-10000重量份溶剂中，加热到20 200 °C，反应O. 5 100hr， 以透析袋透析1 100小时，冷冻真空干燥10 100 hr后得到细胞膜仿生修饰聚 酰胺-胺；2) 将经过仿生修饰的1重量份0 6代聚酰胺-胺溶解于2-500重量份的水 中得到聚酰胺-胺水溶液A;3) 将1重量份疏水性抗癌药物溶解于2-500重量份的甲醇或乙醇或或异丙 醇四氢呋喃或二氯甲垸中，得到药物溶液B;4) 将1重量份药物溶液B加入到1-100重量份聚酰胺-胺水溶液A中，以 40 100kHz超声波处理0. 1 100hr后，加热到20 200 。C，反应O. 5 100 hr，以透析袋透析1 100小时，冷冻真空干燥10 100hr后得到包含抗癌药物 的抗癌药物释放系统。
4. 根据权利要求3所述的一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物 释放系统的制备方法，其特征在于所述的细胞膜仿生单体为 C//2 =C(C//3)COO—[C//2Ci/20]n — Oi/ ， 其中n = 6 200 ， 或 Of2 =07090—
n—0//，其中n二6 200,或甲基丙烯酸磷酸胆碱酯， 或丙烯酸磷酸胆碱酯，或甲基丙烯酸葡萄糖酯，或丙烯酸葡萄糖酯。
5. 根据权利要求3所述的一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物 释放系统的制备方法，其特征在于所述的抗癌药物选自阿霉素、紫衫醇、柔红 霉素、丝裂霉素C、 n引哚美幸、布洛芬或环孢菌。
全文摘要
本发明公开了一种细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺为载体的抗癌药物释放系统及制备方法。利用外层为氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物与细胞膜仿生单体发生迈克尔加成反应，实现对聚酰胺-胺的表面修饰，获得细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺，该仿生修饰的聚酰胺-胺具有疏水的空腔，疏水性抗癌药物能与疏水性空腔发生疏水相互作用，从而实现抗癌药物在细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺中的包埋，所形成的聚酰胺-胺和抗癌药物的复合体能实现抗癌药物的有效释放。本发明具有较高的药效、较高的载药能力、良好的水溶性、良好的贮藏稳定性和较低的毒性，在癌症治疗中具有良好的应用前景。
文档编号A61K31/407GK101361978SQ200810120680
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月2日 优先权日2008年9月2日
发明者徐建平, 沈家骢, 剑 计, 兰 贾 申请人:浙江大学