专利名称：盐酸洛哌丁胺作为抗肿瘤药物组分及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及盐酸洛哌丁胺的应用，特别是作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
恶性肿瘤包括癌和肉瘤，是危害人类健康的常见而难治之症。随着科学技术的发展， 人们已经开发出了多种化疗和生物治疗药物。目前可以单用或与化疗相结合的生物治疗药 物包括细胞因子、造血生长因子、过继免疫治疗、体细胞治疗、表皮生长因子酪氨酸激酶 抑制剂、血管生长抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、细胞信号通路调节剂、反义治疗、法 尼基转化酶抑制剂、多靶点抗叶酸药、肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体、生长抑素、单 克隆抗体靶向治疗、瘤苗治疗、基因治疗等种类。为进一步提高疗效，还开发了生物治疗 /化疗的同时疗法、序贯疗法等联合治疗策略[李卫东，李金翰.恶性肿瘤生物化疗及其临 床应用类别.癌症进展杂志，2003,1(4): 202-205.]。
化疗对于肿瘤已经转移或不能用手术切除的患者是最主要的治疗方法和手段。但是传 统的细胞毒性药物在杀死肿瘤细胞的同时，还作用于正常细胞，造成严重的毒副作用，而 且肿瘤细胞在存活压力下还很容易产生耐药性。而近年来发展迅速的分子靶向药物虽然耙 点明确特异，但也有一系列脱靶效应(off target effect)的报道，而且单一用药使人 体产生耐药性的机率较大。因而，发展具有新型作用机理的疗效好、毒性低的抗肿瘤新药 具有重要的意义。
盐酸洛哌丁胺(Loperamide hydrochloride)又名易蒙停，化学名为N， N-二甲基-a， a -二苯基-4-(对-氯苯基)-4-羟基-1-哌啶丁酰胺盐酸盐，是由比利时Janssen公司开发的
一种无吗啡样中枢作用的止泻药，用于急性腹泻和各种原因引起的慢性腹泻，对不明原因 的腹泻和肠易激综合征等也有较好疗效。同时，该药不良反应发生率低，偶见过敏反应(包
括皮疹)、胃肠不适、恶心、呕吐、腹痛、头痛、口干、头晕、便秘、肠梗阻等，其变态 反应，特别是伴有中枢症状的变态反应较为少见。由于其安全性较好，被作为非处方药销 售。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供盐酸洛哌丁胺的一种新用途，即盐酸洛哌丁胺作为制 备抗肿瘤药物的应用。
作为本发明的应用的改进盐酸洛哌丁胺通过口服吸收、皮下注射或静脉注射，产生
抗肿瘤作用。
作为本发明的应用的进一步改进亡。
作为本发明的应用的进一步改进
的Tie2受体发挥作用。
作为本发明的应用的进一步改进
肿瘤生长停滞。
作为本发明的应用的进一步改进
作为本发明的应用的进一步改进 挥作用。
作为本发明的应用的进一步改进 进而引发细胞凋亡。
作为本发明的应用的进一步改进
肾癌、胰腺癌或黑色素瘤。
因此，盐酸洛哌丁胺能用于抑制肿瘤细胞。
本发明的具体用法可选择如下方式
将盐酸洛哌丁胺先溶于二甲基亚砜(DMSO)或甲醇等助剂中形成母液。然后以适宜 的溶液(例如生理盐水)将母液进一步稀释成为药液，使最终的药液中二甲基亚砜(DMSO) 或甲醇等助剂的体积比不超过千分之一，以消除助剂对使用结果的影响。 一般可按照1.8 2.2mg盐酸洛哌丁胺/kg体重的剂量以注射的形式给药。
本发明所用的盐酸洛哌丁胺药液对肝癌细胞SMMC7721、乳腺癌细胞MCF-7、肺腺癌 细胞SPC-A1、卵巢癌耐药细胞SKOV3-DDP等多种细胞的增殖具有显著的抑制作用。本发 明所用的盐酸洛哌丁胺药液可以诱导肿瘤细胞发生明显的凋亡。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1是不同浓度盐酸洛哌丁胺作用24h诱导肺腺癌细胞SPC-A1凋亡的情况(PI单染)
:盐酸洛哌丁胺能够促进肿瘤新生血管内皮细胞的凋
:盐酸洛哌丁胺通过结合肿瘤新生血管内皮细胞表面
:盐酸洛哌丁胺能够抑制肿瘤细胞的生长和分裂，使
:盐酸洛哌丁胺能够促进肿瘤细胞的凋亡。
:盐酸洛哌丁胺通过结合肿瘤细胞表面的Tie2受体发
:盐酸洛哌丁胺通过阻断肿瘤细胞膜上的钙离子通道
:所述肿瘤为白血病、肝癌、肺癌、肠癌、乳腺癌、图2是盐酸洛哌丁胺37. 5 uM对肺腺癌细胞SPC-Al的凋亡诱导作用(FITC-Annexin V/PI双染)图。
具体实施例方式
实施例1、盐酸洛哌丁胺对细胞增殖的抑制作用
将盐酸洛哌丁胺溶于二甲基亚砜(DMS0)或甲醇，配成盐酸洛哌丁胺的浓度为50mM 的母液备用。
将对数生长期肝癌细胞SMMC7721稀释成2X10S个/ml，接种于96孔培养板，每孔 加入O. 1 ml，置37 'C， 5% C02及饱和湿度的培养箱培养。待细胞充分贴壁后，小心吸 弃上清。用RPMI1640培养液稀释母液，从而使盐酸洛哌丁胺至不同的终浓度(100uM、 50uM、 25uM、 12. 5uM、 6. 25uM)，每浓度平行5孔，每孔加入0. 1 ml，空白对照组加等量 同样稀释的培养液，置培养箱培养24h (培养条件同上)；实验终止前4小时每孔加入5 mg/mlMTT 10 ul。培养结束后，小心吸弃上清，每孔加入150 ul 二甲基亚砜(DMSO)， 振荡10 min。待MTT还原产物完全溶解后，用酶标仪，以550 nm为检测波长，655 nm为 参照波长测定其吸光度。计算细胞的存活率，并以药物的不同浓度对细胞的存活率作图，
从而确定药物的半数抑制浓度(IC50)。
细胞蹄率:Hl^lllx腿 对照组的OD平均值
半数抑制浓度(IC5o):引起半数细胞死亡的药物浓度。
实验结果为盐酸洛哌丁胺药液对肝癌细胞SMMC7721的半数抑制浓度(IC5o)为 24. 2uM。
以乳腺癌细胞MCF-7替代肝癌细胞SMMC7721，其余测试方法同上，实验结果为 盐酸洛哌丁胺药液对乳腺癌细胞MCF-7的半数抑制浓度(IC5Q)为23. 6uM。
以肺腺癌细胞SPC-A1替代肝癌细胞SMMC7721，其余测试方法同上，实验结果为 盐酸洛哌丁胺药液对肺腺癌细胞SPC-A1的半数抑制浓度(IC5o)为25.9uM。
以卵巢癌耐药细胞SK0V3-DDP替代肝癌细胞SMMC7721，其余测试方法同上，实 验结果为盐酸洛哌丁胺药液对卵巢癌耐药细胞SKOV3-DDP的半数抑制浓度(IC5o)为 27. luM。
实施例2、 PI单染测定盐酸洛哌丁胺诱导的细胞凋亡
取对数生长期的肺腺癌细胞SPC-A1，以2X105个/ml的密度接种于底面积25cm2的 培养瓶中，置37'C， 5%(202及饱和湿度的培养箱培养，待细胞充分贴壁后，用1640培养 基稀释实施例1中的盐酸洛哌丁胺母液(50mM)，从而使培养瓶中盐酸洛哌丁胺的终浓度 分别为0、 12. 5uM、 25uM、 50uM，继续培养24h (培养条件同上)。加入0. 25%胰酶200ul 消化细胞，1000rpm 6min离心，收集培养上清中和贴壁消化下来的细胞，以PBS洗2次， 离心去上清。加入预冷的70%乙醇，在4。C下固定细胞3h以上或过夜。离心，去固定液， 用PBS缓冲液洗细胞一次，加入终浓度为50 ug/tnl的碘化丙锭(Propidium iodide， PI) 染色，室温作用30min。使用FACSCalibur流式细胞仪检测，CELLQUEST软件分析数据并 作图，亚二倍体峰被定量，作为测定凋亡的标准。
结果表明，随盐酸洛哌丁胺浓度的增加，凋亡峰的比例逐渐增加(图1)，说明盐酸 洛哌丁胺可以诱导肿瘤细胞的凋亡。
实施例3、 FITC-Annexin V/PI双染检测细胞早期凋亡
取对数生长期的肺腺癌细胞SPC-A1，以2X105个/ml的密度接种于底面积250112的 培养瓶中，置37'C， 5%<:02及饱和湿度的培养箱培养，待细胞充分贴壁后，用1640培养 基稀释实施例1中的盐酸洛哌丁胺母液(50mM)，从而使培养瓶中盐酸洛哌丁胺的终浓度 为37.5uM，继续培养(培养条件同上)，分别于作用Oh、 6h、 12h、 24h后，加入0.25% 胰酶200ul消化细胞，1000rpm6min离心，收集培养上清中和贴壁消化下来的细胞，以PBS 洗2次，离心去上清。按FITC-A腿xin V/PI双染试剂盒说明，加入FITC-A匿xin V和 PI进行染色。同时，取正常培养的肺腺癌细胞SPC-Al，不加任何染料，作为阴性对照。 另外，还需制备FITC-Amiexin V阳性对照和PI阳性对照，即将正常培养的肺腺癌细胞 SPC-A1煮沸3min，冷却后，按试剂盒中用量，分别加入FITC-Annexin V和PI中的一禾中 即可。使用FACSArray Bioanalyzer流式细胞仪检测。
结果表明，盐酸洛哌丁胺作用6h即可诱导肺腺癌细胞的早期凋亡，随作用时间延长， 凋亡细胞的比例逐渐增加(图2)，说明盐酸洛哌丁胺可以诱导肺腺癌细胞凋亡。
实施例4、盐酸洛哌丁胺的体内抗肿瘤活性
取对数生长期的肺腺癌细胞SPC-Al，在每个底面积252的培养瓶中，加入0.25%胰
酶200ul消化，将消化下来的细胞加入到15 ml塑料离心管中，1000 rpm离心10 min， 小心倒掉离心管中的培养液，加入PBS，吹打均匀，再IOOO rpm离心10 min，小心倒掉 离心管中的PBS，加入新的PBS，将细胞吹打均匀后调至lxl(^个/ml，用于接种。
购买四周龄SPF级BALB/c裸鼠，在接种前先驯养5天，并自由饮水和进食。接种时， 在每只裸鼠的前肢皮下注射肺腺癌细胞SPOAl悬液(lxl(^个/ml) 0.2ml。接种后10天 左右，可见接种处形成瘤块。将裸鼠称重、标记并随机分为3组，每组10只。分别是
阴性对照组注射生理盐水，0.2ml/次；
阳性对照组注射阿霉素(Adriamycin， ADM)溶液(以生理盐水稀释配制)，剂量 2 mg阿霉素/kg体重；
试验组注射盐酸洛哌丁胺药液(以生理盐水稀释配制)，剂量2 mg盐酸洛哌丁胺/kg 体重-，
采用腹腔注射形式(i. P.)给药，每天给药一次，连续给药7天。每隔一天测量瘤 块的体积，并观察、记录裸鼠的行为和死亡情况。连续观察30天，对各组裸鼠的瘤块体 积及死亡情况进行对比，作为药物疗效的评价指标。
结果表明，阴性对照组裸鼠在30天内死光；阳性对照组在30天内死亡3只，存活率70%， 瘤块平均体积l. 73cm3;盐酸洛哌丁胺组30天内死亡1只，存活率90%,瘤块平均体积l. 33cm3。 这说明盐酸洛哌丁胺可以抑制裸鼠实体肿瘤的生长，并显著提高裸鼠的存活率。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1、盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用。
2、 根据权利要求l所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是盐酸洛 哌丁胺通过口服吸收、皮下注射或静脉注射，产生抗肿瘤作用。
3、 根据权利要求1或2所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是盐酸 洛哌丁胺能够促迸肿瘤新生血管内皮细胞的凋亡。
4、 根据权利要求1或2所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是盐酸洛哌丁胺通过结合肿瘤新生血管内皮细胞表面的Tie2受体发挥作用。
5、 根据权利要求1或2所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是盐酸洛哌丁胺能够抑制肿瘤细胞的生长和分裂，使肿瘤生长停滞。
6、 根据权利要求1或2所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是盐酸洛哌丁胺能够促进肿瘤细胞的凋亡。
7、 根据权利要求1或2所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是盐酸洛哌丁胺通过结合肿瘤细胞表面的Tie2受体发挥作用。
8、 根据权利要求1或2所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是盐酸洛哌丁胺通过阻断肿瘤细胞膜上的钙离子通道进而引发细胞凋亡。
9、 根据权利要求1或2所述的盐酸洛哌丁胺作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征是所述肿瘤为白血病、肝癌、肺癌、肠癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌或黑色素瘤。
全文摘要
本发明公开了盐酸洛哌丁胺的一种新用途作为制备抗肿瘤药物的应用。盐酸洛哌丁胺对肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用，盐酸洛哌丁胺可以诱导肿瘤细胞发生明显的凋亡。
文档编号A61P35/00GK101390858SQ20081012180
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月20日 优先权日2008年10月20日
发明者宫兴文, 徐宇虹 申请人:浙江大学