专利名称：载体的制作方法
载体 本发明涉及维生素E衍生物，例如生育酚的应用，维生素E衍生物和相关分子作为 载体，运载药物或其他试剂到视网膜，特别是局部用药。将分子从局部给药运送到眼睛的后部成为很多眼科药理学家的研究目标。年龄相 关的黄斑变性和糖尿病视网膜病变的抗VEGF治疗已经越来越受关注。典型的局部眼部用药是通过眼睛滴入，但是药物在眼睛表面仅有短时间的接触。 眼睛滴入后，通常20-30分钟后，前房试剂的浓度达到高峰，一般比所用的浓度低两个数量 级。试剂从房水很容易达到虹膜，睫状体，晶状体和视网膜。局部给药的一部分药物可以穿 过球结膜被巩膜吸收，进一步被眼色素层和眼后部分吸收。试剂通过角膜的路径是非侵入 方法，允许药物传递到眼后部。角膜的传递路线不仅有助于治疗，还是很好的诊断方法。比较有趣的是可以将细胞死亡标记物运送到眼睛的后部，特别是达到视网膜，以 监测青光眼等退行性疾病相关的细胞死亡。在此之前，有必要通过玻璃体或静脉途径运送 细胞死亡标记物，如膜结合蛋白。发明人惊奇的发现，维生素E衍生物，特别是生育酚可以作为载体，提高局部给药 后将膜结合蛋白等试剂传输到眼后部。本发明还提供了一种由维生素E衍生物和一个细胞死亡标记组成的药物组合物。还提供了维生素E衍生物作为载体用于将试剂传输到眼后部的方法。进一步提供了一种将试剂传输到眼后部的方法，包括将与维生素E衍生物联合的 试剂局部给药于眼睛。此处的术语“维生素E衍生物”是指与α -生育酚具有类似生物活性的母生育酚 或生育三烯酚衍生物。优选地，该术语为生育酚和生育三烯酚。该维生素E衍生物有8种 维生素E异构体四种生育酚拥有4’，8’，12’ -三甲基十三烷基植醇侧链，四种生育三烯酚 由于在侧链3’，7’和11’位置存在双键而不同。该术语还包括生育酚和生育三烯酚的衍生 物分子，或其分子变异体，他们的结构稍有不同，但具有类似的功能。维生素E是由生育色原烷醇(tocochromanols)的两个同源系列组成，即“生育酚” 和“生育三烯酚”。优选地，生育酚为具有维生素E活性的单、双或三甲基生育酚。该术语 是公众已知的。生育酚的定义还可以包括生育酚的衍生物，特别是功能性衍生物，也就是说 他们保留母分子的载体功能。生育酚衍生物的一个例子是TPGS (D-α -生育酚琥珀酸酯化 的聚乙二醇1000)。生育三烯酚是侧链带有三个双键的母生育酚，即，在植基链上另有三个 双键，形成6-(3，，7，，11，，15，-四甲基-2，，6，，10，，14，-十六碳四烯基萘)-1，4-氢醌或 2-甲基-2-(4，8，12-十三碳三甲基一3，7，11-三烯)苯并二氢吡喃-6-酚基。天然产品可 以在色原烷醇(chromanol)的5，7和8位置的一个或多个位点处携带甲基，除了植基样侧 链上的不饱和位置，与生育酚都是一样的。这些类似物环化形成色原烷醇衍生物，氧化可以 形成生育三烯酚醌(或色原烯醇chromenols)。生育三烯酚这个术语用于说明其与母生育 酚和生育烯酸(tocoenols)(像维生素E样)的关系，色原烷醇这个术语用于说明其与维生 素K和辅酶Q系列的异戊间二烯类化合物的关系。术语“细胞死亡标记物”是指可以使活细胞与处于死亡状态或已经死亡的细胞相区分的标记。例如，可以是与活细胞特异性结合但不与死亡或正处于死亡状态的细胞结合， 或特异性地与死亡或正处于死亡状态的细胞结合而不与活细胞结合的一种化合物或分子。 细胞死亡标记物包括，例如膜结合蛋白家族成员。膜结合蛋白是一类在阳离子存在下，可以 与细胞膜可逆结合的蛋白质。本发明中的膜结合蛋白可以是天然的或者重组的。蛋白质可 以是完整的或功能性片段，也就是说与完整蛋白一样，可以和同一分子特异性结合的膜结 合蛋白的片段或区域。还包括这些蛋白质的功能性衍生物。特别是，该术语还包括含有“膜 结合蛋白重复”的分子，也就是无论单个膜结合蛋白还是这个家族成员之间保守的约70个 氨基酸。各种膜结合蛋白都可以利用，例如美国专利申请公开说明书No. 2006/0134001A中 描述的膜结合蛋白。优选的膜结合蛋白为公知的膜结合蛋白V。其他的膜结合蛋白包括2， 6和11。细胞死亡，特别是公知的凋亡的其他标记物包括，例如突触结合蛋白和碘化丙啶的 C2A 区域[Jung (荣格)等，((Bioconjing Chem. )) 2004 年 9-10 月；15 (5) :983-7]。细胞死亡标记物可以标记荧光或其他可见的或可鉴别的标记。例如，细胞死亡标 记物可以标记红外或红外标记，特别是红外标记。细胞死亡标记物可以采用标准技术进行 标记。术语“眼睛的后部”是指眼睛后部的结构，包括例如晶状体、小梁网、眼色素层(包 括睫状体)，玻璃体和视网膜。特别是，本发明还包括视网膜的改进传输。生育酚还可以作为其他活性试剂和药物使用，例如神经保护剂(如美金刚胺)， 生长因子和生长因子拮抗剂(包括抗血管形成分子)，抗体(如雷珠单抗注射液和阿瓦斯 丁)，适配体(如哌加他尼钠)，类固醇(如去炎松)，分子试剂。本发明的组合物至少还可以包括磷酸酰丝氨酸(或磷脂酰乙醇胺等类似分子)和 胆固醇，或其氧类固醇等衍生物的一种。本发明所述的组合物可以将其他分子、试剂或组合物传输到眼睛的后部。相应的， 该组合物还可以含有一个或多个可以传输的试剂。例如，这些试剂可以包括治疗或生物活 性试剂。本发明所述的药物组合物被制成适于服用的剂型。服用的方法是现有技术中公知 的，例如可以是静脉注射、腹腔注射、肌肉内注射、玻璃体内注射、腔内注射、皮下注射或局 部给药。用于皮内或皮下注射用的溶液或悬浮液至少包括以下组分之一无菌稀释液，如 水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或甲基 安息香酸酚酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓 冲液，如乙酸、柠檬酸或磷酸；和张度剂，如氯化钠或葡萄糖。PH值可以用酸或碱校正。这 种制剂可以密闭保存在安培瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。用于静脉或玻璃体注射用的溶液或悬浮液可以包括一个载体，如生理盐水、无菌 水、活性剂ELT(BASF，帕西帕尼，NJ)、乙醇或多元醇。所有的实施例中，组合物必须是无 菌、易于注射的液体。采用卵磷脂或表面活性剂可以获得合适的流动性。该组合物在生产 和贮存条件下还必须是稳定的。通过使用抗细菌试剂和抗真菌试剂可以阻止微生物，如苯 甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在很多实施例中，该组合物还可以包括等渗剂 (糖)、多元醇(甘露醇和山梨醇)或氯化钠。通过添加可以延长吸收的试剂可以获得长 时间吸收的组合物，如单硬脂酸铝和明胶)。
本发明的药物组合物优选局部给药，也就是说，优选在眼球表面以滴液的形式或 其他局部给药形式用药。相应的，该药物组合物还可以包括其他用于注射的载体、运载工具 或辅料，如氯化钠、苯扎氯铵、磷酸二氢钠一水合物、无水磷酸二钠和水。本发明还提供了维生素E衍生物作为载体运输至少一种试剂到眼后部的应用。维 生素E衍生物可以与细胞死亡标记相连接，例如前述讨论的药物组合物可以作为载体。该 载体可以用于传输治疗、诊断或其他试剂到视网膜和周围区域。本发明还提供了这些试剂 的传输方法。以下将参考附图，仅通过实施例详细描述本发明如下
图1描述了玻璃体内注射星孢菌素(SSP)诱导凋亡后，局部给药膜结合蛋白V，30 分钟内在大鼠视网膜形成的DARC图像。这个图像清晰地显示SSP诱导的视网膜神经节细 胞凋亡被标记后，在视网膜中可以检测到红外膜结合蛋白V。图加玻璃体内注射星孢菌素(SSP)诱导凋亡后，局部给药膜结合蛋白V，2个小时 内在大鼠视网膜形成的DARC图像。这个图像清晰地显示SSP诱导的视网膜神经节细胞凋 亡被标记后，在视网膜中可以检测到红外膜结合蛋白V。图2b是相关的组织学图像。图3局部给药后1小时，荧光标记的膜结合蛋白5 (Anx-F)与不同维生素E衍生物 联合作为载体的实施例。图4描述了在眼部施用α-生育酚Anx-F后，一系列时间内形成的眼部图像。该 图像是局部给药后在一定时间点拍摄成像。图5显示了膜结合蛋白5的晶体结构(见左侧)，该结构是膜结合蛋白家族成员的 共有模式。蛋白质的高度α-螺旋中心含有钙的结合位点，其在膜结合蛋白的整个进化过 程中都是保守的。图6描述了膜结合蛋白5，2，6和11的线性图表。N端在左边，C端在右边。每个 蛋白质的中心都用灰色方格表示，每个方格对应公知的“膜结合蛋白重复”，其结构为单个 膜结合蛋白及这个家族成员之间都保守的约70个氨基酸。图7描述了局部给药2小时后，带有α-生育酚的荧光标记膜结合蛋白11施用到 同一眼睛获得的体内成像图像。图8描述了维生素E衍生物与一个细胞死亡标记物联合的实验结果。图9描述了将药品运送到后部的实验结果。图10描述了针对视网膜前面的平面，形成的带有α -生育酚的荧光标记膜结合蛋 白施用于同一眼睛基底的结果(左侧)，施用1小时后的结果(右侧)。
具体实施例方式图1和图2显示，生育酚可以用于眼部的膜结合蛋白V的传输。在玻璃体内注射星孢菌素(Maurosporine，SSP)以诱导细胞凋亡，2小时后，将混 合后的荧光标记的膜联蛋白V与生育酚局部给药于眼睛。通过DARC成像检测眼睛的细胞死亡。实施例1 红外标记的膜结合蛋白V运载到眼部，以进行DARC(凋亡的视网膜细胞 的检测)成像。
在大鼠眼部采用玻璃体内注射星孢菌素(SSP)以诱导视网膜神经节细胞(RGC) 的凋亡。2个小时后，局部给药红外标记的膜结合蛋白V与生育酚的混合物。应用改造 的cSLO(共焦激光扫描检眼镜)与DARC(凋亡的视网膜细胞检测)技术1在790nm波长 下对眼睛进行成像[海德堡视网膜血管造影2，海德堡工程，达森海姆，德国(Heidelberg Retina Angiograph 2，Heidelberg Engineering，Dossenheim，German) ] 1,2,30 用标准镜头 (15° X15°到30° X30° )和宽场镜头(55° -所有的度数值都是通过人眼校对)。在 不同聚焦背景下，拍摄大鼠视网膜的反射和相应的荧光图像。为提高信噪比和图像的对比 度，在眼睛运动校准后，计算一系列单一的图像(多达100个)的输出平均值。在视网膜内可以清晰地观察到红外膜结合蛋白V，并显示出凋亡的细胞。图2是在 2个小时后进一步成像的结果。实施例2 用于载体的不同维生素E衍生物维生素E用于所有母生育酚和生育三烯酚衍生物的遗传学描述，所述的维生素E 与α-生育酚具有类似的生物学活性，是第一个被特征化的分子(1)。所述的维生素E有8 种维生素E异构体其中，4种生育酚拥有4’，8’，12’ -三甲基十三烷基植醇侧链，4种生育 三烯酚由于在侧链3’，7’和11’位置存在双键而不同。(a)母生育酚
权利要求
1.一种药物组合物，该药物组合物包含维生素E衍生物和细胞死亡标记物。
2.如权利要求1的所述的药物组合物，其特征在于，所述的细胞死亡标记物为膜结合 蛋白。
3.如权利要求2的所述的药物组合物，其特征在于，所述的膜结合蛋白为膜结合蛋白V。
4.如前述任一项权利要求的药物组合物，其特征在于，所述的维生素E衍生物为生育 酚或其衍生物。
5.如权利要求4的药物组合物，其特征在于，所述的生育酚为D-α-生育酚琥珀酸酯化 的聚乙二醇1000。
6.维生素E衍生物作为载体在提高至少一种试剂运输到眼后部中的应用。
7.如权利要求6的应用，其特征在于，所述的试剂包含细胞死亡标记物。
8.如权利要求6或7的应用，其特征在于，所述的维生素E衍生物为生育酚，优选为 D-α -生育酚琥珀酸酯化的聚乙二醇1000。
9.如权利要求6到8中任意一项的应用，其特征在于，所述的维生素E衍生物为局部给药。
10.如权利要求6到9中任意一项的应用，其特征在于，所述的载体用于提高视网膜的运输。
11.一种将至少一种试剂传输到眼后部的方法，该方法包含将试剂与维生素E衍生物 联合对眼部给药。
12.如权利要求11的方法，其特征在于，所述的试剂和维生素E衍生物为局部给药。
13.如权利要求11或12的方法，其特征在于，所述的维生素E衍生物为生育酚，优选为 D-α -生育酚琥珀酸酯化的聚乙二醇1000。
14.如权利要求11到13的任意一项的方法，其特征在于，所述的方法是将试剂传输给 视网膜。
15.如权利要求11到14的任意一项的方法，其特征在于，所述的试剂为细胞死亡标记物。
16.如权利要求15的方法，其特征在于，包含传输第二种试剂。
全文摘要
本发明涉及一种将试剂运载到眼睛后部的载体，所述的载体包含维生素E衍生物，特别是维生素E。该载体还可以包含细胞死亡标记物，如膜结合蛋白。
文档编号A61K47/22GK102083411SQ200880121274
公开日2011年6月1日 申请日期2008年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者弗兰斯卡·M·科迪罗, 斯蒂芬·莫斯 申请人:Ucl商业股份有限公司