专利名称：：栀子提取物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药提取物的制备方法，特别是涉及栀子提取物制备方法。
背景技术：
：目前，京尼平苷的提取方法一般采用氯仿、无水乙醇等有机溶剂在索氏提取瓶中提取，得到栀子中总的活性成分栀子总苷，然后再上硅胶柱分离，用一定比例的甲醇、氯仿混合液洗脱，洗脱液在丙酮中进行重结晶得京尼平苷晶体，一般100g栀子果中可分离得到4.Og左右京尼平苷，但该方法不适宜工业化生产，只能进行实验生产。根据目前文献的报道，在栀子苷含量较高的栀子提取方法中，多用乙醇回流提取，但乙醇回流提取具有局限性，而本方法中使用水提取，相对乙醇提取而言，水提取更适用于大生产，设备简单，成本低，安全度高。另有文献报道用微波提取栀子苷，从栀子苷得率的数据显示看，微波法与水煮法的得率并没显著提高，只高了4个百分点，但微波提取设备成本高，使用不广泛。蔡美强、计建炳等研究了超声波提取法，但此提取方法不适宜于大生产，设备昂贵。而有文献报道氧化铝柱层析法对栀子苷的分离有较好的效果，但氧化铝价格较高，在生产上的应用有一定的局限性。另有文献报道单独采用大孔树脂纯化栀子苷，该方法得到的较高纯度栀子苷和环烯醚萜苷类提取方法都用乙醇提取，如姚干等用HPD450大孔树脂吸附纯化栀子总环烯醚萜苷、栀子苷，得到提取物中栀子苷含量为62.28%，总环烯醚萜苷含量为83.72%，其提取工艺为取栀子药材，破碎，称取20kg，加8倍量70%乙醇，回流2次，每次1.5h，合并提取液，高速离心，离心液回收乙醇、喷雾干燥，制备干浸膏，该过程工艺复杂，成本高，不利于大生产；同样王冰等富集栀子中环烯醚萜苷类也是用大孔树脂，得到提取物中环烯醚萜苷含量为70%，其提取方法为栀子药材加80%乙醇回来提取2次，每次加入4倍量溶媒，各回流lh，滤过，合并滤液，减压浓縮，加乙醇沉淀得上清液，再加水和盐酸调PH使沉淀，加热后冷藏，滤过，低温减压浓縮得浸膏，浸膏上树脂后洗脱液用80%乙醇，该提取方法和树脂洗脱液都用高浓度乙醇，造成浪费，同时工艺复杂，不适宜大生产；廖夫生等研究栀子中京尼平苷的提取分离工艺，其提取工艺采用热浸提法，水饱和正丁醇浸提，树脂洗脱液用0.5%NaOH，浸提方法的溶剂用量大，呈静止状态，溶剂的利用率较低，有效成分浸出不完全，使用碱性溶液洗脱，会对设备有腐蚀作用，不利于工业化。梁正华等研究活性炭联合大孔树脂分离纯化京尼平苷，与本实验有相似之处，但其目的与实际操作方法并不相同。梁正华等的目的在于从栀子黄废液中分离的到栀子苷，而我们是直接从栀子中得到。在提取方法上前者采用浸提法，以水为溶媒，取滤液，经树脂吸附栀子黄色素后的栀子黄废液，作为备用溶液，再用该溶液经活性炭和大孔树脂吸附洗脱；其用活性炭静态吸附栀子黄废液后用10BV水冲洗，10BV10X乙醇冲洗，再用4BV无水乙醇洗脱，采用抽滤的方法得到滤液，低温干燥得京尼平苷粗品，该过程中使用无水乙醇洗脱，成本高，杂质多，使得粗体物的纯度较低，文献中数据显示最后经活性炭吸附后的粗提物栀子苷含量为17.56%，而我们采用活性炭后得到的粗体物中栀子苷含量达到30%以上，其对活性炭和洗脱液使用抽滤方法，少量生产时适用但大量生产时会造成堵塞，不易控制等问题，并且在洗脱活性炭的过程中没有设定流速，造成操作的误差，会使结果不稳定，不精确，而我们经过实验筛选出最佳吸附及洗脱流速，使工艺操作可控；其用大孔吸附树脂洗脱时使用70%乙醇洗脱，而我们使用30%乙醇洗脱，这样可以节约乙醇，同时洗脱的杂质少，从而最后得到提取物纯度高。
发明内容本发明目的在于提供一种提取效率高、成本低、适合工业化制备栀子提取物的方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的栀子提取物的制备方法包括如下步骤步骤1:取栀子药材，水煎煮提取2-4次，每次加6-30倍量的水，浓縮；步骤2:加入乙醇使药液含醇量达50%_80%，放置，抽滤，滤液回收乙醇，加水调节药液浓度以栀子原药材的重量与药液的体积比计为栀子药材药液=l-2:l-2(g/ml);步骤3:采用静态吸附法进行活性炭净化处理；上样量以栀子原药材的重量与活性炭重量比计算为栀子药材活性炭=i:l-3，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附3-6小时，上柱，先用水洗，再用50%-80%乙醇洗脱，洗脱流速为0.6-1倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇至相对密度0.5-1.05，得栀子提取液A或干燥得栀子提取物B;步骤4:取大孔树脂，装柱；将上述栀子提取液A直接上样或提取物B加水制成浓度为O.03-0.lg/mL的药液后上样；上样体积为l-3倍柱体积，以O.2_1.0倍柱体积/小时的流速吸附，1-3倍柱体积水、1-3倍柱体积的3%-10%乙醇洗脱，3-8倍柱体积的20%-50%乙醇以0.2-0.5倍柱体积/小时的流速洗脱，收集20%_50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。优选为，所述步骤1中栀子药材加8-12倍量的水煎煮，每次1-3小时；优选为，所述步骤2中加入乙醇后放置18-48小时，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗涤液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml;优选为，所述步骤3中栀子提取液A6(TC减压干燥得栀子提取物B;加水制成浓度为0.07g/mL的药液，优选为，所述步骤3中静态吸附法进行活性炭净化处理，活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味；优选为，所述步骤3中上样量为栀子药材活性炭=1:1.2，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时；优选为，所述步骤4中量取H103、HPD450、HPD600、HPD750或D101型大孔树脂中的任意一种装柱，径高比为1/8-1/4;水洗至无醇味；优选为，所述步骤4上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗5脱；进一步优选地，收集25-35%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥。所述步骤3中栀子原药材的重量与活性炭重量比计算是指药液先折算出被提取的栀子原药材的重量后与活性炭的比值为1:l-3;所述步骤3中洗脱流速以"倍生药量/小时"为单位计算是指药液折算被提取的栀子原药材的重量与时间的比。所述重量/体积为g/ml。最优选地，栀子提取物制备的方法包括如下步骤步骤1:取栀子药材50g，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C);步骤2:加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置2处，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml;步骤3:采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味；上样量为栀子药材活性炭=1:1.2，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物；步骤4:量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味；将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥。本发明提供一种栀子提取物，该栀子提取物由如下方法制成步骤1:取栀子药材，水煎煮提取2-4次，每次加6-30倍量的水，浓縮；步骤2:加入乙醇使药液含醇量达50%_80%，放置，抽滤，滤液回收乙醇，加水调节药液浓度以栀子原药材的重量与药液的体积比计为栀子药材药液=1-2:1-2;步骤3:采用静态吸附法进行活性炭净化处理；上样量以栀子原药材的重量与活性炭重量比计算为栀子药材活性炭=i:l-3，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附3-6小时，上柱，先用水洗，再用50%-80%乙醇洗脱，洗脱流速为0.6-1倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇至相对密度0.5-1.05，得栀子提取液A或干燥得栀子提取物B;步骤4:取大孔树脂，装柱；将上述栀子提取液A直接上样或提取物B加水制成浓度为O.03-0.lg/mL的药液后上样；上样体积为l-3倍柱体积，以O.2_1.0倍柱体积/小时的流速吸附，1-3倍柱体积水、1-3倍柱体积的3%-10%乙醇洗脱，3-8倍柱体积的20%-50%乙醇以0.2-0.5倍柱体积/小时的流速洗脱，收集20%-50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。上述栀子提取物，优选由如下方法制成步骤1:取栀子药材一定量，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至6(TC相对密度1.05;步骤2:加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置2处，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml;步骤3:采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味；上样量为栀子药材活性炭=i:1.2，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物；步骤4:量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味；将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。上述栀子提取物可按常规工艺加入辅料制成片剂、胶囊、口服液、滴丸、喷雾剂、颗粒剂、鼻腔吸入剂、滴鼻剂等临床可接受的剂型；所述辅料包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、填充剂、稀释剂、吸收剂、表面活性剂、吸附剂、基质等。本发明提供的栀子提取物的制备方法，提取效率高。纯化方法本实验采用的是活性炭联合大孔树脂，使得提取物中栀子苷的含量大大提高，活性炭对栀子中的黄色素有很强吸附作用，洗脱液的颜色明显较直接用大孔树脂吸附后的洗脱液颜色浅，从而很好的实现环烯醚萜苷类物质与黄色素类物质分离，并且该过程实现了中试生产，操作简便，结果稳定，为栀子提取物的大生产奠定了基础。在活性炭纯化的基础上再用大孔吸附树脂纯化，从洗脱液纯度来看，树脂洗脱溶液用乙醇较其他方法的乙醇浓度低，用醇量少，节约成本，洗脱下来的杂质相对较少，纯度相对较高；从洗脱液的颜色来看，H103树脂的醇洗液呈浅黄白色，其他则为黄色甚至深黄色，这一点对制剂生产的色泽控制也是非常有利的。下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例1提取方法优选实验1.1提取方法的选择1.1.1实验方法水煎煮法取50g药材粗粉，加10倍量水，煎煮3次，每次2h，滤过，合并滤液，浓縮至稠膏，7(TC减压干燥。平行做2份。乙醇回流取50g药材粗粉，加10倍量70%乙醇，回流3次，每次2h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，浓縮至稠膏，7(TC减压干燥。平行做2份。乙醇渗漉取50g药材粗粉，加适量70X乙醇，拌匀，密闭放置lh，将药材加于渗漉筒内，加适量溶剂，没过药材数厘米，加盖放置24h，用约10倍量70%乙醇进行渗漉，收集渗漉液，减压回收乙醇至无醇味，浓縮至稠膏，7(TC减压干燥。平行做2份。1.1.2栀子苷高效液相色谱法的含量测定1.1.2.1色谱条件色谱柱(:18色谱柱(Diamonsil(TM)钻石250X4.6mm，5ym)，流动相:乙月青:水(15:85);检测波长238nm;流速1.0ml/min;柱温室温，栀子苷可基线分离。见附图1及附图2。1.1.2.2线性关系考察精密称取栀子苷对照品1.25mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，得对照品溶液，精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0iU分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，栀子苷量(yg)为横坐标，绘制标准曲线，见表l。计算回归方程为Y=756510X-12199R=0.9999表1栀子苷线性关系考察结果样品号进样量"g)峰面积(Y)10,12584891.520.250175126.530.37526907840.50036618250.625462182.5结果表明，栀子苷在O.1250.625iig范围内线性关系良好.1.1.2.3样品的含量测定精密称取各样品约0.lg，加20ml甲醇，称重，超声30min，静置，补重，滤过，取续滤液5ml于50ml量瓶中，用甲醇定容，分别精密吸取5yl进样，测定，结果见表2:表2不同提取方法的考察结果提取方法出膏率(%)浸膏中栀子苷的含量(％)栀子苷含量《)水煎煮32.8112.624.1432.4112.003.8970%乙醇回流26.2614.933.9226.6715.004.0070%乙醇渗漉20.6018.543.8220.2518.073.66说明栀子苷的含量=浸膏中栀子苷的量/栀子药材的用量X100%结论通过比较发现水煎煮和乙醇回流的提取效率较高，渗漉法提取的纯度较前两者为好，水煎煮的出膏率较大，综合考虑生产成本的高低，生产工艺的繁简等问题，采取水煎煮方法进行正交试验设计优选最佳工艺。1.2水提工艺的优选1.2.1提取条件的考察以水为溶剂进行提取，选择溶剂用量，提取时间，提取次数，浸泡时间四个因素，每因素设计三个水平，因素水平见表3，按照正交设计表L9(34)进行试验，以栀子苷含量为指标进行工艺考察。表3栀子提取工艺因素水平表8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.2.2提取工艺称取栀子药材50g，按照正交试验设计因素水平表进行试验，加水煎煮提取，提取液滤过，合并滤液，浓縮，减压干燥得干浸膏。每号试验平行操作两份，共计18份。1.2.3含量测定结果及方差分析见表4及表5表4栀子提取工艺正交试验的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>以栀子苷含量为考察指标，各因素作用的主次为C〉B〉A>D，方差分析结果表明A因素、B因素和C因素均具有极显著性影响(P<0.01)，在A因素中A2>A3>A,选A2水平，在B因素中B2>B3>选B2水平，在C因素中C3〉C2>Q选C3水平，D因素没有显著性影响(P>0.05)，考虑到省时、经济等原因优选工艺为A2B2(y^。即最佳工艺为以10倍量水，煎煮提取3次，每次1.5小时。1.2.4验证实验称取栀子药材50g，以10倍量水，煎煮提取3次，每次1.5小时，提取液滤过，合并滤液，浓缩成稠膏状，减压干燥，即得干浸膏。平行操作三份。按2.1.2.3项下方法进行含量测定，结果见表6表6验证实验结果实验号栀子苷的含量(%)4.144.154.21_结论由以上数据结果可以看出该工艺稳定可行。实验例2醇沉工艺的优选实验2.1实验方法取药材600g，按正交试验优选出的工艺分3批进行提取，提取液分别浓缩至相对密度(20°C)为1.04，1.08，1.12，在每个水平下加入95%乙醇，使含醇量分别达到60%，70%，80%，静置24h，抽滤，以适量相同浓度的乙醇溶液洗涤沉淀，滤液回收乙醇，至稠膏状，减压干燥，得干浸膏。2.2含量测定结果见表7、表8及表9:表7醇沉工艺的考察结果(1)-相对密度L04(20。C)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表8醇沉工艺的考察结果(2)-相对密度1.08(20°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表9醇沉工艺的考察结果(3)-相对密度1.12(20°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注栀子苷含量=测得的栀子苷的量/药材X100%转移率=醇沉后栀子苷的量/醇沉前栀子苷的量X100%结论从表中可以看出在不同的醇沉条件下，栀子苷的转移率不同，而且醇沉的浓度越大，则有效成分的转移率越低。其中以浓縮到相对密度1.04(20°C)，60%醇沉的转移率最高，但相对密度越低，则在实验中使用的溶剂量越大，故考虑到节约成本等因素，选择浓縮到相对密度为1.12(20°C)，60%醇沉。2.3验证实验取50g药材，按确定的工艺进行提取，醇沉，含量测定，平行做3份。结果见表10表10醇沉工艺验证结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注验证实验中醇沉前样品液的栀子苷含量折合到药材为4.18%结论由以上数据可以看出该工艺稳定可行。实验例3纯化工艺的优选实验活性炭的预处理取50g，15(TC活化4小时，取出，称量50g，加蒸馏水浸泡1小时，并不断搅拌除气泡，装柱，再用乙醇洗，至洗脱液蒸干后无残留，改用蒸馏水洗至无醇味，备用。样品液的制备称量栀子药材50g，按最佳工艺提取，加水10倍量，提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度为1.12(20°C)，加乙醇使含醇量达到60%，静置24h，抽滤，滤液回收乙醇，得样品液。3.1比较不同的上样浓度，摸索动态上样的最大吸附量取相同规格的吸附柱3根，分别装30g处理过的活性炭。取浓度为0.05g/ml、0.lg/m1、0.2g/ml(药材/药液)的样品液上样，每次上样25ml，上样50g后，每25ml接一份流出液用HPLC测其栀子苷的含量，以检测是否泄漏。当有大于15%的药液流出时认为已经泄漏，此时已达到吸附柱的最大吸附量，停止上样。注泄漏百分比=每份收集液中栀子苷的浓度/上样液中栀子苷的浓度X100%结论上样浓度不同，吸附柱的最大吸附量不同，其中药液浓度为0.2g/ml(药材/药液)时吸附量最大，但在实验中发现，在动态吸附过程中，若关柱子一段时间，柱子的吸附力随即增强且动态吸附损失较大表现在死吸附较大和流失大等方面，所以考虑采用静态吸附的方法进行考察。3.2静态吸附上样浓度的考察取预处理过的活性炭30g，加入浓縮成不同浓度(药材/药液)的样品液，浸泡1小时，在浸泡过程中不断搅拌，装柱，水洗脱至Molish反应呈阴性，测定吸附后样品液中残留的栀子苷的量。结果见表ll:表11静态吸附上样浓度的考察样品液浓度(g/ml)上样量(mg)吸附量(mg〉吸附率(%)1853.19642.1875.270.5853.19537.1262.950.25853.19484.2056.75注吸附量=上样量_样品液中残留的栀子苷量吸附率=吸附量/上样量X100%结论当上样液的浓度为lg/ml(药材/药液)时，活性炭的吸附效率最高。3.3吸附时间的考察静态吸附需要一定的时间才能达到吸附平衡，所以吸附时间不同，吸附效率不同。根据以上实验结果，分别考察不同的吸附时间对吸附效果的影响，结果见表12:表12吸附时间的考察吸附时间(h)_上样量(mg)_吸附量(mg)_吸附率(％)1853.19688.1480.652853.19718.3484.204853.19747.3387.596853.19776,6691.0324853.19807.8194.68结论由以上数据可以看出吸附时间大于4小时，则活性炭的吸附率在85%以上，考虑到节约工时等原因选择4小时作为吸附时间。3.4最大上样量的考察活性炭本身具有一定的吸附能力，若上样量大于其本身的吸附能力，则活性炭不能吸附多余的有效成分，所以需要考察最大上样量。取不同量浓縮成lg/ml(药材/药液)的药液，与30g活性炭混合，静态吸附4小时，上柱，考察最大上样量，结果见表13:表13最大上样量的考察样品液体积(ral)上样量(mg)吸附量(mg)吸附率(％)20666.57663.0999.4830999.83982.3198.25401333.131198.1989.88501666.411337.5880.27结论当上样量小于30ml即生药量小于30g时，活性炭基本上能完全吸附栀子苷，上样量大于30ml时，活性炭不能完全吸附药液中的有效成分，有损失，故最大上样量确定为活性炭药材=1:13.5洗脱溶剂的考察根据有效成分的性质，选择不同浓度的乙醇作为洗脱溶剂进行考察。取4根吸附柱平行操作，以不同浓度的乙醇洗脱，均洗脱10倍柱体积，结果见表14:表14洗脱溶剂的考察乙醇浓度上样量吸附量吸附率洗脱量洗脱率(rag)(rag)(%)(mg)(%)30%999.85967.8896.80436.8245.1350%999.85974.1897.43634.2165.1070%999.85984.7198.497肌0379.2195%999.85966.33恥.65615.7463.72注洗脱量=洗脱液中栀子苷的总量洗脱率=洗脱量/上样量X100%结论由以上数据可以看出，70%乙醇洗脱效率最高，故选择70%乙醇做为洗脱溶剂。3.6洗脱流速的考察考察不同的洗脱流速，结果见表15:表15洗脱流速的考察流速(ml/min)上样量(nig)吸附量(mg)吸附率(％)洗脱量(ing)洗脱率(%)1499.92493.0098.61424.1786.042499.92484.0796.83371.0276,653499.92491.0498.22324.6166.11结论由表中可以看出，流速为lml/min时洗脱效率最高。3.7水洗脱体积的考察按上述优选出的条件考察水洗脱体积，以Molish反应为指标，洗至27倍生药量时Molish反应为阴性，说明以糖类为主的大部分杂质已经被洗脱下来，可以改用70%乙醇进行洗脱。3.8洗脱溶剂的用量考察即洗脱曲线的绘制取15g活性炭，按照前面优选出的条件，上样，洗脱，洗脱液分瓶收集，开始每份为10ml，30ml以后每5ml收集一份，120ml以后每40ml收集一份，测各份洗脱液的浓度绘制洗脱曲线，结果见附图3:结论由图中可以看出洗脱至200ml，即洗脱溶剂为生药量的13倍时，有效成分基本洗脱完全。小结上样液浓度为药材药液=1:1S卩lg/ml(药材/药液)，最大上样量为生药活性炭=1:1，静态吸附4小时，水洗体积为27ml/g生药，醇洗浓度为70X，醇洗体积为13ml/g生药，洗脱流速为lml/min。3.9验证实验根据上述实验结果，取经预处理的活性炭15g，与15ml药液(lg/ml)混合，静置4小时，上柱，先用27倍生药量的水洗脱，再改用70%乙醇13倍生药量洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，减压干燥，得干浸膏，测定含量，并测定吸附后水液中栀子苷的含量。平行做3份。结果见表16:表16验证实验的结果13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结论该工艺方法稳定可行。实验例4放大工艺实验通过对栀子的提取纯化工艺进行初步的系统研究，得到栀子的最佳提取纯化工艺为取栀子药材50g，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.12(20°C)，加入乙醇使药液含醇量达60%，静置24h，抽滤，以适量相同浓度的乙醇溶液洗涤沉淀，滤液回收乙醇，加水使药液浓度为药材药液=i:1，即ig生药/mi，采用静态吸附法进行活性炭纯化处理，上样量为生药活性炭=i:1，静态吸附4小时，先用27倍生药量的水洗去杂质，再改用13倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为lml/min，收集洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥，即得栀子粗提物。下一步将对该小试工艺进一步放大。4.l栀子苷的含量测定4.1.1对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得每lml含有栀子苷0.114mg的对照品溶液。4.1.2供试品溶液的制备精密称取栀子提取物浸膏约10mg，置于25ml量瓶中，用70%乙醇溶解并定容。超声处理20min，放置室温，用70%乙醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得样品供试品溶液。4.1.3色谱条件色谱柱C18色谱柱(DiamonsilTM钻石，5iim，250X4.6mm);流动相乙腈-水(14:86);检测波长238nm;流速1.0ml/min;柱温室温。4.1.4线性关系考察精密吸取4.1.1项下的栀子苷对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.OyL，分别注入高效液相色谱仪，按2.2项下色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，栀子苷的量(yg)为横坐标，加原点进行回归，绘制标准曲线，见表17。计算回归方程为Y二1631X+3.9952，r=0.9998。表17栀子苷线性关系考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>试验结果表明，栀子苷在0.2281.140yg范围内线性关系良好，符合实验要求。4.2考察不同的提取液净化方法对提取物中栀子苷含量的影响不同的提取液净化方法对所得提取物中栀子苷含量有一定影响，本实验考察了醇沉浓度及趁热离心条件对最终的栀子提取物中栀子苷含量的影响，投料量为生药300g，所得栀子提取物中栀子苷含量测定结果见表18。表18不同的提取液净化方法对栀子提取物中栀子苷含量的影响生药量(g)药材中梔子苷含量(％)提取液净化方法提取物中栀子苷含量(％)30060%醇沉35.083004.0270%醇沉34.4530080%醇沉37.18300热离心39.40结论从表中可以看出用不同的方法对上样前的药液进行净化处理，所得到的提取物中栀子苷的含量不同，醇沉的浓度越大，提取物中的栀子苷含量越高。醇沉与热离心的进行比较，醇沉的出膏率略高，但热离心处理后，最终得到的提取物中栀子苷的含量最高，所以实验选择用热离心方法对上样前的药液进行预处理，并验证其可行性。4.3采用离心法对提取液进行净化处理由前述比较试验可知，采用离心法对上样前药液进行净化处理，得到的栀子提取物中栀子苷的含量较高，且离心处理有利于节约成本和时间，因此改用离心法对上样前的药液进行净化处理，投料量为栀子生药1000g，验证工艺放大后的可行性，所得栀子提取物中的含量测定结果见表19:表19离心处理栀子提取物的含量测定结果(n=4)生药量(g)药材中栀子苷含量(％)栀子提取物中栀子苷含量(％)100021.0110004,0224.98100020.74100025.24由表中结果可知提取物中栀子苷含量较低，在2026%之间，考虑原因可能是提取液净化方法对放大工艺的影响，因此不再采用离心的方法对提取液进行净化，即需考察醇沉对栀子提取物质量的影响。4.4采用醇沉法对上样前药液进行净化处理由于离心处理后所得栀子提取物中栀子苷含量低，考虑按照原工艺改用60%醇沉处理提取液，投料量为生药1000g，验证工艺放大后的可行性，所得栀子提取物中栀子苷含量测定结果见表20:表20醇沉处理中间体含量测定结果药液前处理方法出膏率(%)浸膏中栀子苷含量(％)60%醇沉7,9021.7060%醇沉7.2527.3060%醇沉7.0024.88由表中结果可知采用60%醇沉处理上样前的药液后得到的栀子提取物中栀子苷含量在2030%之间，4.2及4.3项下所使用的药材中栀子苷含量为4.02%，考虑原因可能是药材含量低，导致最终得到的栀子提取物中的栀子苷含量较低，在以后的实验中对栀子药材中栀子苷含量进行控制。4.5比较不同栀子苷含量的药材对栀子提物中栀子苷含量的影响由以上放大试验考察结果可以看出，药液预处理方法对中间体中栀子苷含量影响不显著，现考察不同栀子苷含量的药材对栀子提取物中栀子苷含量的影响，并选择热离心法对上样前的药液进行预处理，调节乙醇洗脱体积(20倍于生药量)。投料量为栀子生药1000g，所得栀子提取物中栀子苷含量测定结果见表21:表21不同含量的药材经放大工艺后所得栀子提物中栀子苷含量药材含量(％)干浸膏中栀子苷含量(％)4.0225.245.4535.694.8026,355.0435.68结论以上试验结果表明，栀子药材中栀子苷的含量对提取纯化后所得栀子提取物中的栀子苷含量有显著影响。因此，在进行栀子提取物的制备时必须严格控制药材中栀子苷含量，才能达到比较理想的富集纯化作用。4.6验证试验根据4.4项下试验结果，进行了验证试验(n=3)，所得栀子提取物中栀子苷含量测定结果见表22:表22栀子提取物中栀子苷含量测定结果药材含量《)出膏率(％)干浸膏中栀子苷含量(％)5.456,3537,655.457.4735.695.458.241.07由以上实验结果可知，药材含量是栀子提取物中栀子苷含量的重要影响因素，因此，在投料时应该严格控制药材质量，从而更好的控制所得栀子提取物的质量。4.7中试生产基于以上放大试验研究，进行了中试生产。由于在中试生产过程中发现离心操作时，药液较粘稠，离心操作不容易进行，且沉淀会包裹栀子苷于其中，因此采用60%、70%醇沉方法对上样前的药液进行预处理，结果如表23:表23中试生产结果投料量醇沉浓度煎煮转移率醇沉转移率出膏率浸膏中栀子苷含量总转移率(％)(kg)(W)(%)(%))356076.9159.874.1426.3523,20507065.7789.235.1435.6836.38结论表中试验结果表明70%醇沉对提取液进行预处理，所得栀子提取物中栀子16苷的含量较高，而60%醇沉时沉淀厚而不实，滤过困难，导致醇沉转移率低，所得的栀子提取物中栀子苷含量较低。因此确定中试生产时采用70%醇沉对上样药液进行预处理。实验例5大孔树脂纯化实验5.l栀子苷的含量测定5.1.1对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得每lml含有栀子苷0.1344mg的对照品溶液。5.1.2供试品溶液的制备精密称取栀子粗提取物浸膏约10mg，置于25ml量瓶中，用70%乙醇溶解并定容。超声处理15min，放置室温，用70%乙醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得样品供试品溶液。精密称取栀子提取物浸膏约10mg，置于50ml量瓶中，用70%乙醇溶解并定容。超声处理15min，放置室温，用70%乙醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得样品供试品溶液。5.1.2色谱条件色谱柱C18色谱柱(DiamonsilTM钻石，5iim，250X4.6mm);流动相乙腈-水(14:86);检测波长238nm;流速1.0ml/min;柱温室温。5.2树脂类型的优选采用静态吸附法，通过测定吸附残液和解吸液的指标成分含量筛选最适树脂。根据本实验室之前对栀子纯化工艺的树脂筛选，并且参考了相关文献后选择了5种吸附解析效果相对较好的H103、HPD450、HPD600、HPD750、D101进行测定，测定方法为将经过预处理的大孔树脂去除表面水后，各取10ml分别置于具塞磨口三角瓶中，加入准确量取半成品溶液25ml，浓度为0.08g/ml(相当于0.08g栀子粗提物/ml)，浸渍24h，使树脂充分吸附后，抽滤。并以50ml蒸馏水洗涤树脂，洗涤液与滤液合并，定容至100ml量瓶中，吸取lml水浴蒸干，用70%乙醇转溶至25ml量瓶中，微孔滤膜滤过，测定栀子苷浓度评价吸附效果。向树脂中加入50ml95X乙醇浸渍24h使栀子苷解吸附，滤过。用95X乙醇50mL洗涤树脂，定容至100ml量瓶中，吸取lml用70%乙醇定容至50ml量瓶中，微孔滤膜滤过，测定其中的栀子苷浓度，按下式计算各树脂室温下的比吸附量(mg/ml)和解吸率(％)结果见表24。比吸附量=(吸附前浓度_吸附后浓度)X吸附液体积/树脂体积解吸率=解吸液中总栀子苷含量(mg)X100%吸附量(mg)结果见表24。表24大孔树脂对栀子苷的静态吸附解吸附效果比较17<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注吸附解吸结果=吸附量X解吸量所用栀子粗提物的栀子苷含量为30.79%(以下试验所用栀子粗提取为同一批)试验结果表明，H103树脂对栀子苷吸附解析效果较好。5.3泄漏曲线绘制量取已处理好的H103树脂20ml分装于2根相同规格的玻璃柱，平行操作，量取浸膏粉药液(0.015g栀子苷/ml)以0.5倍柱体积/h的速度通过树脂柱，每处理1倍柱体积药液流出液单独收集，TLC判断栀子苷泄漏情况，并测流出液中栀子苷浓度，绘制吸附曲线，结果见附图4、5。由上图可看出栀子苷泄露点在3.5倍柱体积附近。5.4水洗体积及洗脱溶剂确定做泄漏曲线后柱子用水洗脱，以Molish反应为指标，洗至2倍柱体积时Molish反应为阴性，且水洗脱液近于无色，说明以糖类为主的大部分杂质已经被洗脱下来，故确定水洗脱体积为2倍柱体积。水洗脱后，用10%、30%、40%、60%、80%乙醇分别3倍柱体积体积进行洗脱，液相测定含量结果如表25。表25乙醇洗脱浓度的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表25可以看出，30%乙醇能将大部分栀子苷解析，但由于乙醇洗脱体积尚未考察，导致解析不完全，将进一步对乙醇洗脱体积进行考察，故先选择30%乙醇做洗脱溶剂。注由于10%乙醇能洗脱下许多杂质，但同时也将栀子苷解析下一部分，故考虑用5%乙醇进行洗脱除杂。5.5最大上样体积确定由于泄漏曲线确定上样量有误差，故精确设计不同体积进行最大上样体积确定，具体操作如下分别量取已离心药液81、90、99ml(分别为4.05g、4.5g、4.95g浸膏)加至已处理好的30ml树脂柱上，用2倍柱体积水洗至近无色，分别用5%、30%乙醇洗脱，收集洗脱液测定其中栀子苷含量，结果见表26。表26最大上样体积及洗脱溶剂确定<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>上表可以看出，最大上样体积影响无显著差异，但99ml上样量后的纯度最高，故选择99ml上样量为最大上样量，即3.3倍柱体积。5%乙醇洗脱杂质后的流出液中仍含有栀子苷，故下一步将考察最佳除杂醇浓度。5.6最佳除杂醇浓度量取已处理好的H103树脂20ml分装于2根相同规格的玻璃柱，平行操作，量取浸膏粉药液(0.015g栀子苷/ml)以1倍柱体积/h的速度通过树脂柱，2倍柱体积水进行洗脱，分别以1%、2%、3%、4%乙醇2倍柱体积洗脱，分别收集洗脱液，蒸干溶剂，减压干燥后称膏重，液相测膏中栀子苷含量。液相图及结果如下表27栀子苷在不同浓度醇洗脱物干膏中的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>由上图及表27可以看出，在2%乙醇洗脱下的杂质最多，同时它对栀子苷的解析附是相对较小的。因此选用2%乙醇洗脱杂质。5.7径高比确定将已处理好的湿体积为13ml、20ml、26ml的树脂分别装于3根相同规格的柱上，使树脂径高比分别为1/4、1/6、1/8，取药液分别上样，以1倍柱体积/h(0.3ml/min)速度进行动态吸附，薄层TLC显示吸附终点，用2倍柱体积水洗脱至近无色，再分别用2%乙醇2倍柱体积，30%乙醇8倍柱体积洗脱，测定栀子苷的比吸附量、洗脱率，结果见表28。表28径高比确定数据<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>根据试验结果确定用径高比为1/6进行试验c5.8上样液浓度的考察取处理好的树脂20ml共3份，装于3根同一型号的层析柱中(径高比为1/6)，分别吸取0.05g/ml的药液66ml，0.075g/ml的药液44ml，0.lg/ml的药液33ml上柱，以1倍柱体积/h的流速进行动态吸附后，用水洗2倍柱体积(即40ml)，2倍柱体积(即40ml)2%的乙醇洗脱，再用30%乙醇8倍柱体积洗脱，流速均为1倍柱体积/h，测定栀子苷洗脱率及洗脱物中的栀子苷含量，结果见表29。表29上样浓度确定浓度(g/ml)上样量(mg)吸附率(％)醇洗脱率(％)吸附率x醇洗脱率0.051016.0799.0285.4384.590.0751016,0797,7084.6782.720.11016.0798.4783.2081.93由表29可以看出，上样液浓度为0.05g/ml时，栀子苷的吸附率与吸附率X醇洗脱率数值均高于其他浓度的药液，因此确定上样液浓度为0.05g/ml。5.9吸附流速确定取药液分别上样于已处理好的湿体积为20ml的3根树脂柱，上样66ml，分别以0.5、1、2倍柱体积/h的流速进行动态吸附，以薄层指示吸附终点，用2倍柱体积水洗脱至近无色，再分别用2%乙醇2倍柱体积、30%乙醇8倍柱体积洗脱，测定洗脱下来的栀子苷含量，结果见表30。还做过4倍柱体积/h薄层显示明显泄漏，故未测含量。表30吸附流速确定流速(倍柱体积/h)上样量(ral)洗脱率(％)出膏率(％)纯度(%)0.56682.4941.6956.4016687,0243.8761.0826689.5945.0366.16分析所测数据和上表看出吸附流速应选择2倍柱体积/h。5.10解吸速度确定取药液分别上样于已处理好的湿体积为20ml的3根树脂柱，上样66ml，以2倍柱体积/h的速度吸附，用2倍柱体积水，2倍柱体积2%乙醇洗脱，再用30%乙醇分别以0.5、1、2倍柱体积/h的流速进行解吸附，测定栀子苷洗脱率，结果见表31。表31解吸速度确定流速(倍柱体积/h)上样量(ml)洗脱率(％)出膏率(％)纯度(%)26680.3644.1652.2816691.4044.3361.900.56696.9738.7880.92由上表可以看出解吸流速对栀子苷纯度的影响较大，以0.5倍柱体积/h最佳，故选0.5倍柱体积/h作为解吸流速。5.11乙醇洗脱体积的考察取处理好的树脂20ml，装于层析柱中，使径高比为1/6，精密吸取0.05g浸膏/ml的栀子药液66ml，，以2倍柱体积/h的流速进行动态吸附后，以0.5倍柱体积/h的流速进行洗脱，首先用水洗2倍柱体积(即40ml)，2%乙醇2倍柱体积洗，再用30%乙醇洗脱，每2020ml收集一份，共收集10份，测定各流份中淫羊藿苷和总黄酮的含量，绘制洗脱曲线，以确定30%乙醇的最佳洗脱体积。结果见表32。表31乙醇洗脱体积的考察洗脱流份1#栀子苷量(mg)2#栀子苷量(mg)1283,64304.632249.12302.193131.45115.56467.4472.63525.2526.24616.4712.77717.8916.73810.886.81910.116.6710微量微量由洗脱曲线可知，栀子苷洗脱9倍柱体积时已基本全部洗脱下来，洗脱率可达98%以上，因此确定乙醇洗脱体积为9倍柱体积。小结选用H103型树脂二次富集纯化栀子的有效成分；树脂径高比为1/6;上样液浓度为0.05g/ml;上样量为0.05g栀子苷/ml树脂；吸附速度为2倍柱体积/h;洗脱速度为0.5倍柱体积/h;水洗脱体积为2倍柱体积；2%乙醇洗脱体积2倍柱体积；洗脱溶剂为30%乙醇，用量为9倍柱体积。5.12与其他联用柱的比较为了进一步证实活性炭柱-H103型树脂柱联用纯化栀子苷的优良性，设计了活性炭_活性炭联用，H103树脂-活性炭联用，H103树脂-H103树脂联用与活性炭-H103树脂联用的吸附解析效果比较，各活性炭的纯化工艺本实验室均已摸索，故按以定工艺进行考察，结果见表33表33各种纯化工艺的比较两种联用吸附剂类型上样量栀T苷(mg)吸附率(%)洗脱率(%)吸附率X洗脱率(％)出膏率(%)浸膏中栀子苷含量(％)活性炭-H103树脂1016.0795.8793.5489.6844.2862.35活性炭-活性炭950.1499,4063.9163.5358.0042.12H103树脂-H103树脂1046.2565.5397.3563.7937.2062.02H103树脂-活性炭929.7588.1170,4157.1047.7851.74由上表可知，活性炭与H103型树脂的联用各条件均优于其它，是这四种中的最佳。5.13验证实验按上述大孔吸附树脂富集纯化工艺制备3批样品，测定栀子苷的含量。结果见表34。表34验证试验<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>由上表看出，该方法稳定可行。实验例6栀子再纯化放大实验量取已处理好的树脂220ml装柱，上样720mL，平行操作2根。按上述条件即径高比为1/6，药液浓度为0.05g/ml，上样体积为3.3倍柱体积，吸附流速为0.9倍柱体积/h(适当放大处理)，解吸流速为0.3倍柱体积/h(适当放大处理)，水洗体积2倍柱体积，2%乙醇体积2倍柱体积，洗脱，分别收集上样漏液，水洗脱液，2%乙醇洗脱液，测定栀子苷含量，30%乙醇9倍柱体积洗脱，合并6倍柱体积30%乙醇洗脱液，单独收集7倍柱体积30%乙醇洗脱液，8倍柱体积30%乙醇洗脱液，9倍柱体积30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，并减压干燥至恒重。结果见表35。表35放大试验结果编吸附率30%醇洗量6倍柱体30%醇洗量7倍柱30%醇洗量8倍出膏率纯度(％)号积/g(%)体积/g(%)柱体积/g(%)1100%10.231(92.30)0052.6453.992100%10.786(97.31)0.023(0.2%)052.1457.46由上表结果可知，放大试验后30%乙醇洗到第6倍时已将栀子苷基本洗脱，故将30%乙醇洗脱体积縮小到6倍柱体积，放大试验后栀子苷的纯度有所下降，考虑可能是洗脱倍数的影响，将多余的杂质带入，同时2%乙醇的除杂程度不如小柱，故考虑将除杂醇浓度加大。6.1放大试验工艺考察6.1.1除杂醇浓度的考察量取已处理好的树脂220ml装柱，上样720mL，平行操作2根。按上述条件即径高比为1/6，药液浓度为0.05g/ml，上样体积为3.3倍柱体积，吸附流速为0.9倍柱体积/h(适当放大处理)，解吸流速为0.3倍柱体积/h(适当放大处理)，水洗体积2倍柱体积，分别用5%乙醇，7%乙醇2倍柱体积体积，洗脱，分别收集上样漏液，水洗脱液，5%乙醇、7%乙醇洗脱液，测定栀子苷含量，30%乙醇6倍柱体积洗脱，合并4倍柱体积30%乙醇洗脱液，单独收集5倍柱体积30%乙醇洗脱液，6倍柱体积30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，减压干燥至恒重，液相侧含量，结果见表36表36除杂醇浓度的优选除杂醇吸附30%醇洗量4倍柱体30%醇洗量5倍柱30%醇洗量6倍柱出膏率纯度浓度率(％)积/g(%)体积/g(%)体积/g(%)(%)5%99.949.632(89.19)0.491(4.5%)0,051(0.5%)46.8357.137%99.869.442(87.43)0.463(4.3%)0.173(1.6%)45.1758.07上样液和水洗脱液均无栀子苷泄漏，5%乙醇和7%乙醇均有微量泄漏，由上表可22以看出，7%乙醇除杂后纯度稍高，且其洗脱液的出膏率较大，因此选择7%浓度乙醇作为除杂乙醇浓度。在第6倍柱体积30%乙醇洗脱时洗脱下的膏中栀子苷含量很少，因此确定30%乙醇洗脱体积为5倍柱体积。6.1.2上样液浓度的优化考虑到大生产中上样浓度低造成上样时间较长，考虑到工时问题，进行上样液浓度的比较。量取已处理好的树脂220ml装柱两份，分别上样770mL(药液浓度为0.05g/mL)、550mL(药液浓度为0.07g/mL)。按上述条件即径高比为1/6，吸附流速为0.9倍柱体积/h(适当放大处理)，解吸流速为0.3倍柱体积/h(适当放大处理)，水洗体积2倍柱体积，分别用5%乙醇，7%乙醇2倍柱体积体积，洗脱，分别收集上样漏液，水洗脱液，5%乙醇、7%乙醇洗脱液，测定栀子苷含量，30%乙醇6倍柱体积洗脱，合并4倍柱体积30%乙醇洗脱液，单独收集5倍柱体积30%乙醇洗脱液，6倍柱体积30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，减压干燥至恒重，液相侧含量，结果见表37。表37上样液浓度的优选上样液浓度上样量(mL)吸附率(％)洗脱率《)出膏率(％)浸膏中栀子苷含量(％)0.0577097.8498.7545.0159.310.0755096.7298.6342.2661.33由上表可以看出，上样液浓度对于样品结果没有显著性差异，为节省上样时间将上样浓度定为0.07g/mL。6.1.3树脂重复使用次数考察将已使用的两根220ml树脂柱用95%乙醇洗至无色，用水洗至无醇味，各上样550ml，按确定工艺进行洗脱，结果见表38。表38树脂重复使用次数考察(n=2)组别试验次数吸附率(％)洗脱率(％)出膏率(％)纯度(％)195.6694.6840.6060.801296.1494.2940.0061.81396.3796.4842.0864.29490.6481.7741.2954.60194.4698.9139.0465.302298.9794.3240.7862.44398.6493.5941.8262.01490,6575.9140.2651.42试验结果表明重复使用三次都无显著变化，第4次纯度下降且洗脱率下降。故确定树脂重复使用第四次后，应进行再生处理。6.2栀子粗提物再富集放大工艺按照上述已定工艺进行再放大，量取已处理好的树脂900mL，装柱，水洗至无醇味，药液浓度为0.07g/mL，上样体积为2.5倍柱体积，2250mL，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，液相测含量。结果见下表39。表39放大工艺结果批次上样量(raL)吸附率(％)洗脱率(％)出膏率(W浸膏中栀子苷含量(％)080601225098.1896.5940.1665.70080609225093.9593.9539.5663.76由结果看出，两次放大试验，其结果稳定，说明该工艺稳定可行。图1栀子苷HPLC图谱图2栀子样品HPLC图谱图3洗脱曲线图41#泄露曲线图52#泄露曲线下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果具体实施方式实施例1:取栀子药材50g，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C)，加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置24h，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml。采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味。上样量为生药活性炭=1:1.2，将规定用量的活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物。量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味。将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥得栀子活性成分。实施例2:胶囊取实施例1制备的栀子活性成分100g经常规工艺制备成胶囊。实施例3:取栀子药材50g，加9倍量的水，煎煮提取4次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C)，加入95%乙醇使药液含醇量达65%，放置24h，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml。采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味。上样量为生药活性炭=1:1.3，将规定用量的活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4.5小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用22倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物。量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味。将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥得栀子提取物。实施例4:取栀子药材50g，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C)，加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置24h，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1.2:1，即lg/ml。采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味。上样量为生药活性炭=1:1.2，将规定用量的活性炭置药液中，搅拌，静态吸附5小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物。量取已处理好的HPD450型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味。将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥得栀子提取物。实施例5:取栀子药材50g，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C)，加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置24h，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml。采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味。上样量为生药活性炭=1:1.2，将规定用量的活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物。量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味。将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥得栀子提取物。实施例6:步骤1:取栀子药材50g，加8倍量的水，煎煮提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C);步骤2:加入乙醇使药液含醇量达65%，放置，抽滤，用乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为栀子药材药液=1:2(重量/体积)；步骤3:采用静态吸附法进行活性炭纯化处理，活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味；步骤4:上样量为栀子药材活性炭=1:1.5，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4.5小时，上柱，先用水洗，再改用乙醇洗脱，洗脱流速为0.7倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，减压干燥得栀子提取物；步骤5:量取已处理好的HPD750大孔树脂，装柱，水洗至无醇味；将上述栀子提取物加水制成浓度为0.05g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥。实施例7:栀子提取物的制备步骤1:取栀子药材50g，加12倍量的水，煎煮提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C);步骤2:加入乙醇使药液含醇量达60%，放置，抽滤，用乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为栀子药材药液=1:2(重量/体积)；步骤3:采用静态吸附法进行活性炭纯化处理，活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味；步骤4:上样量为栀子药材活性炭=1:1.5，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4.5小时，上柱，先用水洗，再改用乙醇洗脱，洗脱流速为0.7倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇得栀子提取液；步骤5:量取已处理好的H103大孔树脂，装柱，水洗至无醇味；将上述栀子提取液上样，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥。实施例8:A栀子提取物制备取栀子药材50g，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.05(60°C)，加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置24h，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml。采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味。上样量为生药活性炭=1:1.2，将规定用量的活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物。量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味。将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥得栀子提取物。质量检测方法A:指纹图谱26照高效液相色谱法(附录VID)测定；色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为238nm;流动相乙腈_水，度洗脱，见下表，流速lml/min，<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>供试品溶液的制备精密称取栀子提取物10mg，置50mL量瓶中，用70%乙醇超声溶解后稀释至刻度，为供试品溶液；测定法精密吸取供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，即得；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(国家药典委员会，2004A版)计算相似度，各批次样品之间的相似度应不小于0.95;含量测定A:总环烯醚萜苷精密量取栀子苷测定项下供试品溶液lml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取栀子苷对照品，加甲醇制成每lml含0.01mg的溶液，作为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(附录VA)，在238nm波长处测定吸光度，计算，即得；本品按干燥品计算，含总环烯醚萜苷以栀子苷(C17H2401Q)计，不得少于80%;B:栀子苷照高效液相色谱法(附录VID)测定；色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(14:86)为流动相；检测波长为238nm;理论板数按栀子苷峰计算应不低于1500;对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每lml含0.lmg的溶液，即得；供试品溶液的制备取本品约0.Olg，精密称定，置50ml容量瓶中，加入70%乙醇，超声处理10min，取出，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ul，注入液相色谱仪，测定，即得；本品按干燥品计算，含栀子苷(C17H2401Q)不得少于60%。实施例9:取栀子药材50g，加11倍量的水，煎煮提取4次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至相对密度1.02(60°C)，加入90%乙醇使药液含醇量达70%，放置32h，抽滤，以4倍生药量的65%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=0.8:1，即0.8g/ml。采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味。上样量为生药活性炭=1:1.2，将规定用量的活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4.5小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用22倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物。量取已处理好的D101型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味。将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附(按比例放大)，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥得栀子活性成分。权利要求栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤1取栀子药材，水煎煮提取2-4次，每次加6-30倍量的水，浓缩；步骤2加入乙醇使药液含醇量达50％-80％，放置，抽滤，滤液回收乙醇，加水调节药液浓度以栀子原药材的重量与药液的体积比计为栀子药材∶药液＝1-2∶1-2；步骤3采用静态吸附法进行活性炭净化处理；上样量以栀子原药材的重量与活性炭重量比计算为栀子药材∶活性炭＝1∶1-3，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附3-6小时，上柱，先用水洗，再用50％-80％乙醇洗脱，洗脱流速为0.6-1倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇至相对密度0.5-1.05，得栀子提取液A或干燥得栀子提取物B；步骤4取大孔树脂，装柱；将上述栀子提取液A直接上样或提取物B加水制成浓度为0.03-0.1g/mL的药液后上样；上样体积为1-3倍柱体积，以0.2-1.0倍柱体积/小时的流速吸附，1-3倍柱体积水、1-3倍柱体积的3％-10％乙醇洗脱，3-8倍柱体积的20％-50％乙醇以0.2-0.5倍柱体积/小时的流速洗脱，收集20％-50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。2.如权利要求1所述的栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法步骤4中选取H103、HPD450、HPD600、HPD750或D101型大孔树脂中的任意一种；径高比为1:8-1:4。3.如权利要求1或2所述的栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法步骤1中栀子药材水煎煮提取为加8-12倍量的水，每次1-3小时。4.如权利要求1或2所述的栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法步骤2为加入乙醇使药液含醇量达50%_80%，放置18-48小时，抽滤，得滤液；以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗涤液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度以栀子原药材的重量与药液的体积比计为药材药液=1-2:1-2。5.如权利要求1或2所述的栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法步骤3中静态吸附法进行活性炭净化处理是指活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至无醇味。6.如权利要求1或2所述的栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法步骤3中上样量为栀子药材活性炭=1:1.2，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时。7.如权利要求1或2所述的栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法所述步骤4上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，5倍柱体积30%乙醇以0.3倍柱体积/h的流速洗脱；洗脱后收集25-35%乙醇洗脱液。8.如权利要求1或2所述的栀子提取物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤1:取栀子药材，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至6(TC相对密度1.05;步骤2:加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置24h，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml;步骤3:采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味；上样量为栀子药材活性炭=i:1.2，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物；步骤4:量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味；将上述栀子提取物加水制成浓度为0.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以0.4倍柱体积/h的流速吸附，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。9.栀子提取物，其特征在于该栀子提取物由如下方法制成步骤1:取栀子药材，水煎煮提取2-4次，每次加6-30倍量的水，浓縮；步骤2:加入乙醇使药液含醇量达50%_80%，放置，抽滤，滤液回收乙醇，加水调节药液浓度以栀子原药材的重量与药液的体积比计为栀子药材药液=1-2:1-2;步骤3:采用静态吸附法进行活性炭净化处理；上样量以栀子原药材的重量与活性炭重量比计算为栀子药材活性炭=i:l-3，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附3-6小时，上柱，先用水洗，再用50%-80%乙醇洗脱，洗脱流速为0.6-1倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇至相对密度0.5-1.05，得栀子提取液A或干燥得栀子提取物B;步骤4:取大孔树脂，装柱；将上述栀子提取液A直接上样或提取物B加水制成浓度为0.03-0.lg/mL的药液后上样；上样体积为1-3倍柱体积，以0.2_1.0倍柱体积/小时的流速吸附，1-3倍柱体积水、1-3倍柱体积的3%-10%乙醇洗脱，3-8倍柱体积的20%-50%乙醇以0.2-0.5倍柱体积/小时的流速洗脱，收集20%_50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。10.如权利要求9所述的栀子提取物，其特征在于该栀子提取物由如下方法制成步骤1:取栀子药材，加10倍量的水，煎煮提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，浓縮至6(TC相对密度1.05;步骤2:加入95%乙醇使药液含醇量达70%，放置24h，抽滤，以3倍生药量70%乙醇溶液洗涤沉淀，滤液与洗液合并，回收乙醇至药液没有醇味，加水调节药液浓度为药材药液=1:l，即lg/ml;步骤3:采用静态吸附法进行活性炭纯化处理活性炭用乙醇回流法至紫外扫描没有吸收，用蒸馏水洗至含无醇味；上样量为栀子药材活性炭=1:1.2，将活性炭置药液中，搅拌，静态吸附4小时，上柱，先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，再改用20倍生药量的70%乙醇洗脱，洗脱流速为0.8倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，6(TC减压干燥得栀子提取物；步骤4:量取已处理好的H103型大孔树脂，装柱，水洗至无醇味；将上述栀子提取物加水制成浓度为O.07g/mL的药液，上样体积为2.5倍柱体积，以O.4倍柱体积/h的流速吸附，2倍柱体积水、2倍柱体积7%乙醇洗脱，30%乙醇5倍柱体积以0.3倍柱体积/h的流速洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。全文摘要本发明提供了一种栀子提取物制备方法，该方法采用活性炭联合大孔树脂分离方法，活性炭用量为1-3倍，先用水洗，再用50％-80％乙醇洗脱，洗脱流速为0.6-1倍生药量/小时，收集乙醇洗脱液，浓缩，上大孔树脂柱，上样体积为1-3倍柱体积，以0.2-1.0倍柱体积/小时的流速吸附，1-3倍柱体积水、1-3倍柱体积的3％-10％乙醇洗脱，3-8倍柱体积的20％-50％乙醇以0.2-0.5倍柱体积/小时的流速洗脱，收集20％-50％乙醇洗脱液。本发明提取效率高、成本低、适合工业化制备。文档编号A61K131/00GK101721516SQ20091021755公开日2010年6月9日申请日期2009年12月31日优先权日2009年12月31日发明者杜守颖申请人:杜守颖